李宇晴 姚燕婷 王雅倩 孫剛 賴鐘雄 李漢生

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.016

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.016

收稿日期：2022-09-12? 修回日期：2023-11-06

基金項(xiàng)目：2020年福建省科技廳自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2020J01377）；觀賞竹的規(guī)?；耘嘤N（B17000208）；2023年福建省科技特派員。

第一作者：李宇晴，本科生，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：3476155755@qq.com

通信作者：李漢生，博士，副教授，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：1456505560@qq.com

摘? 要? 筆者在關(guān)于鐵皮石斛miRNA組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)較多響應(yīng)藍(lán)激光的miRNA，挑選關(guān)鍵且差異表達(dá)的miR168進(jìn)行分子進(jìn)化特征及其響應(yīng)藍(lán)激光表達(dá)分析。經(jīng)對(duì)前體和成熟體分類統(tǒng)計(jì)、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、靶基因預(yù)測(cè)、啟動(dòng)子順示作用元件及響應(yīng)不同光質(zhì)表達(dá)等進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：miR168家族成員分布在40個(gè)植物物種中，前體和成熟體成員較少，其在植物中可能進(jìn)化得不夠完整；物種特異性是影響miR168前體進(jìn)化特性的重要因素，而序列保守性是影響成熟體進(jìn)化特性的主要因素；由3p臂上形成的miR168成熟體序列有較高特異性、5p臂形成的成熟體的序列保守性較高；Mfold和Rfam預(yù)測(cè)表明鐵皮石斛miR168莖序列的保守性高于環(huán)序列，前體發(fā)卡結(jié)構(gòu)較多，成熟體位置位于3p臂上，既包含莖序列也包含環(huán)序列；鐵皮石斛miR168a的啟動(dòng)子主要包括光、激素、生物和非生物脅迫響應(yīng)元件，可能通過(guò)這些順式元件在其響應(yīng)藍(lán)激光中起調(diào)控作用；鐵皮石斛響應(yīng)藍(lán)激光的靶基因主要包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B家族成員、乙酰輔酶 A 乙酰轉(zhuǎn)移酶等，主要參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)外界因素。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，鐵皮石斛miR168a與其靶基因gene-MA16_Dca006149、gene-MA16_Dca020995、gene-MA16_Dca017821參與藍(lán)激光對(duì)鐵皮石斛的影響。

關(guān)鍵詞? 鐵皮石斛；miR168；進(jìn)化特性；激光；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬草本藥用植物，具有生津、潤(rùn)肺、排毒，增強(qiáng)免疫力等功效［1］?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明鐵皮石斛的主要功能性代謝產(chǎn)物為多糖、黃酮類、聯(lián)芐類和生物堿等［2］。

研究人員已通過(guò)不同方法提高鐵皮石斛功能性代謝產(chǎn)物含量，而光調(diào)控是最有效方法之一。不同 LED 光照模式對(duì)鐵皮石斛原球莖多糖積累的研究中，發(fā)現(xiàn)紅藍(lán)混合光對(duì)多糖積累的促進(jìn)作用最為明顯，其中以紅光∶藍(lán)光=1∶3 的多糖產(chǎn)量最髙［3］。在不同光質(zhì)對(duì)鐵皮石斛的研究中發(fā)現(xiàn) 15 d內(nèi)單色藍(lán)光有利于生物堿含量增加，30 d內(nèi)單色黃光有利于生物堿含量增加，30 d后紅藍(lán)光比例為2∶3的處理更有利于生物堿含量增加［4］。

關(guān)于激光光源對(duì)植物功能性代謝產(chǎn)物的研究鮮有報(bào)道。激光是在發(fā)光機(jī)理上完全不同于普通光源，具有很好的單色性，不僅能有效解決普通光源存在問(wèn)題，而且可能對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有新的作用機(jī)制。大量研究發(fā)現(xiàn)，激光光源預(yù)處理種子可顯著提高多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝進(jìn)程。例如，當(dāng)使用 4.0×10-3J/（cm2·s）激光處理白羽扇豆和蠶豆后，120 h 后發(fā)現(xiàn)種子細(xì)胞中淀粉分解酶的活力值達(dá)到最大值，種子 IAA 含量提升，下胚軸伸長(zhǎng)加快，鮮重和根長(zhǎng)增加［5］。Gao等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，He-Ne 激光能夠加速植物生長(zhǎng)發(fā)育，可能因?yàn)橥ㄟ^(guò)激活植物細(xì)胞內(nèi)源一氧化氮（NO）信號(hào)分子和鈣信號(hào)的合成和釋放，進(jìn)而介導(dǎo)胞內(nèi)發(fā)生一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑而發(fā)生的。

筆者在關(guān)于鐵皮石斛組培苗響應(yīng)不同光質(zhì)（白光、藍(lán)光和藍(lán)激光）的miRNA組學(xué)（PRJCA006154）研究中發(fā)現(xiàn)較多響應(yīng)激光的miRNA，挑選關(guān)鍵且差異表達(dá)的miR168進(jìn)行分子進(jìn)化特征及其響應(yīng)藍(lán)激光表達(dá)分析。miRNA是一類內(nèi)源小分子非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度在? 19～25 nt。其不含開(kāi)放閱讀框，不能編碼蛋白質(zhì)，在動(dòng)植物體內(nèi)通過(guò)mRNA直接剪切或抑制功能蛋白翻譯負(fù)調(diào)控靶基因［7-8］。miR168為植物特有的長(zhǎng)約21 nt的miRNA家族，其在不同物種間具有高度的保守性［9］。miR168的功能在植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中起到重要作用，例如，擬南芥miR168a參與AGO1轉(zhuǎn)錄后基因沉默，當(dāng)AGO1在擬南芥中超表達(dá)時(shí)，即突變體AGO1不受 miR168a 調(diào)控，過(guò)量表達(dá)的AGO1會(huì)造成植株生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重缺陷；當(dāng)AGO1抑制表達(dá)時(shí)，miR168a將無(wú)法降解靶基因mRNA的功能，導(dǎo)致miR168a的降解［10］。miR168還能夠參與諸多植物的非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程。miR168b可能參與玉米植物響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)和甜楊植株響應(yīng)低溫脅迫反應(yīng)［11-12］。TEV （Tobacco etch virus，煙草腐蝕病毒）、CrTMV （Crucifer-infecting tobacco mosaic virus，煙草花葉病毒）等植物病毒可以誘導(dǎo)miR168 的表達(dá)水平升高［13］。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR168與植物光周期、干旱脅迫、ABA 誘導(dǎo)、低氮脅迫等都密切相關(guān)［14-17］。

綜上所述，植物miR168的功能具有多樣性，而有關(guān)鐵皮石斛miR168的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析鐵皮石斛和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)已登錄植物miR168家族的進(jìn)化特性差異，以期為鐵皮石斛miR168家族功能研究提供理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上還對(duì)鐵皮石斛miR168和靶基因在激光的表達(dá)分析，進(jìn)一步了解miR168在鐵皮石斛響應(yīng)藍(lán)激光過(guò)程中的作用。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料

所用組培苗為具有 3～4片真葉，葉寬約 2～3 mm，苗高約2 cm的鐵皮石斛。保證藍(lán)激光（450 nm）、藍(lán)光（450 nm）、白光、總光強(qiáng)［100 μmol/（m2·s）］、光照時(shí)間（12 h/d）、濕度55%～60%和溫度（25±2） ℃等相同的條件上，將鐵皮石斛組培苗置于光照培養(yǎng)箱處理60 d。鐵皮石斛繼代培養(yǎng)基配方為1/2MS+ +30.0 g/L蔗糖+ 6 g/L瓊脂+ 1 g/L活性炭+50 g/L香蕉泥（pH為5.8）。光照處理的培養(yǎng)基配方為1/2MS+ +30.0 g/L蔗糖+ 6 g/L瓊脂+ 1 g/L活性炭（pH為5.8）。現(xiàn)以白光為對(duì)照組，試驗(yàn)組為藍(lán)光、藍(lán)激光。對(duì)照組和處理組的植株經(jīng)液氮速凍保存于-80 ℃冰箱，用于核酸提取、高通量測(cè)序等測(cè)定。

1.2? 植物miR168家族成員的物種分布

通過(guò)miRbase最新數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.mirbase.org/）下載已登錄的miR168的前體和成熟體序列，獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana）、琴葉擬南芥（Arabidopsis lyrata）、油菜（Brassica napus）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、蕪菁（Brassica rapa）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、大豆（Glycine max）、豇豆（Vigna unguiculata）、大葉相思（Acacia auriculiformis）、木薯（Manihot esculenta）、蓖麻（Ricinus communis）、番茄（Solanum lycopersicum）等35個(gè)物種的61個(gè)miR168前體序列和48個(gè)miR168成熟體序列，了解miR168在不同物種之間的分布規(guī)律及其特征。

1.3? 植物miR168家族成員進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)MEGA 7.0軟件［18］且參照李漢生等［19］的方法，構(gòu)建植物miR168的前體和成熟體序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4? 植物miR168家族成員序列分析

通過(guò)DNAMAN 軟件比對(duì)植物miR168成熟體序列。

1.5? 植物miR168前體序列分析及其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)Rfam 12.0在線軟件［20］ （http：//rfam.xfam.org/）對(duì)植物miR168家族成員二級(jí)結(jié)構(gòu)保守性進(jìn)行分析。通過(guò)Mfold 3.5在線軟件［21］（http：//unafold.rna.albany.edu/？q=mfold）對(duì)植物miR168預(yù)測(cè)前體二級(jí)結(jié)構(gòu)及其分析成熟體? 位置。

1.6? 植物miR168家族成員的靶基因預(yù)測(cè)

植物miR168家族成員的靶基因預(yù)測(cè)和分析采用psRNATarget在線軟件（http：//plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/）［22］。

1.7? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

通過(guò)TriPure試劑盒（Invitrogen，中國(guó)）對(duì)激光處理的鐵皮石斛嫩葉進(jìn)行總RNA的提取。選取凝膠電泳顯示其完整性良好，且紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/280值為1.8～2.0的RNA備用。鐵皮石斛總RNA采用SYBR ExScriptTM（Takara，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄?；阼F皮石斛基因組［23］和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（PRJCA006154）的基礎(chǔ)上，通過(guò)Li等［24］描述的方法進(jìn)行相對(duì)miRNAs和靶基因的表達(dá)水平分析。miRNA的內(nèi)參為5.8 s rRNA，靶基因的內(nèi)參為ACTIN，相對(duì)表達(dá)水平的測(cè)定采用比較2-ΔΔCt方法。相關(guān)引物信息見(jiàn)? 表1。

1.8? 數(shù)據(jù)分析

鐵皮石斛miRNA和靶基因表達(dá)量結(jié)果至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用SPSS V 19.0單因素方差分析（ANOVA）的DTncan測(cè)試法，分析鐵皮石斛響應(yīng)不同光照處理的表達(dá)量。制圖采用GraphPad Prism 6.0軟件和Omic share在線? 軟件。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 植物miR168家族前體和成熟體分布

植物miR168家族成員分布情況見(jiàn)表2。miRBase最新數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)40個(gè)物種存在miR168，39個(gè)物種屬于被子植物，其中包括蘭科（1種）、葡萄科（1種）、茄科（2種）、薔薇科（3種）、蕓香科（3種）、豆科（5種）、十字花科（10種）等；僅1個(gè)物種為裸子植物，主要包括松科（1種）；被子植物的數(shù)量遠(yuǎn)多于裸子植物。不同植物miR168家族前體和成熟體數(shù)量也存在較大差異，其中被子植物的蕪菁成熟體最多為6個(gè)，被子植物的煙草前體最多為5個(gè)，以上兩種為分布最多最全的物種，推測(cè)miR168在植物中可能進(jìn)化得不夠完整。

miRBase已登錄植物miR168家族的86個(gè)前體和63個(gè)成熟體中，前體長(zhǎng)度分布范圍為86 nt～358 nt，成熟體長(zhǎng)度分布范圍在19 nt～? 24 nt，其長(zhǎng)度具有較大差異，推測(cè)植物miR168存在復(fù)雜的形成機(jī)制，而最重要的因素之一為物種特異性。擬南芥、琴葉擬南芥、蕪菁、玉米、番茄、毛果楊及鸚哥鳳梨的2個(gè)miR168前體，水稻、二穗短柄草、百脈根、野草莓、大麥、節(jié)節(jié)麥、甜橙及藍(lán)花耬斗菜的1個(gè)miR168前體都在3p和5p臂上形成成熟體；有25個(gè)miR168成熟體沒(méi)有區(qū)分3p或5p臂。本研究發(fā)現(xiàn)已登錄的植物miR168成員中有23條5p臂和24條3p臂上的成熟體? 序列。

2.2? 植物miR168家族成員前體及成熟體進(jìn)化特性

為了解植物miR168家族成員進(jìn)化特點(diǎn)，本研究通過(guò)MEGA 7.0軟件對(duì)植物miR168家族成員的86個(gè)前體和63個(gè)成熟體序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建（圖1和圖2）。

大部分植物miR168家族成員前體有著科內(nèi)物種聚集更近的現(xiàn)象，例如被子植物的十字花科、豆科、禾本科（圖1）。小部分植物miR168家族成員前體比較分散，分別位于不同的小分支上? （圖1）。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)松科植物歐洲云杉pad-miR168b和豆科大葉相思aaT-miR168單獨(dú)聚在一支，而pad-miR168a和菊科刺苞菜薊? cca-miR168a聚在一支，禾本科水稻osa-miR168b和毛茛科藍(lán)花耬斗菜aqc-miR168單獨(dú)聚在一支，而osa-miR168a單獨(dú)聚在一支，可能除物種親緣關(guān)系外，還有其他因素影響著miR168的進(jìn)化，或者這類miRNA存在不同功能（圖1）。因此，物? 種親緣關(guān)系是影響植物miR168家族成員前體進(jìn)化特性的重要因素之一，但是也存在其他影響? 因素。

根據(jù)進(jìn)化樹(shù)聚集性將植物miR168成熟體劃分為兩大枝，來(lái)自5p臂和3p臂的miR168-5p成熟體都分布聚在不同大枝上（圖2）。此外，聚類分析結(jié)果表明植物miR168家族成員的成熟體進(jìn)化特性與物種特異性存在緊密聯(lián)系。

2.3? 鐵皮石斛miR168前體和成熟體進(jìn)化分析

2.3.1? 鐵皮石斛miR168前體進(jìn)化分析? 為進(jìn)一步了解鐵皮石斛miR168的進(jìn)化特性相關(guān)規(guī)律，選取蘭科、豆科、十字花科、松科、禾本科的miR168前體和成熟體序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建（圖3和圖4）。

從圖3進(jìn)化樹(shù)分析可知，miR168前體序列分支較多，包括兩個(gè)較大的分支，兩大分支主要成員多為十字花科和豆科，但是物種聚集程度總體比較分散。鐵皮石斛miR168的前體單獨(dú)為一個(gè)分支，與蕪菁的bra-miR168a親緣關(guān)系最近。

2.3.2? 鐵皮石斛與其他4個(gè)物種miR168成熟體進(jìn)化分析? 從圖4進(jìn)化樹(shù)分析可知，植物miR168進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)蘭科、松科、禾本科、豆科、十字花科植物共計(jì)43個(gè)成熟體可分為4大分支，物種聚集程度比較集中。從上往下分別命名為第一到第四分支。不同物種的5p臂miR168主要分布于第一和第二個(gè)小分支；而3p臂miR168主要聚在第三和第四分支，鐵皮石斛miR168位于第四分支，與十字花科的ath-miR168b-3p、豆科的lja-miR168-3p親緣性很近。

2.4? 鐵皮石斛miR168成熟體序列分析

為了解植物miR168家族成員成熟體的分子特性，通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)植物miR168-3p成熟體、miR168-5p成熟體以及其他成熟體序列（去除3p、5p臂上的miR168成熟體）進(jìn)行多序列比對(duì)分析（圖5）。

從圖5-A分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有物種miR168-5p成員的序列的保守性都很高。從圖5-B可以看出，多數(shù)物種miR168-3p家族成員成熟體的序列保守性較高，少數(shù)保守性較低，例如，水稻的osa-miR168-3p和hvt-miR168-3p。

從圖5-C可以看出，將無(wú)區(qū)分3p和5p臂的植物miR168成熟體序列比對(duì)分析，多數(shù)植物miR168家族成員成熟體的序列保守性較高，除個(gè)別植物中若干個(gè)堿基存在差異，例如，亞麻薺cas-miR168、大葉相思aat-miR168、藍(lán)花耬斗菜aqc-miR168等。這類少數(shù)保守性低的成員分布在不同的門、目、科，無(wú)規(guī)律性可尋，導(dǎo)致序列特異性原因以及序列差異引起功能差異，還有待今后深入研究。結(jié)合圖2分析結(jié)果可見(jiàn)，序列保守性是影響成熟體進(jìn)化特性的重要因素。

2.5? 鐵皮石斛miR168二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

通過(guò)Rfam 12.0軟件進(jìn)行在線分析，進(jìn)一步探討植物miR168家族成員前體序列的保守程度（圖6）。鐵皮石斛miR168前體3p臂與5p臂上的序列保守性較為一致；miR168家族能夠形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且莖序列的保守性高于環(huán)? 序列。

2.6? 鐵皮石斛miR168前體二級(jí)莖狀結(jié)構(gòu)及生成成熟體特征分析

通過(guò)Mfold在線軟件預(yù)測(cè)植物miR168前體序列的二級(jí)莖狀結(jié)構(gòu)，主要包括被子植物的擬南芥、煙草、鐵皮石斛及裸子植物的歐洲云杉，如圖7所示。植物miR168前體可以形成典型的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，每個(gè)前體可形成8～13個(gè)不等的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中鐵皮石斛miR168發(fā)卡結(jié)構(gòu)較多。其結(jié)構(gòu)最小自由能（△G）分別為ath-miR168a-3p? （-281.16 kJ/mol）、ath-miR168a-5p （-187.02? kJ/mol）、ath-miR168b-3p（-281.16 kJ/mol）、nta-miR168c-3p（-463.38 kJ/mol）、pab-miR168a-3p（-242.25 kJ/mol）、do-miR168a-3p（-406.64? kJ/mol）。植物miR168成熟體形成的位置在3p臂或5p臂上，成熟體序列有的只包含莖序列，有的包含部分環(huán)序列。而鐵皮石斛miR168成熟體位置位于5p臂上。

2.7? 植物miR168家族成員的靶基因預(yù)測(cè)與分析

為了解植物miR168家族成員的靶基因功能，挑選被子植物的鐵皮石斛、大豆、甘蔗、擬南芥、玉米、水稻的miR168家族成員成熟體共15條，包括miR168、miR168a、miR168b、成員以及不同成員的miR168-5p、miR168-3p預(yù)測(cè)靶基因功能，具體見(jiàn)表3。

從表3分析結(jié)果看出，miR168抑制靶基因的方式主要包括裂解和翻譯抑制。從靶基因的數(shù)量上來(lái)看，不同物種miR168的靶基因數(shù)在2至19個(gè)之間。同一物種不同miR168家族成員的靶基因可能完全相同，例如ath-miR168a-5p與ath-miR168b-5p、zma-miR168a-5p與zma-miR168b-5p的靶基因完全相同。此外，同物種同miR168成員不同臂上形成的成熟體的靶基因卻可能完全不同，如ath-miR168a-5p與ath-miR168a-3p、ath-miR168b-5p與ath-miR168b-3p、osa-miR168a-5p與osa-miR168a-3p、zma-miR168a-5p與zma-miR168a-3p、zma-miR168b-5p與zma-miR168b-3p的靶基因完全不同。從靶基因注釋來(lái)看，不同

物種miR168靶基因功能各不相同。擬南芥miR168靶基因注釋主要包括多核苷酸轉(zhuǎn)移酶（polyntcleotidyl transferase）、 SET 域的蛋白質(zhì)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白質(zhì)（SET-domain containing protein lysine methyltransferase family protein）。水稻miR168靶基因注釋主要包括含有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（protein kinase domain containing protein）、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白（retrotransposon protein）。鐵皮石斛miR168靶基因功能主要注釋包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B家族成員、細(xì)胞色素P450、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶III等，功能分別為防御機(jī)制，次級(jí)代謝物的生物合成，脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝，復(fù)制、重組和修復(fù)等。

2.8? 鐵皮石斛miR168啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析

基于do-miR168a序列，結(jié)合鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)BDGP 軟件預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，從而確定啟動(dòng)子序列。通過(guò)plantcare在線軟件預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子順式作用元件，結(jié)果如圖8所示。

鐵皮石斛do-miR168a的啟動(dòng)順式作用元件中，最多為光響應(yīng)元件（16個(gè)）；其次激素響應(yīng)元件：茉莉酸甲酯（10個(gè)）、脫落酸（2個(gè)）、生長(zhǎng)素（1個(gè)）；還含有厭氧誘導(dǎo)元件（2個(gè)）、類黃酮生物合成調(diào)控元件（1個(gè)）、干旱誘導(dǎo)元件（1個(gè)）、玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)元件（1個(gè)）、種子特異性調(diào)控元件（1個(gè)）。推測(cè)do-miR168在植物響應(yīng)光照、激素時(shí)起到重要調(diào)控作用。

2.9? 鐵皮石斛miR168響應(yīng)激光的表達(dá)分析

鐵皮石斛miR168a和靶基因在白光、藍(lán)光、藍(lán)激光的qPCR結(jié)果如圖9所示。所選3個(gè)靶基因gene-MA16_Dca017821 （乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，putative acetyl-CoA acetyltransferase）、gene-MA16_Dca006149 （ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B家族，ABC transporter B family member 20）、gene-MA16_Dca020995 （細(xì)胞色素P450，cytochrome P450 89A2-like）在鐵皮石斛生長(zhǎng)和代謝中具有重要調(diào)控作用。do-miR168a與gene-MA16_Dca01782的表達(dá)量趨勢(shì)在藍(lán)激光處理未呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，推測(cè)靶基因gene-MA16_Dca017821可能存在其他miRNA同時(shí)調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)靶基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。do-miR168a與靶基因gene-MA16_Dca006149、gene-MA16_Dca020995的表達(dá)量趨勢(shì)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，表明do-miR168a可能通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因，參與到藍(lán)激光調(diào)控鐵皮石斛的生長(zhǎng)和代謝。以上調(diào)控機(jī)制有待遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 ?討 論

3.1? 鐵皮石斛miR168家族成員的進(jìn)化特點(diǎn)

本研究表明，植物miR168家族的40個(gè)物種中包含86個(gè)前體序列和63個(gè)成熟體序列，其多數(shù)為被子植物，少數(shù)為裸子植物。植物miR168家族成員成熟體序列比對(duì)分析結(jié)果再次證明了miR168家族在植物中的保守性。

從鐵皮石斛miR168家族成員前體和成熟體的進(jìn)化特性分析結(jié)果看出，其前體進(jìn)化特性影響的重要因素為物種親緣性，而物種親緣性對(duì)成熟體進(jìn)化特性影響不大［25］。從鐵皮石斛miR168家族成員成熟體進(jìn)化樹(shù)分析看出，5p臂或3p臂形成的成熟體都分別聚在一支。本研究還發(fā)現(xiàn)

5P臂的成熟體序列保守性較高，這與王艷芳等［26］（miR171）、劉煒?gòu)O等［27］（miR172）和翟俊淼等［28］（miR396）研究結(jié)果相同，表明植物miR168成熟體聚類的主要因素為序列的保守性，其次才是物種差異性。以上觀點(diǎn)符合科內(nèi)物種的miR168（圖3）以及種間物種miR168（圖4）家族成員的前體和成熟體的進(jìn)化特性分析結(jié)果，同時(shí)植物miR168成員成熟體序列分析結(jié)果也證明該觀點(diǎn)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)植物miR168前體進(jìn)化樹(shù)分支較多，可以推測(cè)miR168家族來(lái)源于古老的祖先，并且經(jīng)歷了串聯(lián)重復(fù)、片段重復(fù)、反向重復(fù)、隨機(jī)起源等進(jìn)化方式的更迭以及長(zhǎng)期復(fù)雜的進(jìn)化演變過(guò)程［19，29］。

植物miR168的86個(gè)前體序列長(zhǎng)度具有較大差異，長(zhǎng)度范圍在86 nt～358 nt，物種特異性明顯。而植物miR168的63個(gè)成熟體序列長(zhǎng)度范圍為在19 nt～24 nt，具有較強(qiáng)的保守性，表明其在進(jìn)化上特異性和保守性并存。miR168家族成員成熟體序列分析結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了miR168家族成員的保守性。植物miR168的63個(gè)成熟體分布在39個(gè)物種中，分別有23條來(lái)自5p臂和24條來(lái)自3p臂。二級(jí)結(jié)構(gòu)保守性分析結(jié)果表明5p臂形成的成熟體的保守性高于3p臂。此外，相關(guān)研究已經(jīng)表明序列差異會(huì)引起基因功能差異，而植物miR168同一物種同一成員不同臂上形成的成熟體是否會(huì)引起功能不同還需進(jìn)一步研究［30］。

3.2? 鐵皮石斛miR168在藍(lán)激光響應(yīng)過(guò)程中的作用

通過(guò)植物miR168家族成員靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明（表3），不同物種miR168的靶基因數(shù)量不同（2～19個(gè)）；同物種不同miR168家族成員的靶基因完全或者部分相同；同物種相同miR168家族成員不同臂上形成的成熟體的靶基因卻可能完全不同。以上結(jié)論可能是因?yàn)?p臂上的序列特異性較強(qiáng)，5p臂上的序列具有較高保守性，而miRNA與靶基因需要高度互補(bǔ)才可以對(duì)靶基因起到作用。序列特異的3p臂上形成的miR168成熟體與序列較保守的5p臂上形成的成熟體很可能引起靶基因的差異。

植物miR168具有多種生物學(xué)功能，不同物種miR168靶基因的功能不同，其靶基因注釋主要包括多核苷酸轉(zhuǎn)移酶、SET 域的蛋白質(zhì)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白質(zhì)、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)等，以上基因作為miR168的保守性靶基因，已被廣泛研究報(bào)道［9］。而通過(guò)psRNATarget在線軟件預(yù)測(cè)鐵皮石斛miR168a的靶基因，發(fā)現(xiàn)靶基因gene-MA16_Dca006149，gene-MA16_Dca020995，gene-MA16_Dca017821注釋分別為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B家族、細(xì)胞色素P450、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B家族是一類廣泛存在于植物中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在植物次生代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與積累、激素運(yùn)輸、脂質(zhì)代謝、抵抗生物和非生物脅迫等方面起著關(guān)鍵作用［31］。本研究發(fā)現(xiàn)光照培養(yǎng)下，鐵皮石斛miR168a與靶基因gene-MA16_Dca006149的表達(dá)量基本呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)miR168可能通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因參與藍(lán)激光對(duì)鐵皮石斛細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。

細(xì)胞色素P450廣泛參與植物次生代謝調(diào)控，主要涉及植物激素、苯丙素類、生物堿類、萜類、甾醇類、脂肪酸、色素等的合成及代謝［32-33］。鐵皮石斛響應(yīng)激光過(guò)程中，此類次生代謝產(chǎn)物的提升，有利于提高應(yīng)對(duì)外界因素的能力。推測(cè)鐵皮石斛miR168可能通過(guò)調(diào)控靶基因gene-MA16_Dca020995參與藍(lán)激光對(duì)鐵皮石斛的影響。

乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶主要功能為脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝調(diào)控，而植物角質(zhì)層是形成于表皮細(xì)胞壁外表面的脂質(zhì)保水層。角質(zhì)層通常由角質(zhì)和蠟質(zhì)組成，角質(zhì)是角質(zhì)層的主要結(jié)構(gòu)成分，其主要組分是聚酯，蠟質(zhì)成分主要是黃酮類、三萜類物質(zhì)以及極長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸及其衍生物。相關(guān)研究表明植物表皮蠟質(zhì)對(duì)紫外線輻射和可見(jiàn)光都有反射作用，且蠟質(zhì)對(duì)紫外線輻射的反射作用比可見(jiàn)光更強(qiáng)［34］。研究人員利用玉米的蠟質(zhì)缺失突變體研究葉片表皮蠟質(zhì)在抵抗紫外線的作用。與正常植株相比，表皮蠟質(zhì)缺失的玉米受紫外線傷害程度明顯更大，植物表型和遺傳均受到顯著影響。與表皮蠟質(zhì)較少的葉片相比，蠟質(zhì)較多的葉片能夠吸收更多紫外線，降低植物體的損傷［35］。推測(cè)鐵皮石斛靶基因gene-MA16_Dca017821除miR168調(diào)控外，可能還有其他miRNA共同調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)靶基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，參與到藍(lán)激光對(duì)鐵皮石斛的影響。

4? 結(jié)? 論

本研究分析了鐵皮石斛與其他植物miR168家族進(jìn)化特性差異，為其功能研究提供理論基礎(chǔ)。分析了鐵皮石斛miR168和靶基因在激光的表達(dá)分析，深入了解miR168在鐵皮石斛響應(yīng)藍(lán)激光過(guò)程中的作用，推測(cè)鐵皮石斛miR168a可能通過(guò)靶基因gene-MA16_Dca006149、gene-MA16_Dca020995參與到藍(lán)激光對(duì)鐵皮石斛的影響；而靶基因gene-MA16_Dca017821除miR168調(diào)控外，可能還有其他miRNA共同調(diào)控，從而參與到藍(lán)激光對(duì)鐵皮石斛的影響。關(guān)于這種調(diào)控機(jī)制有待遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Molecular Evolution Characteristics of miR168 in? Dendrobium? officinale and Analysis of? Its Response to Blue Laser Expression

LI?? Yuqing1，YAO Yanting1，WANG Yaqian1，SUN Gang1，LAI Zhongxiong2? and? LI Hansheng1

（1.Fujian Provincial Key Laboratory of Bamboo Resources Development and Utilization，Sanming University，

Sanming? Fujian? 365004，China; 2.Institute of Horticultural Biotechnology，F(xiàn)ujian Agriculture

and Forestry University，F(xiàn)uzhou? 350002，China）

Abstract? Based on the analysis of miRNAs omics in Dendrobium officinale （D.officinale），the differentially expressed miR168 were selected for further analysis and verification，as it plays a key role in regulating pathway? influencing the effect of laser on D.officinale.We conducted an analysis of the distribution statistics of precursor and mature sequences，construction of phylogenetic trees，sequence alignment，prediction of the target genes，promoter sequence element，as well as expression patterns in response to laser for miR168 in this study.These results showed that the miR168 family members were widely distributed in 40 plant species，with fewer precursors and mature members，suggesting incomplete evolution in plants.Species specificity was an important factor affecting the evolution of miR168 precursors，while sequence conservation was the main factor affecting the evolution of miR168 matures.The members of miR168-3p were quite specific，whereas the members of miR168-5p were conserved.Mfold and Rfam predicted that the stem sequence of D.officinale miR168 was more conservative than the loop sequence.The precursor sequences had more hairpin structures，and the mature sequences was located on the 3p arm （contains both stem and loop sequences）.Both of them contain many light-responsive elements，hormone-responsive elements，and biotic and abiotic stress responsive elements，which might play a regulatory role in the longan response to blue light through these cis-elements.In D.officinale，targets responding to laser both contain ABC transporter B family member 20 and acetyl-CoA acetyltransferase，which are? involved in plant growth，and development，and response to external factors.Real-time quantitative PCR showed that miR168a and its target genes （gene-MA16_Dca006149，gene-MA16_Dca020995，gene-MA16_Dca017821） participate in the effects of blue laser on D.officinale.

Key words? Dendrobium officinale Kimura et Migo; miR168; Evolution; Laser; Real-time quantitative PCR

Received ??2022-09-12??? Returned? 2023-11-06

Foundation item? The Natural Science Foundation of Fujian Province（No.2020J01377）；Scale Cultivation and Breeding of Ornamental Bamboo（No.B17000208）；the 2023 Special Envoy of Science and Technology of Fujian Province.

First author? LI? Yuqing，undergraduate student.Research area：plant biotechnology.E-mail：3476155755@qq.com

Corresponding?? author? LI Hansheng，doctor，associate professor.Research area：plant biotechnology.E-mail：1456505560@qq.com

（責(zé)任編輯：郭柏壽? Responsible editor：GUO Baishou）