關(guān)鍵詞：保幼激素環(huán)氧水解酶；蜂巢小甲蟲；保幼激素；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)

中圖分類號：S895：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）06-0103-10

蜂巢小甲蟲（Aethina tumida Murray）屬鞘翅目（Coleopera）露尾甲科（Nitdiuldae），是蜂群的重要寄生性害蟲，源自于非洲南部的撒哈拉以南地區(qū)，目前已擴(kuò)散至除南極洲之外的所有大陸，我國2017年首次報道該蟲的危害。蜂巢小甲蟲不僅對養(yǎng)蜂業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還可入侵熊蜂、無刺蜂和獨(dú)棲蜂，從而破壞當(dāng)?shù)氐奈锓N生態(tài)平衡。蜂巢小甲蟲具有對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、傳播途徑廣、寄主種類多、飛行距離遠(yuǎn)、繁殖率高、成蟲壽命長等特點(diǎn)。據(jù)報道，一只雌蟲可存活6個月之久，一生可產(chǎn)卵2000多粒，幼蟲和成蟲均可取食蜂蜜、花粉、蜜蜂幼蟲和蛹，幾個月后幾只成蟲即可繁殖出成千上萬只，并再次侵染爆發(fā)成災(zāi)。

蜂巢小甲蟲作為蜜蜂的六大重要病原體之一（World Organisation for Animal Health，2019），侵害早期很難被察覺，目前無行之有效的預(yù)防手段，其一旦進(jìn)入我國適宜生長的地區(qū)，很容易爆發(fā)成災(zāi)，破壞生態(tài)平衡的同時也將對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)蜂業(yè)造成嚴(yán)重影響。保幼激素（juvenile hormone，JH）是一類倍半萜類激素，在昆蟲發(fā)育和生殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，干擾其合成和代謝一直被認(rèn)為是一種很有前途的替代化學(xué)殺蟲劑的方法，并且對非目標(biāo)生物毒性低。研究表明，保幼激素降解過程主要涉及3種酶：保幼激素環(huán)氧水解酶JHEH、保幼激素脂酶（juvenile hormone esterase，JHE）和保幼激素二醇激酶（juvenile hormone di-olkinase，JHDK），其中JHEH屬于微粒體環(huán)氧化物水解酶家族（microsomal epoxide hydrolase family），與組織中膜結(jié)合，催化血淋巴中JH和保幼激素酸（juvenile hormone acid，JHa），使之降解為沒有活性的保幼激素二醇（juvenile hormone di-ol，JHd）和保幼激素酸二醇（juvenile hormone acid diol，JHad），并中斷咽側(cè)體JH的合成。目前，JHEH基因在多種昆蟲中進(jìn)行了較為深入的研究，如褐飛虱Nilaparvata lugens、煙芽夜蛾Heliothis virescens、家蠶Bombyx mori、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、赤擬谷盜Tribolum castane-um、橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis、意大利蜜蜂Apis mellifera、黏蟲Mythimna separata等。不同昆蟲中JHEH基因的數(shù)量不同，其功能也不盡相同。但鞘翅目昆蟲中，關(guān)于蜂巢小甲蟲保幼激素及保幼激素降解酶的研究鮮有報道。

本課題組前期對蜂巢小甲蟲卵巢組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，注釋到5條JHEH基因，其中JHEH1和JHEH1-2的表達(dá)在不同發(fā)育時期卵巢中差異顯著。本研究對蜂巢小甲蟲保幼激素環(huán)氧水解酶基因JHEH1和JHEH1-2進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并檢測其在成蟲不同發(fā)育時期的卵巢等不同組織中的表達(dá)模式，為后續(xù)深入研究JHEH基因?qū)Ψ涑残〖紫x生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

蜂巢小甲蟲采自海南省?？谑协傊锌h吊羅山鄉(xiāng)區(qū)域內(nèi)中華蜜蜂蜂場（109°57′36″E，18°47′48″N），帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)于人工氣候箱和暗室的養(yǎng)蟲籠內(nèi)。參照Neumann的方法飼養(yǎng)，略有改動。蜂巢小甲蟲成蟲和幼蟲均用自制蜂糧（含蜂蜜、花粉、豆粉、奶粉）飼喂。飼養(yǎng)條件為：溫度（27±1）℃，相對濕度（60±10）%，未成熟幼蟲黑暗飼養(yǎng)約2周；老熟幼蟲人工放進(jìn)高溫滅菌的沙土（含水量8%～10%）內(nèi)化蛹；蛹及羽化后的成蟲每日自然光照14 h飼養(yǎng)；成蟲產(chǎn)卵孵化為幼蟲后，再黑暗飼養(yǎng)，周而復(fù)始。

1.2主要試劑和儀器

Eastep@ Super Total RNA Extraction Kit為美國Promega公司產(chǎn)品；TRUEscript RT Master Mix（OneStep gDNA Removal）試劑盒、2×SYBRrGreen qPCR Mix（Low ROX）試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。主要儀器為體視顯微鏡（卡爾蔡司光學(xué)（中國）有限公司）、湘儀高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、微量紫外可見分光光度計（ND2000C，Thermo Fisher Sci-entific）、實(shí)時熒光定量PCR儀（Applied Biosys-tems，Thermo Fisher Scientific）等。

1.3蜂巢小甲蟲JHEH基因生物信息學(xué)分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中獲取基因編碼的氨基酸序列，使用InterPro工具（https：//www.ebi.ac.uk/in-terro/）進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，在NCBI上利用在線軟件BLAST（https：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對，使用MEGA 7.0軟件對氨基酸序列進(jìn)行分析并使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。對目的基因編碼產(chǎn)物，使用ProtParam工具（ht-tp：//protparam.net/index.html）預(yù)測其理化性質(zhì)，使用ProtScale工具（https：//www.expasy.org/re-sources/protscale）分析疏水性，使用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域，使用SignaIP 5.0（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析信號肽，使用SOPMA工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=npsa_sopma.html）預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL工具（https：//swissmodel.ex-pasy.org/）預(yù)測三級結(jié)構(gòu)。

1.4蜂巢小甲蟲JHEH基因表達(dá)分析

1.4.1組織樣品采集 分別取未出土（0d）和出土后1日齡、2日齡、3日齡（1、2、3 d）的蜂巢小甲蟲雌成蟲若干，置于硅膠盤上，放置于體視顯微鏡下解剖出卵巢，用PBS緩沖液沖洗并除去多余的脂肪、氣管等組織后用于試驗(yàn)。同日齡的5個蜂巢小甲蟲卵巢作為1個生物學(xué)重復(fù)，設(shè)3個重復(fù)。此外，取早期未出土成蟲60只，分別收集頭、胸、足和脂肪體樣本。每個組織收集3組，每組為一個生物學(xué)重復(fù)（20只），設(shè)3個重復(fù)。所有樣品放人液氮中速凍后置于-80℃冰箱中備用。

1.4.2總RNA提取與cDNA第一鏈合成 將組織樣品用液氮充分研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入1.5 mL無RNA酶離心管中稱量，加入裂解液反復(fù)吹打直至無明顯塊狀組織。根據(jù)Eastep Super總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性?？俁NA提取完成后統(tǒng)一稀釋至100ng/μL。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TRUEscript RTMaster Mix（OneStep gDNA Removal）操作說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于-20℃作為qPCR模板備用。

1.4.3引物設(shè)計及RT-qPCR擴(kuò)增 以蜂巢小甲蟲的甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參基因，引物來源于文獻(xiàn)，JHEH1和JHEH1-2基因的引物設(shè)計和合成均由上海生工生物工程有限公司完成（表1）。以1.4.2合成的cDNA為模板，采用2×SYBR Green qPCR Mix（Low ROX）試劑盒，在熒光定量PCR儀QuantStudio 6 Flex real-time qPCR System通過2步法進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL：2× SYBR qPCR Mix （Low ROX） 10μL，DNA模板1μL，上、下游引物各0.4μL，ddH₂O8.2μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2 min;95℃15s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，生物學(xué)重復(fù)3次。

1.5數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用2^-△△Ct法計算蜂巢小甲蟲成蟲不同發(fā)育時期及組織JHEH1和JHEHl-2的相對表達(dá)量，采用單因素方差分析（ANOVA）的LSD法進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)（Plt;0.05），使用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因序列分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取蜂巢小甲蟲JHEH1（LOC109597754）和JHEH1-2（LOC109605925）基因的開放閱讀框（ORF），預(yù)測可編碼的蛋白質(zhì)分別含有460個和461個氨基酸（圖1）。使用InterPro數(shù)據(jù)庫對兩個蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，表明JHEH1蛋白和JHEHl-2蛋白均屬于環(huán)氧化物水解酶（epoxide hydrolase）蛋白家族，且均具有環(huán)氧化物水解酶的N端結(jié)構(gòu)域，分子功能預(yù)測前者具備乙醚水解酶活性，后者具有催化活性。

2.2蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別搜索與蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2存在同源關(guān)系的同源蛋白序列，獲得了包括光肩星天牛（Anpoploppora glabrip-ennis）、內(nèi)華達(dá)白蟻（Zootermopsis nevadensis）等昆蟲的氨基酸序列，并采用Bootstrap法重復(fù)1000次以構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。JHEH1的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖2A）顯示，蜂巢小甲蟲與光肩星天牛被歸為一支，并進(jìn)一步與內(nèi)華達(dá)白蟻聚為一類。JHEHl-2的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖2B）表明，蜂巢小甲蟲的JHEH1-2較為保守，與檉柳葉甲（Di-orhabda sublineata）、紅柳粗角螢葉甲（Diorhabda carinulata）、異色瓢蟲（Harmonia axyndis）、七星瓢蟲（Coccinella septempunctata）、米象（Sitophilus oryzae）聚為一支。

2.3蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEHl-2基因生物信息學(xué)分析

2.3.1編碼蛋白理化性質(zhì)分析 使用ProtParam對兩個基因所編碼蛋白產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，JHEH1編碼460個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為52 kDa，預(yù)測的理論等電點(diǎn)（pI）為8.06，蛋白分子式為C₂₄₂₅ H₃₇₀₇ N₆₀₃O₆₆₀S₁₆，原子總數(shù)為7411。JHEH1編碼的總氨基酸序列中，亮氨酸（Leu）占比最高，為10.2%，其次為纈氨酸（Val），占比為7.6%，其中吡咯賴氨酸（Pyl）和硒代半胱氨酸（Sec）的含量為零。帶有負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）為46個，帶有正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）為48個。該蛋白N端推測為蛋氨酸（Met），推測其半衰期為30 h（哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外）。其不穩(wěn)定系數(shù)為32.69，脂肪系數(shù)為91.93，總平均親水系數(shù)為-0.109。

JHEH1-2編碼461個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為52 kDa，預(yù)測的理論等電點(diǎn)（pI）為8.70，蛋白分子式為C₂₄₂₀ H₃₇₁₃N₅₉₇O₆₅₆S₁₅，原子總數(shù)為7401。JHEH1-2編碼的總氨基酸序列中，亮氨酸（Leu）占比最高為10.6%，其次為賴氨酸（Val）占比為8.5%，其中吡咯賴氨酸（Pyl）和硒代半胱氨酸（Sec）的含量為零。帶有負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）為43個，帶有正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）為48個。該蛋白N端推測為蛋氨酸（Met），推測其半衰期為30 h（哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外）。其不穩(wěn)定系數(shù)為31.85，脂肪系數(shù)為93.64，總平均親水系數(shù)為-0.070。

2.3.2編碼蛋白疏水性分析 使用ProtScale工具對JHEH1和JHEH1-2這兩個基因所編碼蛋白的親疏水性進(jìn)行分析。結(jié)果（圖3）表明，JHEH1和JHEH1-2編碼的蛋白分別約含有4個和5個高峰（疏水區(qū)），N端疏水性均較強(qiáng)，需要結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測以進(jìn)行下一步分析。

2.3.3編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析 使用TMHMM 2.0工具對JHEH1和JHEH1-2進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析。結(jié)果（圖4）顯示，JHEH1編碼蛋白的1—27位氨基酸位于跨膜結(jié)構(gòu)域的可能性較低，且預(yù)測全部氮基酸均位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)（圖4A）；JHEH1-2編碼蛋白的1—6位氨基酸位點(diǎn)位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)，7—29位氨基酸位于跨膜區(qū)，其余30—461位氨基酸定位于細(xì)胞外側(cè)，與疏水性預(yù)測的結(jié)果高度吻合。

2.3.4編碼蛋白信號肽預(yù)測與分析 使用Sig-naIP 5.0軟件對JHEH1和JHEH1-2基因編碼蛋白的信號肽進(jìn)行分析。結(jié)果（圖5）顯示，JHEH1編碼蛋白有信號肽的概率為86.563%，信號肽切割位點(diǎn)為22—23位，可能性為52.080%，預(yù)測的信號肽序列為MGKCGTFYVAIVALLAYGGYRA（圖SA）；JHEH1-2編碼蛋白有信號肽的概率為51.493%，信號肽切割位點(diǎn)為25-26位，可能性為30.760%，預(yù)測的信號肽序列為MGKVCGLFLL-GIFATLAFVGFKTYS（圖5B）。

2.3.5編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 使用SOPMA工具對JHEH1和JHEH1-2編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測與分析。結(jié)果（圖6）顯示，JHEH1二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占41.52%，延伸鏈占12.17%，無規(guī)則卷曲占43.48%，β轉(zhuǎn)角占2.83%。JHEH1-2二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占41.87%，延伸鏈占12.58%，無規(guī)則卷曲占42.30%，β轉(zhuǎn)角占3.25%。

2.3.6編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用SWISS-MODEL工具對JHEH1和JHEH1-2基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。以光肩星天牛保幼激素環(huán)氧水解酶為模板建模，結(jié)果（圖7）顯示JHEH1序列與其同源性為63.76%，JHEH1-2序列與其同源性為62.09%。

2.4蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因表達(dá)分析

蜂巢小甲蟲成蟲不同時期卵巢的RT-qPCR結(jié)果（圖8）顯示，JHEH1和JHEH1-2均在未出土成蟲的卵巢中處于高水平表達(dá)狀態(tài)。從1日齡到3日齡，兩基因表達(dá)量均呈先下降再上升然后再下降的趨勢。JHEH1表達(dá)量在1日齡最低，JHEH1-2表達(dá)量在3日齡時最低。

蜂巢小甲蟲未出土成蟲不同組織的RT-qPCR結(jié)果（圖9）顯示，兩個基因在5種組織中的表達(dá)有較大差異。JHEH1在卵巢和脂肪體中的相對表達(dá)量顯著高于頭、胸和足（Plt;0.05）；JHEH1-2在卵巢中的相對表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（Plt;0.05）。

3討論與結(jié)論

JH在昆蟲的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，參與昆蟲變態(tài)、發(fā)育、繁殖和滯育等生命活動。JHEH是JH的重要水解酶之一，通過影響昆蟲體內(nèi)的JH滴度調(diào)控昆蟲的蛻皮、繁殖、滯育和變態(tài)。本研究對蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因序列的分析表明，它們均屬于環(huán)氧化物水解酶蛋白家族，具有JHEH的典型結(jié)構(gòu)特征，并且N-末端包含氨基酸組成的疏水性信號肽序列，編碼的蛋白疏水性較強(qiáng)，與已報道的昆蟲JHEH特征基本一致。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，蜂巢小甲蟲JHEH1與同為鞘翅目的光肩星天牛JHEH聚為一支，說明鞘翅目內(nèi)的昆蟲親緣關(guān)系較近。蜂巢小甲蟲JHEH1編碼的氨基酸全部位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)，JHEH1-2編碼的氨基酸跨膜分布，與疏水性預(yù)測的結(jié)果高度吻合。蜂巢小甲蟲JHEH蛋白的二級結(jié)構(gòu)為α螺旋/β折疊型，以α螺旋為主。用SWISS-MODEL同源建模的方法構(gòu)建蜂巢小甲蟲JHEH的模擬三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2與光肩星天牛JHEH的結(jié)構(gòu)相似度較高。

JHEH基因在昆蟲體內(nèi)的表達(dá)具有明顯的組織特異性。現(xiàn)有研究表明，馬鈴薯甲蟲LdJHEH1和LdJHEH2在所有檢測組織中均有表達(dá)，且Ld-JHEH1在胸肌、前腸、中腸、后腸高表達(dá)，LdJHEH2在腦-心-偶體復(fù)合體、后腸、馬氏管、雌性卵巢內(nèi)高表達(dá)；橘小實(shí)蠅BdJHEH2在脂肪體內(nèi)高表達(dá)，而BdJHEH3在馬氏管內(nèi)高表達(dá)；黏蟲Bd-JHEH2在體壁和脂肪體中高表達(dá)；九香蟲AcJHEH在脂肪體中表達(dá)量最高，其次為卵巢、精巢和中腸。本研究中，蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2在成蟲卵巢內(nèi)的表達(dá)量均顯著高于頭、胸和足，此外，JHEH1還在脂肪體中較高表達(dá)，JHEH1-2在胸部較高表達(dá)。這些結(jié)果表明，JHEH在昆蟲不同組織中均有降解JH的作用，其發(fā)揮作用的大小取決于物種的種類。此外，JHEH基因的表達(dá)量在昆蟲不同發(fā)育階段也存在顯著差異，如JHEH在意大利蝗卵早期發(fā)育階段呈現(xiàn)出先快速上升再下降的趨勢；九香蟲4～5齡若蟲體內(nèi)JHEH表達(dá)量較高，而七星瓢蟲JHEH在初羽化的成蟲體內(nèi)表達(dá)量較高。JHEH1和JHEH2在馬鈴薯甲蟲幼蟲各個齡期也均有表達(dá)，在4齡幼蟲孵化后32h表達(dá)量達(dá)到峰值。本研究中，JHEH1和JHEH1-2均在早期未出土成蟲的卵巢中表達(dá)量較高，推斷它們在蜂巢小甲蟲卵巢的發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用。

JH是昆蟲特有的性激素，在調(diào)節(jié)發(fā)育和生殖成熟的生理過程中發(fā)揮重要作用，干擾其生物合成或降解過程中重要基因的功能，一直都被認(rèn)為是代替非靶向化學(xué)殺蟲劑的有效策略。JHEH是降解JH的關(guān)鍵酶，抑制其活性可以改變昆蟲體內(nèi)JH滴度，從而擾亂昆蟲的生理。當(dāng)前已有粉紋夜蛾和煙草天蛾JHEH特異性酶抑制劑的報道?；谶@些抑制劑對昆蟲內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響，可將它們作為潛在的可用于農(nóng)業(yè)的新型殺蟲劑。

綜上所述，通過生物信息學(xué)分析，蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因具有降解JH的功能，且在早期未出土成蟲卵巢內(nèi)高表達(dá)，說明JHEH在蜂巢小甲蟲的生殖過程中發(fā)揮重要作用。該研究可為進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)研究蜂巢小甲蟲JHEH的功能奠定基礎(chǔ)，為蜂巢小甲蟲綠色防控產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。