關(guān)鍵詞數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)；微流控芯片；疾病診斷；單分子檢測；評述

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和需求的多樣化，基于聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR）的各種衍生核酸分析技術(shù)應(yīng)運而生[1]。1992年，Higuchi等[2]提出實時熒光定量PCR（QuantitativePCR，qPCR）的設(shè)想。qPCR通過在PCR反應(yīng)體系中引入熒光探針，可實現(xiàn)未知模板的相對定量分析，廣泛應(yīng)用于臨床診斷和食品檢測等領(lǐng)域。但qPCR定量分析的準確性會受到樣品擴增效率和抑制劑等因素的影響，并且需要采用核酸標準品繪制標準曲線，無法實現(xiàn)核酸的絕對定量分析，制約了其臨床應(yīng)用[3]。1999年，Vogelstein和Kinzler[4]首次提出數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（Digitalpolymerasechainreaction，dPCR）的概念，將傳統(tǒng)PCR的指數(shù)信號轉(zhuǎn)換成線性的數(shù)字信號，可不依賴標準曲線而直接實現(xiàn)目標分子的絕對定量分析。因dPCR具有單分子擴增、可直接絕對定量分析和對抑制劑耐受性高等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤液體活檢和感染性疾病診斷等領(lǐng)域[5-8]。本文綜述了近年來dPCR技術(shù)在檢測精度、多重檢測和檢測速度等方面的研究進展，介紹了dPCR在腫瘤和感染性疾病檢測等領(lǐng)域的相關(guān)研究，討論了其作為一種新興核酸分子檢測技術(shù)在實際應(yīng)用中的技術(shù)挑戰(zhàn)；最后，結(jié)合臨床實際應(yīng)用深入討論了dPCR技術(shù)在發(fā)展過程中面臨的難題與機遇，并探討了其未來發(fā)展前景。

1dPCR技術(shù)概述

1.1dPCR技術(shù)原理

dPCR是基于單分子擴增和反應(yīng)體系分割的一種核酸分子絕對定量分析技術(shù)。該技術(shù)將包含有引物、緩沖液、酶和模板DNA分子等組分的PCR反應(yīng)體系隨機分配到許多微小且獨立的反應(yīng)單元中進行反應(yīng)，每個反應(yīng)單元中可能包含有零個、一個或多個模板DNA分子[9-10]。PCR循環(huán)結(jié)束后，對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集，根據(jù)熒光信號的有無將反應(yīng)單元分別定義為陽性和陰性，最終根據(jù)泊松分布原理及陽性反應(yīng)單元的個數(shù)和比例，計算出模板DNA分子的起始拷貝數(shù)（圖1）[11]。

當原始體系中模板DNA濃度較低，并且獨立反應(yīng)單元數(shù)量足夠多時，每個反應(yīng)單元理論上最多只含有一個模板DNA分子，通過統(tǒng)計陽性反應(yīng)單元數(shù)目即可確定DNA模板的起始拷貝數(shù)。但是，在通常情況下，部分反應(yīng)單元中可能含有兩個或兩個以上DNA分子，在統(tǒng)計分析時需通過泊松分布概率公式對結(jié)果進行校正[12-13]：

其中，P（x=k）是確定觀察到k目標分子的概率，λ是每個反應(yīng)單元內(nèi)平均目標分子數(shù)，k是反應(yīng)單元內(nèi)實際存在的目標分子數(shù)。由于dPCR技術(shù)采用終點熒光檢測和分子計數(shù)方式計算目的序列的拷貝數(shù)，無需建立標準曲線和計算反應(yīng)的擴增效率等繁瑣步驟，較傳統(tǒng)PCR技術(shù)具有更高的準確性和靈敏度。

1.2dPCR技術(shù)的分類

根據(jù)樣品分散方式不同，dPCR可分為兩大類。（1）基于油包水技術(shù)的微滴式dPCR（DropletdPCR，ddPCR） ddPCR是將PCR反應(yīng)體系在微滴發(fā)生芯片中制備成數(shù)以萬計的油包水微滴（nL～pL），DNA模板在單個微滴中進行PCR擴增，最終通過微滴讀數(shù)儀讀取每個液滴內(nèi)的終點熒光并進行分析，得出初始拷貝數(shù)[14]。ddPCR反應(yīng)體系較微孔板和微陣列系統(tǒng)更簡單、體積更小，易實現(xiàn)高通量檢測，是目前較理想的dPCR技術(shù)平臺[15]。（2）基于微流控芯片的芯片式dPCR（ChipdPCR，cdPCR） cdPCR主要采用超高密度親疏水微孔芯片和微陣列芯片作為反應(yīng)載體，依靠微流控通道實現(xiàn)樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測[16]。cdPCR各個反應(yīng)單元之間的影響較小，避免了交叉污染，具有更高的穩(wěn)定性，尤其適用于單拷貝變異檢測、稀有異常序列檢測和測序等[17]。但是，cdPCR成本高、檢測通量低、操作較繁瑣。

2dPCR技術(shù)發(fā)展歷程

自dPCR技術(shù)提出至今，研究人員在檢測精度、多重檢測和檢測速度等關(guān)鍵問題上進行了系列技術(shù)更新迭代（圖2）。首先，檢測精度主要與樣品分散和讀取方式等因素有關(guān)，其中，樣品分散方式占主導(dǎo)作用，包括反應(yīng)單元數(shù)量與體積等。從最早期的96或384單元，到如今已經(jīng)將微反應(yīng)體系縮小至納升或皮升級別，樣品高效均勻分散，顯著提升了檢測精度。例如，目前廣泛應(yīng)用的Bio-radQX200dPCR系統(tǒng)利用流動聚焦結(jié)構(gòu)可將樣品分散為約20000個大小均一的納升級微滴。相較于傳統(tǒng)方法，流動聚焦法受力更均勻，微滴尺寸均一性更好，進而將dPCR技術(shù)的靈敏度提升至單拷貝水平，為基因突變和單細胞分析等領(lǐng)域的研究提供了高效、可靠的技術(shù)平臺。但是，該平臺的流動聚焦結(jié)構(gòu)需要精確控制分散相和連續(xù)相的流速。近年來，階梯乳化技術(shù)已成為一種可靠的樣品分散技術(shù)，可借助界面張力驅(qū)動微滴生成，不涉及剪切力的作用，所以微滴的大小與分散相和連續(xù)相的流速無關(guān)，確保微滴更均勻[18]。Nie等[19]采用階梯乳化技術(shù)開發(fā)了基于高通量微流控芯片的dPCR技術(shù)，可同時驅(qū)動8個通道生成液滴，并在U形腔室中自組裝成單層液滴陣列，每個腔室可容納約10000個體積為0.35nL的微滴。將該技術(shù)應(yīng)用于HER2拷貝數(shù)變異分析，其平行檢測結(jié)果與商用dPCR平臺的結(jié)果一致。最近，賽默飛世爾公司推出的AppliedBiosystemsTMQuantStudioTMAbsoluteQTMdPCR系統(tǒng)采用微流體陣列技術(shù)，可在20480個納米級微孔中生成95%以上有效反應(yīng)微滴，最大限度地減少每次反應(yīng)的樣本損失，顯著提高了檢測精度。dPCR的信號讀取是影響檢測精度的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當微液滴直徑介于10～100μm之間，并且陽性與陰性微液滴之間的熒光信號對比度偏低時，傳統(tǒng)的熒光檢測技術(shù)難以分辨。Zhu等[20]采用準共聚焦式熒光流式技術(shù)構(gòu)建了新型微液滴讀取儀，極大地提高了陽性與陰性微滴間的信號對比度，顯著提升了檢測精度，相對誤差小于5%。此外，采用顯微圖像檢測法進行熒光采集，液滴破裂概率更低，精度更高。但是，受限于龐大的液滴數(shù)量與熒光強度異質(zhì)性，當面臨多靶標檢測時，常規(guī)圖像檢測技術(shù)難以實現(xiàn)精準計數(shù)。李珊珊等[21]選擇提取微液滴灰度值提高陽性微液滴與陰性微液滴的信號強度，并采用數(shù)字信號處理技術(shù)對原始圖像進行降噪，提高圖像對比度，進而顯著提高了dPCR的檢測精確性。

隨著實驗室中測試數(shù)量及指標日益增多，多靶標檢測成為未來的主要發(fā)展趨勢?；赿PCR的多重檢測可通過增加熒光通道數(shù)量或改變引物及探針濃度實現(xiàn)[22]。Bai等[23]開發(fā)了自吸分液式dPCR芯片，并利用3種熒光染料（FAM、HEX和Cy5）標記的分子信標實現(xiàn)了對3種長鏈非編碼RNA的同步檢測。除此之外，商業(yè)化的QX600ddPCR系統(tǒng)通過配置六色熒光（FAM、HEX、Cy5、Cy5.5、ATTO590和ROX）檢測通道，其單孔可定量分析12個靶標，極大地拓展了dPCR技術(shù)在多重基因檢測領(lǐng)域的應(yīng)用空間。雖然增加熒光通道可提升檢測靶標的數(shù)量，但同時也增加了體系的復(fù)雜性和儀器成本；此外，熒光通道間存在潛在干擾，難以實現(xiàn)高階的多重檢測。考慮到體系設(shè)計的可控性，通過引物更換及探針比例調(diào)整，有望進一步為多靶標分析提供可選方案。Zhong等[24]通過改變探針濃度，僅需利用兩種熒光即可構(gòu)建脊髓萎縮癥的五重檢測體系，成功實現(xiàn)了對20例患者樣本中3個基因（SMN1、SMN2和BCKDHA）的突變拷貝數(shù)以及單核苷酸突變（c.815Agt;G，SMN1）的檢測。然而，該方法未解決反應(yīng)體系復(fù)雜、擴增引物相互干擾的難題。由于dPCR是通過終點反應(yīng)結(jié)果進行信號采集，這使其可在熒光信號、熒光強度和檢測區(qū)域等多個維度有所區(qū)別，開發(fā)新的多重檢測方法、簡化反應(yīng)體系并提高檢測穩(wěn)定性，將是促進多重dPCR廣泛應(yīng)用的有效手段。

在檢測速度方面，dPCR需要讀取數(shù)以萬計的反應(yīng)單元的熒光才能實現(xiàn)絕對定量分析，這使其檢測速度顯著慢于常規(guī)檢測技術(shù)。早期的dPCR系統(tǒng)采用光電倍增管等圖像處理策略，一次只能處理一個反應(yīng)單元，不適合于高通量定量檢測。近年來，隨著激光誘導(dǎo)熒光細胞術(shù)和三維成像等技術(shù)的引入，dPCR在檢測速度方面得到極大改進，顯著提升了其臨床疾病診斷性能。Zhu等[20]將激光誘導(dǎo)熒光細胞術(shù)與微流控芯片相結(jié)合，開發(fā)了一種新型液滴讀取器，該方法可以實現(xiàn)每秒數(shù)百到數(shù)千液滴的熒光信號分析，極大地提高了檢測效率。此外，Liao等[25]開發(fā)了一種三維成像策略，用于在試管中原位掃描微液滴。該策略在擴增反應(yīng)完成后，采用旋轉(zhuǎn)掃描方式讀取液滴，并用高速相機捕獲其平面熒光圖像，等效于對整個微液滴平面的掃描過程。得益于100幀/秒的快速采集速率，該技術(shù)可在6s內(nèi)完成整管的高速掃描，在保證準確性的前提下大大提高了檢測速度。

3dPCR技術(shù)在疾病檢測中的應(yīng)用

3.1dPCR在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用

組織活檢是目前癌癥診斷的金標準，但其具有侵入性，易增加患者的感染幾率[26]。液體活檢是一種通過微創(chuàng)手段獲得患者體液，檢測循環(huán)腫瘤DNA（CirculatingtumorDNA，ctDNA）和循環(huán)腫瘤細胞等標志物的新型癌癥診斷技術(shù)[27]。然而，這些分子在體液中的濃度極低，傳統(tǒng)檢測技術(shù)難以檢出。近年來，具有更高靈敏度和準確性的dPCR技術(shù)在腫瘤液體活檢中展示出巨大潛力。

ctDNA是液體活檢中應(yīng)用最廣泛的分析指標。但是，ctDNA在不同患者體內(nèi)的含量和核酸多態(tài)性差異很大，常規(guī)技術(shù)難以直接檢測血漿中的腫瘤特異性基因突變。dPCR技術(shù)因具有能夠從復(fù)雜背景中檢測低豐度靶標的能力，在腫瘤基因突變檢測中得到了廣泛應(yīng)用。Wu等[28]開發(fā)了一種基于dPCR技術(shù)的自供電雙向分區(qū)微流控芯片，采用嵌入式微孔布置，增加了微孔數(shù)量，可直接檢測非小細胞肺癌患者血漿中EGFR突變。臨床樣本檢測結(jié)果表明，該芯片對L858R突變的敏感性為85.71%，特異性為94.44%，對T790M突變的敏感性為100%，特異性為86.96%。盡管該方法實現(xiàn)了血漿中低豐度EGFR突變的準確定量分析，同時在其它單核苷酸突變基因的分子診斷和治療監(jiān)測中具有一定的應(yīng)用潛力，但其靈敏度仍有提升空間。進一步，Xiang等[29]將侵入反應(yīng)引入dPCR體系，由于侵入反應(yīng)在單堿基識別方面具有高度特異性，因此在一個反應(yīng)單元中允許大量野生型DNA與突變DNA分子共存，靈敏度較傳統(tǒng)dPCR技術(shù)提高了1000倍。臨床樣本檢測結(jié)果顯示，該方法對非小細胞肺癌患者血漿中的EGFR突變檢測結(jié)果與第二代測序結(jié)果一致。同時，由于擴增引物和侵入探針的可編程性，該方法可實現(xiàn)多種基因突變檢測。

隨著癌癥生物標志物測試數(shù)量及指標越來越多，多重檢測的重要性與必要性越來越突出。為了優(yōu)化檢測方法，Yin等[30]設(shè)計了一種多通道單色熒光自引dPCR芯片，具有6個檢測區(qū)域，可利用自吸將特定的反應(yīng)混合物預(yù)先引入到某個檢測區(qū)域，實現(xiàn)在同一個dPCR芯片中同時檢測5種EGFR突變（圖3A）。Yu等[31]通過結(jié)合基于振幅/比率的多重檢測技術(shù)，開發(fā)了新型多重dPCR分析方法，只需進行3次反應(yīng)即可檢測KRAS、MRAS、BRAF和PIK3CA基因中至少69種最常見的熱點突變。該技術(shù)具有快速的周轉(zhuǎn)時間和較低的成本，可在樣本量有限的情況下篩查突變和篩選關(guān)鍵預(yù)后生物標志物。以ctDNA為代表的液體活檢作為dPCR的重要應(yīng)用領(lǐng)域，其精確性受到了廣泛認可。但是，由于液體活檢需要處理毫升級的血液和復(fù)雜的下游分析，罕見突變的集成化液體活檢的重要性與必要性不言而喻。為此，Geng等[32]研發(fā)了一種集成液滴dPCR（IntegrateddropletdigitalPCR，IddPCR）微型裝置，設(shè)計了一系列試劑混合結(jié)構(gòu)，包括宏、中、微混合器，以便根據(jù)試劑體積選擇不同的混合器，通過流體動力學(xué)參數(shù)和器件結(jié)構(gòu)尺寸確定系統(tǒng)的微尺度閥值，打破了傳統(tǒng)dPCR微器件設(shè)計對設(shè)備的依賴（圖3B）。該方法可實現(xiàn)以“樣本-結(jié)果”的輸出模式從血漿中檢測出罕見的T790M突變，為液體活檢的自動化提供了解決方案。

dPCR技術(shù)具有高敏感性和高精密度，在液體活檢方面具有其它技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢。dPCR整合液體活檢技術(shù)為癌癥檢測提供了準確、高效、安全的平臺。然而，dPCR在腫瘤臨床檢驗中的廣泛應(yīng)用仍存在挑戰(zhàn)，例如，目前商業(yè)化的dPCR平臺不成熟、沒有標準化的檢測方法和數(shù)據(jù)處理方式等，仍需進行深入的臨床研究和驗證。

3.2dPCR在感染性疾病檢測中的應(yīng)用

感染性疾病是威脅人類健康的主要疾病，根據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)，感染性疾病死亡人數(shù)占全球死亡總?cè)藬?shù)的28%[33]。病原體的快速、特異和靈敏檢測是治療感染性疾病的關(guān)鍵。然而，傳統(tǒng)病原體核酸檢測方法存在耗時長、靈敏度難以達到臨床需求等缺點，在臨床應(yīng)用中受到一定限制[34]。近年來，單分子檢測技術(shù)極大地推動了病原體檢測的發(fā)展，其中，dPCR憑借其可絕對定量分析、高靈敏度、高特異性等特點，在感染性疾病檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

3.2.1病毒檢測

病毒是造成全球范圍內(nèi)感染性疾病發(fā)病率和死亡率居高不下的最主要病原體。目前病毒檢測常用的方法主要是通過免疫學(xué)方法檢測其蛋白質(zhì)或通過分子生物學(xué)方法檢測其特定核酸序列[35]。dPCR作為新興的痕量核酸分子技術(shù)，具有靈敏度高、耐受性強、可絕對定量分析等優(yōu)點，在新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）、BK病毒、人類免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）和乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）定量檢測中廣泛應(yīng)用[34]。Sun等[36]采用濕法蝕刻工藝和硅-玻璃鍵合，設(shè)計了一種基于腔室的dPCR芯片，并通過模擬流體力學(xué)優(yōu)化了芯片的結(jié)構(gòu)，確保樣品在微室中的均勻性和獨立性。利用該芯片檢測了不同濃度的SARS-CoV-2病毒ORF1ab基因，檢出限可低至10copy/μL，顯著優(yōu)于qPCR（圖4）。但該方法檢測分析時間較長，難以在資源有限地區(qū)實現(xiàn)快速便攜的新冠病毒檢測?；诖?，Yin等[37]結(jié)合ddPCR和快速PCR技術(shù)，實現(xiàn)快速定量檢測SARS-CoV-2。該方法單次PCR熱循環(huán)周期僅需7s，可在115s內(nèi)檢測出陽性信號，總運行時間小于5min。臨床樣本檢測結(jié)果顯示，該方法與qPCR一致性較好，在COVID-19現(xiàn)場即時檢測中擁有巨大應(yīng)用潛力。

BK病毒屬于人類多瘤病毒中的一個亞型，其感染引發(fā)的相關(guān)性腎病是導(dǎo)致腎移植失敗的重要原因[38]。BK病毒檢測主要依賴于組織活檢，患者依從性較低。為了優(yōu)化檢測方法，Xu等[39]開發(fā)了一種便攜式集成dPCR系統(tǒng)，可直接從尿液樣本定量分析BK病毒。該系統(tǒng)帶有自分區(qū)滑動芯片微流控裝置，利用具有交替深度和寬度的微通道進行流體操作，并與熱控制和熒光成像模塊集成，可在2h內(nèi)完成“一步法”檢測，線性范圍為3.0×104～1.5×108copy/mL，為床旁檢測和病毒感染監(jiān)測提供了方法學(xué)參考。

除上述病毒外，dPCR在HIV和HBV感染診斷中也得到了廣泛應(yīng)用。Strain等[40]分別用ddPCR和qPCR對外周血樣本中的總HIVDNA含量進行測定。結(jié)果表明，在模板拷貝數(shù)較低時，dPCR的檢測精度是qPCR的20倍以上，顯著提升了HIV檢測的靈敏度。Huang等[41]首次采用ddPCR對肝癌病人FFPE樣本中的HBV拷貝數(shù)進行檢測，并研究了肝癌分級與病毒DNA含量之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，ddPCR的檢測準確率可達100%，檢測范圍達到1.1～175.5copy/μL。與血清學(xué)分析法相比，dPCR可實現(xiàn)單分子水平的核酸定量分析，有望在臨床上實現(xiàn)慢性肝炎患者組織樣本的檢測及抗病毒的療效評估。

3.2.2細菌檢測

細菌是眾多疾病的病原體，可通過多種途徑廣泛傳播，威脅人類健康，因此，細菌的快速檢測和鑒定對于公共衛(wèi)生和醫(yī)療保健具有重要意義。傳統(tǒng)的細菌檢測技術(shù)基于培養(yǎng)分離和生化鑒定，通常需要較長時間（幾天甚至幾周），而且在目標含量低、檢測基質(zhì)復(fù)雜的情況下，檢測結(jié)果會有明顯偏差[42-43]。利用dPCR技術(shù)高靈敏度的特點，Abram等[44]研發(fā)出一步法血滴dPCR檢測和高通量3D粒子計數(shù)系統(tǒng)，可直接從全血標本中進行細菌鑒定和抗生素敏感分析（圖5），檢出限達到10CFU/mL，較qPCR低1個數(shù)量級，并且檢測時間少于1h，該方法在靶向檢測革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中的抗生素耐藥基因方面具有巨大應(yīng)用潛力。Tao等[45]構(gòu)建了數(shù)字化環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，以此替代傳統(tǒng)PCR擴增，實現(xiàn)了對低濃度牛結(jié)核分枝桿菌的精確定量分析，靈敏度達到14CFU/mL，并整合了樣品前處理步驟，建立了牛奶中牛結(jié)核分枝桿菌高效全流程檢測方案，具有良好的特異性和準確性，為環(huán)境和生理樣本中各種病原體的定量分析和分子檢測提供了檢測平臺，為食品安全檢測提供了參考。

除上述細菌感染外，dPCR在大腸桿菌和副溶血弧菌的感染診斷中也得到了廣泛應(yīng)用。由于單純的DNA擴增難以區(qū)分死菌和活菌，易造成假陽性結(jié)果。Pan等[46]利用疊氮溴化丙錠預(yù)先去除死菌DNA，構(gòu)建基于dPCR的大腸桿菌O157∶H7絕對定量檢測技術(shù)，檢出限低至5copy/μL。此外，Lei等[47]報道了一種多重dPCR方法，通過引物及探針的合理設(shè)計，實現(xiàn)了副溶血弧菌TLH、TDH、URER和ORF8基因的同時檢測，檢出限為39CFU/mL，靈敏度與傳統(tǒng)平板計數(shù)法一致。該研究開發(fā)的基于4重dPCR的副溶血弧菌檢測方法大大促進了不同血清型的檢測，為檢測更多目的基因提供了方法學(xué)參考。

從基因表達研究到各種靶點的絕對定量分析，dPCR在靈敏度、特異性、可重復(fù)性和檢出限等方面優(yōu)于許多其它分子診斷技術(shù)。當對拷貝數(shù)較低的靶點進行定量檢測時，dPCR因具有單拷貝級的靈敏度，較常規(guī)分子診斷平臺更可靠，在各類感染性疾病診斷領(lǐng)域具有無可比擬的優(yōu)勢。目前，檢測核酸的dPCR技術(shù)種類繁多且各有特點，但用于其它多種小分子檢測的dPCR方法仍然較少，有待進一步開發(fā)。

3.3dPCR在其它疾病檢測中的應(yīng)用

除上述疾病外，dPCR也被用于耳聾基因檢測和產(chǎn)前診斷。2018年，Wang等[48]建立了一種基于咽拭子的液滴dPCR方法，實現(xiàn)了8個耳聾相關(guān)基因突變的無創(chuàng)檢測，特異性為100%，動態(tài)檢測范圍為101～105copy/μL，可以準確量化m.1494Cgt;T和m.1555Agt;G兩個異質(zhì)性率低至1%的突變位點，有望成為一種具有競爭力和應(yīng)用前景的基因篩選方法。

第二代測序技術(shù)是產(chǎn)前診斷21-三體綜合征的常用方法，但其成本較高，步驟繁瑣，限制了其臨床應(yīng)用?；诖?，Xu等[49]通過dPCR定量檢測母親血漿cfDNA中21號染色體數(shù)量增加的部分，提出了新型21-三體綜合征檢測方法。以21號染色體和1號染色體上的重復(fù)片段作為dPCR檢測目標，在母體cfDNA中成功檢出低至10%的21-三體綜合征胎兒cfDNA。在產(chǎn)前診斷中，dPCR技術(shù)因靈敏度高的優(yōu)勢，顯示出重要的臨床意義和應(yīng)用價值。雖然目前dPCR在檢測準確性方面還有待提高，但隨著應(yīng)用研究的逐步深入和完善，其適用范圍會進一步擴展，靈敏度和準確性也會逐步提高。

4結(jié)論與展望

相較于傳統(tǒng)核酸定量分析方法，dPCR不依賴于標準曲線和參照樣本，可直接定量檢測目標序列的原始拷貝數(shù)，具有靈敏度高、特異性強等顯著優(yōu)勢。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，dPCR體系因其可在短時間內(nèi)分割成大量獨立反應(yīng)單元，極大地降低了反應(yīng)成本，進一步拓展了dPCR在癌癥的精準診療和感染性疾病檢測中的應(yīng)用[50-51]。

dPCR作為一項新興技術(shù)，仍存在許多亟待解決的問題：（1）分散技術(shù)尚不成熟，微滴制備過程中存在樣本消耗的問題，影響檢測結(jié)果的準確性；（2）dPCR的信號輸出及結(jié)果分析需要大型儀器設(shè)備輔助，限制了其在資源有限地區(qū)的廣泛應(yīng)用；（3）多靶標檢測困難，熒光基團間存在相互干擾，難以在單個微滴中實現(xiàn)多種靶標的同步檢測；（4）缺乏國家或行業(yè)統(tǒng)一標準，商品化的dPCR平臺繁多，平臺內(nèi)部暫無可比性，影響檢測結(jié)果的說服力[52-53]?？傊?，dPCR技術(shù)在疾病檢測領(lǐng)域中仍然有較大的提升空間。

近年來，隨著基于階梯乳化的樣品分散法、三維成像技術(shù)和電化學(xué)生物傳感器等前沿技術(shù)不斷與dPCR技術(shù)結(jié)合，有望提高dPCR技術(shù)的靈敏度和精確性。數(shù)據(jù)處理模塊以及整個設(shè)備都可由成本較低的微型計算機控制，使用自主開發(fā)的圖像處理和輸出量化軟件也可為dPCR技術(shù)的發(fā)展提供新思路。這些新的dPCR技術(shù)或?qū)⑦M一步推進人們對疾病快速、敏感和準確的認識。