摘要以核酸為檢測(cè)靶向的分子診斷方法是傳染性病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但將其應(yīng)用于便攜化或現(xiàn)場(chǎng)快速診斷時(shí)仍存在多種限制和挑戰(zhàn)，如特異性差、操作繁瑣和便攜化難等。規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白（Cas）-熒光檢測(cè)方法有望大幅提升核酸識(shí)別的特異性和信噪比。本研究開發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）-CRISPR/Cas-便攜化灰度讀取儀檢測(cè)系統(tǒng)。在CRISPR RNA （crRNA）存在下，利用CRISPR/Cas12a 體系實(shí)現(xiàn)了對(duì)自主設(shè)計(jì)的甲型和乙型流感病毒核酸LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系的精準(zhǔn)熒光檢測(cè)，驗(yàn)證了CRISPR/Cas 體系的高選擇性和通用性。配套自主開發(fā)的便攜化灰度讀取儀，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的低成本采集和高可靠性可視化判讀，檢測(cè)結(jié)束后直接輸出樣品的陽/陰性結(jié)果。利用本檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行了分析，驗(yàn)證了其可靠性和實(shí)用性，證明了本系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)流感病毒的高靈敏、高特異性便攜化分析。

關(guān)鍵詞等溫?cái)U(kuò)增；CRISPR-Cas；熒光；便攜化檢測(cè)；流行性病原；灰度讀取儀

快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)流行性病原體是治療傳染性疾病和流行病的關(guān)鍵。2019 年底爆發(fā)的新型冠狀病毒感染大流行對(duì)全球的公共衛(wèi)生安全造成了重大威脅[1]，也反映出對(duì)病原體便攜化檢測(cè)乃至現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢驗(yàn)（Point-of-care testing， POCT）的迫切需求。世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的POCT 診斷應(yīng)具備價(jià)格合理、敏感性高、特異性強(qiáng)、易于使用、快速、穩(wěn)健以及可供最終用戶使用（ASSURED）等特性[2]。然而，目前能夠完全滿足這些要求的病原體核酸檢測(cè)產(chǎn)品依然十分匱乏，尚需對(duì)檢測(cè)原理、技術(shù)和儀器等進(jìn)行綜合創(chuàng)新和改進(jìn)。聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）是核酸檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，但具有耗時(shí)、需要復(fù)雜的熱循環(huán)儀設(shè)備和成本高等不足，難以脫離實(shí)驗(yàn)室環(huán)境[3]。相比之下，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）[4]、重組酶擴(kuò)增（RPA）[5]和核酸依賴性擴(kuò)增（NASBA）[6]等技術(shù)能夠在恒定溫度下完成核酸擴(kuò)增，不需要苛刻和復(fù)雜的儀器運(yùn)行條件，更具備便攜化潛力和條件[7]。其中， LAMP 是最具優(yōu)勢(shì)和競(jìng)爭(zhēng)力的等溫?cái)U(kuò)增方法之一，通過1 種聚合酶和4～6 個(gè)引物即可在1 h 內(nèi)將低至單分子水平的DNA 模板擴(kuò)增109～1010 倍，達(dá)到可檢出水平[4， 8]。然而，由于LAMP 的擴(kuò)增產(chǎn)物是長(zhǎng)度不一、形態(tài)復(fù)雜的花椰菜結(jié)構(gòu)，因此可用于檢測(cè)的方法十分有限，最常用且高效的方法是熒光染料嵌插法和比濁法。熒光染料嵌插法是將小分子染料非特異性地嵌插到擴(kuò)增后的雙鏈DNA 中，產(chǎn)生熒光增強(qiáng)效果；比濁法是將擴(kuò)增后產(chǎn)生的焦磷酸根與二價(jià)金屬離子絡(luò)合，產(chǎn)生肉眼可見的沉淀。這兩種常用的檢測(cè)方法均缺少序列選擇性，因此無法識(shí)別干擾核酸或隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)生的副產(chǎn)物，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[9-10]。此性能缺陷也普遍存在于其它等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法中，嚴(yán)重限制了同類方法的實(shí)用化和推廣，這是實(shí)現(xiàn)便攜化檢測(cè)和POCT 需要解決的首要問題。

近年來，基于規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白（CRISPR/Cas）系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)為解決上述難題提供了方法學(xué)基礎(chǔ)[11-14]， Cas9、Cas12a、Cas12b 和Cas13a 等不同酶具有不同的靶向選擇性和切割CRISPR RNA 能力，能夠提供廣泛且靈活的檢測(cè)方式[15-18]。以CRISPR/Cas12a 體系為例，其檢測(cè)基本原理是通過CRISPR RNA（crRNA）高選擇性地識(shí)別與之序列互補(bǔ)的DNA 形成雙鏈，進(jìn)而激活Cas12a 的無差別催化切割活性，將兩端帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的單鏈DNA 切斷，使體系的熒光強(qiáng)度增加[19]。該策略既提高了特異性，又可實(shí)現(xiàn)二次信號(hào)放大，產(chǎn)生高信噪比信號(hào)，已廣泛用于檢測(cè)RPA 的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物[20]。近期，有研究者利用CRISPR/Cas12a 識(shí)別LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)非洲豬瘟（ASFV）和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）等病原基因的高選擇性熒光檢測(cè)[21-22]，但是該方法對(duì)其它病原基因或LAMP 產(chǎn)物序列的普適性尚有待驗(yàn)證。此外，通過簡(jiǎn)單的LED 光激發(fā)后即可通過肉眼直接觀測(cè)到檢測(cè)前后的熒光強(qiáng)度變化[23]，然而，與其它比色或比濁方式類似，該方法也易產(chǎn)生肉眼誤差。通過手機(jī)拍照，再利用專業(yè)繪圖軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理，有望獲得更可靠的判讀甚至是定量檢測(cè)效果[20]，但不同手機(jī)和圖像處理軟件所獲得的結(jié)果通常不盡相同。

因此，為進(jìn)一步驗(yàn)證CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)LAMP 檢測(cè)的通用性，并提高熒光信號(hào)的便攜化檢測(cè)能力和判讀可靠性，本研究開發(fā)了LAMP-CRISPR/Cas-便攜化熒光灰度讀取儀檢測(cè)系統(tǒng)。針對(duì)甲型和乙型流感病毒核酸序列設(shè)計(jì)了高效的LAMP 擴(kuò)增引物和特異性crRNA。研究結(jié)果表明， crRNA 存在下， CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)能夠?qū)AMP 產(chǎn)物進(jìn)行高靈敏、高選擇性熒光檢測(cè)，可檢出低至1 copy/μL 的靶核酸。檢測(cè)流程和結(jié)果判讀可在自主開發(fā)的便攜化熒光灰度讀取儀中完成。此儀器采用四核ARM Cortex-A7 和8 GB 高速EMMC 存儲(chǔ)，支持TF 外擴(kuò)32 GB SD 卡存儲(chǔ)，硬件配備5 寸液晶觸摸屏、具備PID 算法控制的可控加熱模塊以及特定可控光照單元和采集攝像模塊。本系統(tǒng)能夠提供0～95 ℃范圍內(nèi)的可控樣本孵育和LED 熒光激發(fā)，直接將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為圖像，并通過算法對(duì)灰度進(jìn)行定量分析，在檢測(cè)程序運(yùn)行完成后自動(dòng)顯示陰性或陽性結(jié)果，無需人為判斷，大幅提升了判讀效率和檢測(cè)準(zhǔn)確性。同時(shí)，此儀器支持藍(lán)牙與手機(jī)APP 無線連接，可通過手機(jī)調(diào)整本地儀器軟件算法參數(shù)及編輯檢測(cè)運(yùn)行程序，因此適用于各類采用其它溫區(qū)和流程的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，可滿足更廣泛的應(yīng)用需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DS-11 FX+分光光度計(jì)（美國DeNovix 公司）；羅氏lightcycler96 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀（荷蘭羅氏生物科技有限公司）；Biometra PCR 儀（德國耶拿分析儀器股份公司）。

核酸熒光染料（美國Biotum 公司）；Lba Cas12a（Cpf1）核酸酶、熱啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、Bst 2.0 DNA 聚合酶、10×r2.1 緩沖液、10×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液和dNTPs（美國New England Biolabs 公司）；甜菜堿（默克生物公司）；病毒RNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）。本研究中的引物序列、crRNA 以及熒光探針均由上海生工有限公司合成，序列如表1 所示。病毒實(shí)際樣本由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院標(biāo)本庫提供，經(jīng)吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)： 2019071606）。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，購于上海生工有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司超純水儀制備）。

實(shí)驗(yàn)中所使用的緩沖液包括：1×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH 8.8）， 10 mmol/L（NH4）2SO4， 50 mmol/L KCl， 4 mmol/L MgSO4， 0.1% Tween 20）；1×r 2.1 緩沖液（50 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L MgCl2， 100 μg/mL 重組白蛋白， pH 7.9）；1×TE 緩沖液（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA， pH 8.0）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染料法實(shí)時(shí)LAMP擴(kuò)增檢測(cè)模擬靶標(biāo)基因

以不同濃度目標(biāo)基因的質(zhì)粒作為檢測(cè)模板，進(jìn)行染料法實(shí)時(shí)LAMP 檢測(cè)。預(yù)先配制引物混合液，其中內(nèi)引物FIP/BIP 濃度為20 μmol/L， 外引物F3/B3 濃度為5 μmol/L。LAMP 等溫?cái)U(kuò)增體系包括10 μL 不同濃度模板、3 μL 引物混合液、2 μL 10 mmol/L dNTPs、0.5 μL 100 mmol/L MgSO4 和5 μL 5 mol/L 甜菜堿，采用1×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液稀釋，總體積為23 μL。將上述反應(yīng)液在95 ℃變性2 min 后，迅速降溫至4 ℃， 靜置5 min（此過程并非必須，但可提高反應(yīng)靈敏度）。最后加入1 μL 20×SYBER Green 熒光染料以及1 μL（8 U）Bst DNA 聚合酶，反應(yīng)液終體積為25 μL。將裝有反應(yīng)液的離心管置于羅氏Lightcycler96 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，反應(yīng)溫度為63 ℃， 每隔2 min 進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集。

1.2.2 染料法實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄（RT）-LAMP擴(kuò)增檢測(cè)甲型流感實(shí)際樣本

實(shí)際樣本經(jīng)咽拭子常規(guī)病毒試劑盒提取后，作為靶標(biāo)進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。23 μL RT-LAMP 等溫?cái)U(kuò)增體系包括10 μL 咽拭子提取液、3 μL 引物混合液、2 μL 10 mmol/L dNTPs、0.5 μL 100 mmol/L MgSO4 和5 μL 5 mol/L 甜菜堿，采用1×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液稀釋。上述反應(yīng)液于80 ℃變性1 min 后，迅速降溫至4 ℃，靜置5 min（此過程并非必須，但可提高反應(yīng)靈敏度）。最后加入1 μL 20×SYBER Green熒光染料、0.26 μL（4 U）熱啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄酶以及1 μL（8 U）Bst DNA 聚合酶，總反應(yīng)液體積為25 μL。置于羅氏lightcycler96 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，反應(yīng)溫度為63 ℃， 每隔2 min 進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集。

1.2.3 LAMP/RT-LAMP等溫?cái)U(kuò)增

24 μL LAMP/RT-LAMP 等溫?cái)U(kuò)增體系包括10 μL DNA 或RNA 模板、3 μL 引物混合液、2 μL10 mmol/L dNTPs、0.5 μL 100 mmol/L MgSO4 和5 μL 5 mol/L 甜菜堿，反應(yīng)體系采用1×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液稀釋。將24 μL 上述反應(yīng)液變性1～2 min 后，迅速降溫至4 ℃， 靜置5 min（此過程并非必須，但可提高反應(yīng)靈敏度）。最后加入1 μL（8 U）Bst DNA 聚合酶，對(duì)于RNA 樣本額外加入0.26 μL（4 U）熱啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄酶后，置于Biometra PCR 儀中，反應(yīng)溫度為63 ℃， 反應(yīng)時(shí)間為60 min。

1.2.4 CRISPR/Cas實(shí)時(shí)檢測(cè)

CRISPR/Cas 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)法檢測(cè)的靶標(biāo)是流感病毒LAMP 終點(diǎn)產(chǎn)物。20 μL 檢測(cè)體系中包含2 μLLAMP 產(chǎn)物、終濃度為200 nmol/L 的LbaCas12、終濃度為500 nmol/L 的crRNA、10 U RNA 酶抑制劑以及終濃度為200 nmol/L 的熒光探針，采用2×r2.1 緩沖液稀釋。反應(yīng)體系置于羅氏Lightcycler96 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，反應(yīng)溫度為37 ℃， 每隔1 min 進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集。

1.2.5 灰度讀取儀的設(shè)計(jì)及開發(fā)

如圖1A 所示，灰度讀取儀主要包括處理器模塊、圖像采集攝像模組、光源以及升降溫模塊等，可通過手機(jī)連接灰度讀取儀對(duì)其進(jìn)行參數(shù)調(diào)整及數(shù)據(jù)管理?；叶茸x取儀軟件可在安卓操作系統(tǒng)中運(yùn)行，主要分為5 個(gè)程序操作界面：測(cè)試界面、硬件控制、參數(shù)界面、樣品管理和記錄管理（圖1B-a）。其中，測(cè)試界面可提供操作人員需要運(yùn)行的檢測(cè)程序，并可控制啟動(dòng)和停止檢測(cè)程序；硬件控制界面可對(duì)攝像頭、溫度和光源亮度等進(jìn)行測(cè)試；參數(shù)界面可查看當(dāng)前儀器參數(shù)的設(shè)置條件，包括溫度浮動(dòng)區(qū)間、攝像頭矩形參數(shù)、計(jì)算模式和檢測(cè)闕值等信息；樣品管理界面可設(shè)置新的樣品測(cè)試條件，并可對(duì)溫度控制程序進(jìn)行編輯，例如可針對(duì)不同的檢測(cè)樣品和原理設(shè)置多個(gè)溫度控制循環(huán)等；記錄管理可對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行查看和導(dǎo)出等。檢測(cè)時(shí)，將反應(yīng)樣品放入灰度讀取儀中，再啟動(dòng)檢測(cè)程序，選擇“開始測(cè)試”，儀器會(huì)對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行第一次圖像采集并作為檢測(cè)背景，然后啟動(dòng)預(yù)設(shè)定的升/降溫或放樣檢測(cè)程序。反應(yīng)結(jié)束后，儀器對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行第二次圖像采集，并與第一次圖像采集的背景灰度進(jìn)行對(duì)比計(jì)算。計(jì)算結(jié)束后直接顯示陰性（黑色）或陽性（綠色）檢測(cè)結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)是通過計(jì)算每個(gè)樣品第二次圖像與第一次圖像灰度闕值，未超過參數(shù)設(shè)定的發(fā)光闕值判定為陰性，反之，超過參數(shù)設(shè)定中的發(fā)光闕值判定為陽性。

灰度讀取儀的手機(jī)端安卓APP 軟件可通過Wifi/藍(lán)牙查詢和導(dǎo)出本地儀器后臺(tái)數(shù)據(jù)，同時(shí)也支持對(duì)本地儀器軟件算法參數(shù)的調(diào)整和設(shè)置。手機(jī)APP 設(shè)置3 個(gè)應(yīng)用程序界面（如圖1B-b）：參數(shù)管理界面可修改當(dāng)前儀器參數(shù)設(shè)置條件，包括溫度浮動(dòng)區(qū)間、攝像頭矩形參數(shù)、計(jì)算模式和檢測(cè)發(fā)光闕值等；樣品管理界面功能與儀器樣品管理界面類似，可修改、添加或刪除樣品測(cè)試條件等；記錄管理界面可對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行查看和導(dǎo)出等。

2 結(jié)果與討論

2.1 LAMP-CRISPR/Cas的檢測(cè)原理

圖2A 顯示了LAMP/RT-LAMP 等溫?cái)U(kuò)增與CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)聯(lián)用（LAMP-CRSIPR/Cas）檢測(cè)流感病毒的原理。來自病原體的目標(biāo)基因（Template）由LAMP 擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-LAMP 擴(kuò)增，所產(chǎn)生的擴(kuò)增子中單鏈環(huán)產(chǎn)物可被crRNA 特異性識(shí)別，從而激活Cas12a 蛋白的活性。由于Cas12a 特有的非特異性單鏈DNA 切割活性，可以高效地切割溶液中的單鏈報(bào)告基因（一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)），從而釋放出熒光基團(tuán)，產(chǎn)生熒光。其中， LAMP 適用于DNA 擴(kuò)增，而RT-LAMP 適用于RNA 擴(kuò)增。

便攜化灰度讀取儀應(yīng)用程序可以根據(jù)反應(yīng)需要自定義設(shè)置，包括溫度、加熱時(shí)間和加樣暫停等。結(jié)合LAMP-CRISPR/Cas 檢測(cè)，可以設(shè)置為L(zhǎng)AMP+CRISPR 程序，樣品可全程在儀器中進(jìn)行反應(yīng)；或在LAMP 反應(yīng)完成后單獨(dú)設(shè)置CRISPR 反應(yīng)條件，將LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物引入Cas12a-crRNA 體系，并在儀器中進(jìn)行CRISPR 反應(yīng)。儀器外觀構(gòu)造如圖2B 所示，樣品放入灰度讀取儀樣品孔后，啟動(dòng)檢測(cè)程序，儀器會(huì)對(duì)樣品進(jìn)行圖像采集（圖2C），檢測(cè)結(jié)果直接顯示出陰性或無樣品（黑色）和陽性（綠色）（圖2D），檢測(cè)采集的圖像（圖2C）和檢測(cè)結(jié)果（圖2D）相互對(duì)應(yīng)。

2.2 LAMP-CRISPR/Cas檢測(cè)的可行性驗(yàn)證

以甲型流感病毒一段基因片段的同序列DNA（FluA-Template）作為靶標(biāo)，對(duì)LAMP-CRISPR/Cas 檢測(cè)體系的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。首先利用常規(guī)的染料嵌插法（LAMP-Dye staining）對(duì)LAMP 引物的有效性進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)。圖3A 顯示40 min 內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)1 copy/μL FluA-Template 的有效LAMP 擴(kuò)增，且起信號(hào)時(shí)間對(duì)于不同濃度模板具有一定的濃度依賴性。60 min 后，陰性對(duì)照出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，說明此時(shí)出現(xiàn)了引物的非特異性擴(kuò)增所導(dǎo)致的假陽性信號(hào)。在染料法中，染料可無差別地嵌插到核酸雙鏈中，并產(chǎn)生熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，因此采用該方法很難區(qū)分正確的擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增，這也是LAMP 檢測(cè)中假象頻發(fā)的主要原因。基于LAMP-CRSIPR/Cas 檢測(cè)原理（圖2A），將LAMP 擴(kuò)增終產(chǎn)物直接加入到Cas12acrRNA體系中， crRNA 僅能準(zhǔn)確識(shí)別正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，并誘導(dǎo)Cas12a 對(duì)熒光探針的非特異性切割活性。如圖3B 所示，整個(gè)反應(yīng)可在10 min 內(nèi)達(dá)到熒光信號(hào)平臺(tái)，并且陰性對(duì)照未出現(xiàn)假陽性信號(hào)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LAMP-CRISPR/Cas 方法的高特異性，進(jìn)行了多組陰性對(duì)照的平行實(shí)驗(yàn)。采用染料法檢測(cè)時(shí)（圖4A）， 4/5 的陰性對(duì)照出現(xiàn)了假陽性熒光信號(hào)，說明非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象會(huì)高頻出現(xiàn)。在LAMP-CRISPR/Cas 檢測(cè)時(shí)，所有的陰性對(duì)照均未出現(xiàn)假陽性信號(hào)（圖4B（NC1～NC5））。如果將FluATemplate的LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物替換為乙型流感病毒相關(guān)DNA（FluB-Template）的LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果也為陰性（圖4B（NC-Flu B）），表明LAMP-CRISPR/Cas 可得到兼具高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)結(jié)果。

2.3 便攜化灰度讀取儀用于檢測(cè)甲型流感模擬靶標(biāo)的可行性驗(yàn)證

上述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（圖3）是利用傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量PCR 儀采集熒光信號(hào)。將檢測(cè)體系轉(zhuǎn)移到便攜化灰度讀取儀進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)圖3B 提供的動(dòng)力學(xué)信息，將不同濃度的FluA-Template（0、0、0、1、5、50、500 和5000 copy/μL）樣品在63 ℃下進(jìn)行50 min 的LAMP 擴(kuò)增。這一步可在常規(guī)加熱孵育裝置中進(jìn)行，也可在灰度讀取儀中進(jìn)行。將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至Cas12a-crRNA 體系，設(shè)定灰度讀取儀反應(yīng)程序溫度為37 ℃， 反應(yīng)時(shí)間為20 min。反應(yīng)開始后，儀器自動(dòng)對(duì)樣品孔中的樣品進(jìn)行圖像采集，并作為反應(yīng)背景灰度（圖5A， Before）。加熱程序運(yùn)行完畢后，儀器再次對(duì)樣品進(jìn)行圖像采集（圖5A， After）。最后，灰度讀取儀通過兩次圖像采集結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，并對(duì)比預(yù)設(shè)置的發(fā)光闕值后，直接輸出計(jì)算結(jié)果（圖5B）。結(jié)果表明， ID 為Ⅰ（NC1）、Ⅱ（NC2）和Ⅲ（NC3）的樣品，其灰度闕值低于預(yù)設(shè)置闕值，因此被灰度讀取儀判定為陰性樣本；ID 為Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ的樣品，其灰度闕值高于預(yù)設(shè)置闕值，被判定為陽性樣本。因此，利用便攜化灰度讀取儀可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)甲型流感病毒模擬靶標(biāo)的高靈敏和高特異的便攜化分析，可檢測(cè)濃度低至1 copy DNA 分子，此結(jié)果與染料法檢測(cè)結(jié)果一致。需要說明的是，本研究?jī)H提供了其中一種檢測(cè)流程和閾值設(shè)定方式，在實(shí)際檢測(cè)過程中可通過多種方式進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間，例如采用同一溫區(qū)的核酸擴(kuò)增和Cas 酶體系或調(diào)整閾值。

2.4 LAMP-CRISPR/Cas-便攜化灰度讀取儀用于甲型流感實(shí)際樣本分析

采用1 個(gè)臨床陰性樣本和5 個(gè)臨床陽性樣本對(duì)LAMP-CRISPR/Cas-便攜化灰度讀取儀在實(shí)際臨床樣本檢測(cè)應(yīng)用中的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。提取后的樣本（1#～6#）與FluA-Template 空白樣品（NC）分別進(jìn)行LAMP-CRISPR/Cas 檢測(cè)，并采用熒光定量PCR 儀和自制便攜化灰度讀取儀進(jìn)行平行檢測(cè)。熒光定量PCR 儀檢測(cè)結(jié)果如圖6A 所示， FluA-Template 空白樣品和臨床陰性咽拭子樣本均未產(chǎn)生熒光信號(hào)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性；5 個(gè)臨床陽性咽拭子樣本的檢測(cè)結(jié)果為陽性。便攜化灰度讀取儀檢測(cè)結(jié)果與熒光定量PCR 儀顯示結(jié)果一致（圖6B 和6C），樣品Ⅰ（NC）和Ⅱ（1#）的檢測(cè)結(jié)果為陰性，樣品Ⅲ～Ⅶ（2#～6#）的檢測(cè)結(jié)果為陽性，Ⅷ號(hào)顯示無樣品。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用便攜化灰度讀取儀可以實(shí)現(xiàn)對(duì)甲型流感實(shí)際樣本的快速分析。

2.5 LAMP-CRISPR/Cas-便攜化灰度讀取儀檢測(cè)系統(tǒng)的通用性驗(yàn)證

利用研制的LAMP-CRISPR/Cas-便攜化灰度讀取儀檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)乙型流感病毒的模擬DNA 靶標(biāo)（FluB-Template）進(jìn)行分析。首先采用熒光染料法驗(yàn)證了FluB-Template LAMP 引物的有效性（圖7A，利用傳統(tǒng)熒光定量PCR 儀進(jìn)行信號(hào)采集）， 40 min 內(nèi)可檢出低至1 copy/μL 的FluB-Template。LAMP-CRISPR/Cas 體系檢測(cè)結(jié)果見圖7B（利用傳統(tǒng)熒光定量PCR 儀進(jìn)行信號(hào)采集），其中還加入了FluA-Template 和FluA 臨床陽性樣本，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， LAMP-CRISPR/Cas 檢測(cè)體系對(duì)于FluB-Template 的檢測(cè)同樣具有高靈敏度和高特異性，可以有效排除假陽性。同時(shí)，便攜化灰度讀取儀的檢測(cè)結(jié)果（圖7C）與傳統(tǒng)熒光定量PCR 儀結(jié)果高度一致： 樣品NC（ID：Ⅰ）、FluA 1（ID： Ⅶ）和FluA 2（ID： Ⅷ）的檢測(cè)結(jié)果皆為陰性，其它樣品檢測(cè)結(jié)果為陽性。上述結(jié)果表明， LAMP-CRISPR/Cas-便攜化灰度讀取儀檢測(cè)系統(tǒng)具有較好的實(shí)用性和通用性。

3 結(jié)論

針對(duì)甲型和乙型流感病毒開發(fā)了LAMP-CRSIPR/Cas 核酸檢測(cè)方法，并研制了配套使用的低成本便攜化灰度讀取儀。其中， LAMP 可達(dá)到低至1 copy/μL 的超高靈敏度；CRSIPR/Cas 系統(tǒng)通過crRNA 高特異性識(shí)別正確的擴(kuò)增產(chǎn)物，并將其轉(zhuǎn)化為催化放大的熒光增強(qiáng)信號(hào)；便攜化灰度讀取儀通過觸摸屏結(jié)合自主研發(fā)的軟件控制升/降溫模塊、光照單元和圖像采集模塊程序，完成檢測(cè)反應(yīng)孵育和信號(hào)輸出；檢測(cè)程序運(yùn)行結(jié)束后可直接顯示陰性或陽性結(jié)果。相較于實(shí)時(shí)熒光讀取模式，灰度讀取儀成本更低，軟件輔助的自動(dòng)化拍照和量化也能夠有效避免傳統(tǒng)肉眼識(shí)別或手機(jī)拍照帶來的判讀誤差。LAMP-CRSIPR/Cas的檢測(cè)原理適用于其它病原基因的檢測(cè)，而便攜化灰度讀取儀兼具寬溫區(qū)控溫和程序編輯功能，因此在原理上也適用于各類采用其它溫區(qū)和流程的其它恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法如RPA 等。同時(shí)，此儀器可通過藍(lán)牙與手機(jī)APP 無線連接，對(duì)儀器參數(shù)進(jìn)行調(diào)整和程序編輯，可提供更靈活的檢測(cè)方式，更好地滿足應(yīng)用需求。

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