摘要多級質譜信息（MS/MS information）可提供鑒定化合物結構的關鍵線索，多級質譜（MS/MS）圖譜到結構的轉換（MS/MS spectrum to structure）是精準鑒定化合物結構的重要過程。本研究提出了化合物的三級質譜（MS3）圖譜與其結構單元的二級質譜（MS2）圖譜匹配策略，實現(xiàn)了化合物結構的精準鑒定。首先，利用三重四極桿復合線性離子阱質譜儀（Qtrap-MS）的雙碰撞池，采集酯類化合物酯基質譜裂解產(chǎn)生的特征碎片離子（c–和y–）在線性離子阱（LIT）內(nèi)經(jīng)第二次碰撞誘導解離（Collision-induced dissociation， CID）后的MS3 圖譜，并同步采集其結構單元化合物（[M–H]–）在LIT 中經(jīng)碰撞誘導解離后的MS2 圖譜，結果表明，酯類化合物特征碎片離子的MS3 圖譜與結構單元化合物的MS2 圖譜匹配。最后，采用HR-MS/MS 對丹參總酚酸（Totalsalvianolic acid derivatives， TSA）進行定性分析，結合文獻報道及數(shù)據(jù)庫信息，初步鑒定了36 種化合物。進一步利用MS3 與MS2 圖譜匹配策略實現(xiàn)了對迷迭香酸和丹酚酸B 的精準鑒定，證明了本方法的可行性。本方法為化合物的精準定性分析提供了新的思路和參考。

關鍵詞多級質譜信息；三級質譜與二級質譜圖譜匹配；酯類化合物；丹參總酚酸；結構鑒定

液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術因具有高分辨率、高靈敏度和高通量等優(yōu)勢已成為中藥等復雜基質中化合物結構準確鑒定的重要工具[1-3]。由于化合物類型的多樣性以及同分異構體的廣泛存在，導致MS/MS 圖譜到結構（MS/MS spectrum to structure）的解析仍存在較大困難[4-5]。從MS/MS 圖譜到結構的數(shù)據(jù)解析主要包括3 個步驟：（1）將前體離子和碎片離子的m/z 值轉換為元素組成；（2）亞結構（碎片離子）的結構鑒定；（3）確定碎片離子結構之間的連接方式及位點信息，最終實現(xiàn)化合物結構的準確鑒定。

隨著多種高分辨質譜儀器性能的提升，通過前體離子和碎片離子的高分辨質荷比（HR-m/z）計算其元素組成并不困難[6]。但是，僅依據(jù)m/z 信息和經(jīng)驗性的質譜裂解規(guī)律，通常難以確定碎片離子結構及其連接方式，尤其是天然產(chǎn)物中廣泛存在的結構類似物或同分異構體。此外，基于諸多質譜數(shù)據(jù)庫（MassBank、MyCompoundID、HMDB 等）的MS/MS 圖譜匹配策略也是十分重要的鑒定手段，但由于數(shù)據(jù)庫中化合物收錄十分有限，導致很多情況下“0 hit”。近年來，研究者利用在線能量分辨質譜法（Onlineenergy-resolved mass spectrometry， Online ER-MS）采集母離子及其碎片離子在不同碰撞能量下的質譜響應變化，通過擬合裂解曲線，獲取母離子的半數(shù)響應碰撞能量（CE50）和碎片離子的最佳碰撞能（Optimalcollision energy， OCE）等質譜信息，并結合量子化學計算構建鍵解離能（Bond dissociation energy， BDE）與OCE 的相關性，實現(xiàn)了多種同分異構體的區(qū)分[7-9]。在此基礎上，全碰撞能二級質譜（Full collision energyramp-MS2， FCER-MS2）法通過全面獲取前體離子和全部二級碎片離子的裂解曲線，增加了所有碎片離子在OCE 下的相對響應豐度（RIImax）參數(shù)，從而獲得更多二級質譜信息以確定碎片離子之間的連接信息[10]。

目前，在MS/MS 圖譜到結構的研究中，碎片離子結構的準確鑒定仍為比較薄弱的環(huán)節(jié)。通過將結構復雜化合物分解為結構較簡單且易于獲得的結構單元化合物，可有效降低結構鑒定的難度，提高鑒定結果的可信度[11-12]。前體離子在碰撞池（Collision cell）中經(jīng)碰撞誘導解離（Collision-induced dissociation，CID）裂解為碎片離子的本質是氣相離子分解反應，其原理與常規(guī)的化學分解反應一致。理論上，碎片離子結構應與化學分解產(chǎn)物的準分子離子結構一致，并且二者的質譜圖也應吻合。Rodríguez 等[13]通過對比黃酮糖苷及相應結構的苷元化合物在高能碰撞下得到的MS2 圖譜，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)黃酮糖苷的MS2 圖譜中能夠檢測到對應苷元裂解的產(chǎn)物離子，基于此實現(xiàn)了天然產(chǎn)物中黃酮苷類化合物的快速檢測和鑒定。但是，該策略僅適用于中性丟失糖取代為優(yōu)勢裂解途徑的氧苷類化合物，對于碳苷等中性丟失糖取代豐度較低的化合物并不適用。具有雙碰撞池（即q2 碰撞池和線性離子阱（Linear ion trap， LIT）碰撞池）的三重四極桿復合線性離子阱質譜儀（Qtrap-MS）[14]可以靶向采集目標碎片離子的MS3 圖譜。黃酮苷的Y0+碎片離子的MS3 圖譜與其苷元的MS2 圖譜基本一致，并與對應結構苷元的同分異構體化合物明顯不同，以此實現(xiàn)了黃酮類化合物亞結構的鑒別[15]。

基于本研究組前期提出的多級能量分辨質譜（Squared energy-resolved mass spectrometry， ER2-MS）方法[12]，本研究同步對酯類化合物及其結構單元對照品的MS/MS 行為進行了研究并總結了其規(guī)律。丹參總酚酸（Total salvianolic acid derivatives， TSA）是唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的水溶性成分，主要包含丹酚酸B、迷迭香酸和紫草酸等多種水溶性的酚酸類成分，多以丹參素和咖啡酸為結構單元，形成不同的二聚體、三聚體和四聚體等[16-17]，該類化合物多屬于酯類化合物?；谝陨弦?guī)律，將MS3 與MS2 圖譜匹配策略應用于酚酸類化合物迷迭香酸和丹酚酸B 的結構鑒定，證明了本方法的可行性。本研究提出的MS3 與MS2 圖譜匹配策略促進了化合物從MS/MS 圖譜到結構的解析，為化合物的精準定性分析提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD 系列高效液相色譜（日本島津公司）串聯(lián)Triple TOF 6600+高分辨質譜儀（美國SCIEX 公司）；SCIEX Qtrap5500 質譜儀（美國SCIEX 公司）；METTLER XS105 型電子分析天平（瑞士MettlerToledo 公司）；UP2200H 型超聲波清洗器（南京壘君達超聲電子設備公司）；Eppendorf 5424R 離心機（德國Eppendorf 公司）；XW-80A 渦旋混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

對照品新綠原酸（Neochlorogenic acid）、綠原酸（Chlorogenic acid）、隱綠原酸（Cryptochlorogenicacid）、咖啡酸（Caffeic acid）、奎寧酸（Quinic acid）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-Gallocatechin gallate，GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-Epigallocatechin gallate， EGCG）、沒食子酸（Gallic acid）、遠志糖苷B（Tenuifoliside B）、4-羥基苯甲酸（4-Hydroxybenzonic acid）、西伯利亞遠志糖苷A6（Sibiricose A6）、芥子酸（Sinapic acid）、3，6′-二芥子?；崽牵?，6′-Disinapoyl sucrose）、西伯利亞遠志糖苷A1（SibiricoseA1）、遠志糖苷C（Tenuifoliside C）、3，4，5-三甲氧基肉桂酸（3，4，5-Trimethoxycinnamic acid）、迷迭香酸（Rosmarinic acid）、丹參素（Danshensu）、紫草酸（Lithospermic acid）和丹酚酸B（Salvianolic acid B）均購于上海源葉生物科技有限公司，所有對照品經(jīng)HPLC-DAD 檢測純度均大于98%。丹參藥材購于北京同仁堂，經(jīng)北京大學藥學院屠鵬飛教授鑒定為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，標本存放于北京中醫(yī)藥大學中藥現(xiàn)代研究中心。甲醇、乙腈和甲酸（質譜級，美國Thermo Fisher 公司）；乙醇和HCl（分析純，北京化工廠）。實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

精確稱取各對照品適量，分別用50%甲醇溶解，配制成1 mg/mL 的對照品儲備液。使用前，準確吸取各對照品儲備液適量，用水稀釋并渦旋1 min， 充分混勻，得到待測對照品溶液。

1.2.2 TSA樣品制備

取丹參藥材，加水提取3 次，合并提取液。藥液冷至室溫，用HCl 調(diào)至酸性，靜置后取上清液進行過濾；濾液上大孔樹脂柱，采用乙醇溶液洗脫；收集洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味；過濾，濾液冷凍干燥成粉末，即得丹參總酚酸（TSA）樣品。準確稱取粉末適量，用水溶解，配制成10 mg/mL 的樣品儲備液。準確吸取樣品儲備液適量，用50%甲醇溶液稀釋2 倍，得到稀釋后的待測樣品溶液。

1.2.3 液相色譜條件

采用Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.8 μm）；以0.1%甲酸為流動相A，乙腈為流動相B；梯度洗脫（0～1 min， 2% B；1～6 min， 2%～17% B；6～10 min， 17%～21% B；10～12 min，21%～23% B；12～20 min， 23%～35% B；20～25 min， 35% B；25～28 min， 35%～45% B；28～31 min，45%～95% B）；流速為0.2 mL/min；進樣量為2 μL；柱溫為40 ℃。

1.2.4 質譜條件

Qtof-MS 條件 Triple TOF 6600+質譜儀配備ESI 離子源，負離子模式采集，源參數(shù)設置如下：氣簾氣（CUR）為35 psi（1 psi=6.895 kPa）， 霧化氣（GS1）為50 psi，輔助氣（GS2）為50 psi，噴霧電壓（IS）為–4500 V；離子化溫度（TEM）為500 ℃。采用實時動態(tài)背景扣除（DBS）和數(shù)據(jù)依賴型采集模式（IDA）采集MS2， MS1 及MS2 采集范圍均為m/z 50～1000，碰撞能量（CE）為–35 eV，碰撞能擴展值（CES）為±15 eV。使用PeakViewTM1.2 軟件（美國SCIEX 公司）進行色譜峰提取和識別等數(shù)據(jù)處理。

Qtap-MS 條件 配備ESI 離子源，負離子模式下采集。離子源參數(shù)設置如下：霧化氣、加熱氣、氣簾氣和碰撞氣體均為N2；霧化氣體（GS1）：55 psi；加熱氣體（GS2）：55 psi；簾式氣體：30 psi；離子噴霧針電壓（IS）：–4500 V；加熱器氣體溫度（TEM）：500 ℃；碰撞激活解離（CAD）氣體流速：高；去簇電壓（DP）：–60 V。利用Analyst 1.6.3 軟件（美國SCIEX 公司）處理質譜數(shù)據(jù)，其余參數(shù)為默認值。

1.2.5 MS3和MS2圖譜采集

參照本研究組前期工作[13]，利用Qtrap-MS 的MS3 掃描模式，采集酯類化合物及其結構單元對照品的MS3 和MS2 圖譜。對于酯類化合物，其前體離子首先在q2 中發(fā)生第一次裂解，產(chǎn)生系列碎片離子，其中，酯鍵裂解相關的目標碎片離子（c?和y–）在LIT 中發(fā)生第二次裂解，生成MS3 圖譜。q2 中均采用各碎片離子的最佳碰撞能（OCE）以獲得更多的碎片離子[12-13]?；谇捌趯嶒炋骄?，獲取對照品特征碎片離子的OCE 信息見電子版文后支持信息表S1；第二維度的激發(fā)能量（Exciting energy， EE）對應儀器參數(shù)AF2，設置為系列AF2 值（0.01、0.03、0.05、0.08 和0.10 V）。對于結構單元化合物，設置較低的CE 值（–10.0 eV）使其前體離子通過q2 碰撞池時不發(fā)生裂解，直接進入LIT 采集相同AF2 值下的MS2 圖譜。選取合適EE 下酯類化合物MS3 圖譜和結構單元MS2 圖譜進行匹配。以綠原酸為例進行說明，酯基質譜裂解產(chǎn)生特征碎片離子（a–， b–， c–， y–和z–）的命名規(guī)則見電子版文后支持信息圖S1。綠原酸經(jīng)離子化產(chǎn)生前體離子m/z 353.1（[M–H]–），碰撞誘導解離（CID）后，酯基發(fā)生裂解，產(chǎn)生碎片離子m/z 179.0（c–）、m/z 161.0（b–）和m/z 135.0（a–）、m/z 191.1（y–）和m/z 173.0（z–）[18]，其中，碎片離子c–與水解產(chǎn)物咖啡酸的準分子離子峰完全一致， y–與水解產(chǎn)物奎寧酸的準分子離子峰完全一致，如圖1 所示。設定綠原酸產(chǎn)生的c–（m/z 353.1gt;179.0）和y–（m/z 353.1gt;191.1）的CE 值為其各自的OCE[19]，采集相應的MS3 圖譜；咖啡酸（m/z 179.0gt;179.0）和丹參素（m/z 191.1gt;191.1）的CE 值設置為–10.0 eV（避免其在q2 內(nèi)發(fā)生裂解），采集各自的MS2 圖譜。

2 結果與討論

2.1 對照品MS3與MS2圖譜分析及規(guī)律

綠原酸及其同分異構體新綠原酸和隱綠原酸的水解產(chǎn)物為咖啡酸和奎寧酸這兩種結構單元；沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯可水解為沒食子酸部分及沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素；由于遠志糖苷B、遠志糖苷C 和3，6′-二芥子?；崽蔷鶠殡p酯類化合物，兩個酯基均有可能發(fā)生裂解。遠志糖苷B 的一個酯基發(fā)生斷裂，可產(chǎn)生結構單元4-羥基苯甲酸和西伯利亞遠志糖苷A6；另一個酯基發(fā)生斷裂，即可產(chǎn)生結構單元芥子酸和西伯利亞遠志糖苷A3。同理，遠志糖苷C 的酯基裂解可產(chǎn)生結構單元3，4，5-三甲氧基肉桂酸和西伯利亞遠志糖苷A1，以及結構單元芥子酸和球腺糖A；3，6′-二芥子?；崽酋セ呀饪僧a(chǎn)生結構單元芥子酸、西伯利亞遠志糖苷A1 和西伯利亞遠志糖苷A6，在對照品可獲得的情況下，對化合物進行質譜數(shù)據(jù)的采集和結構的解析。

對比目標化合物的MS3 圖譜以及對應結構單元化合物的MS2 圖譜，發(fā)現(xiàn)酯類化合物酯基裂解產(chǎn)生的特征碎片離子（c–和y–）的MS3 圖譜與其水解產(chǎn)物的準分子離子峰（[M–H]–）經(jīng)過離子阱CID 裂解后的MS2 圖譜基本一致，對照品的結構及MS3 和MS2 圖譜信息見電子版文后支持信息表S1。以下分別以單酯類化合物綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸以及雙酯類化合物3，6′-二芥子?；崽菫槔M行討論。

綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸為一組位置異構體，為咖啡酸的羧基分別與奎寧酸的3、5 和4 位羥基形成酯鍵的單酯類化合物。三者的前體離子經(jīng)CID 后均可產(chǎn)生目標碎片離子c– （m/z 179.0）和y–（m/z 191.1），碎片離子在LIT 中被阱集，并進一步裂解產(chǎn)生MS3 圖譜；結構單元化合物咖啡酸和奎寧酸在負離子模式下的準分子離子峰分別為m/z 179.0（[M–H]–）和m/z 191.1（[M–H]–），這與c–和y–的m/z 值一致，因此，采集咖啡酸和奎寧酸不經(jīng)q2 裂解而在LIT 被阱集并進一步裂解得到的MS2 圖譜。綠原酸的特征碎片離子c–在LIT 中進一步裂解后，可觀察到碎片離子[M–H]–（m/z 179.0， 30.8%）和[M–H–CO2]–（m/z 135.0， 100%），而其異構體新綠原酸和隱綠原酸的c–進一步裂解后產(chǎn)生的MS3 圖譜與綠原酸的MS3圖譜基本一致。在相同的質譜條件下，采集咖啡酸的MS2 圖譜，發(fā)現(xiàn)其與綠原酸、新綠原酸及隱綠原酸c–的碎片離子產(chǎn)生情況相同，如圖2A 所示，此圖譜所呈現(xiàn)的主要碎片離子及豐度分別為m/z 179.0（22.1%）和m/z 135.0（100%）。類似地，對三者y–的質譜裂解行為進一步分析，綠原酸的MS3 圖譜顯示主要碎片離子為[M–H]–（m/z 191.1， 100%）、[M–H–H2O]–（m/z 173.0， 15.3%）、[M–H–H2O–CH2O2]–（m/z 127.0， 28.2%）、[M–H–2H2O–CO2]–（m/z 111.0， 14.0%）、[M–H–2H2O–CH2O2]–（m/z 109.0， 21.2%）、[M–H–3H2O–CO2]–（m/z 93.0， 27.2%）和[M–H–2H2O–CO2–C2H2]–（m/z 85.0， 27.6%），新綠原酸和隱綠原酸的MS3 圖譜顯示主要碎片離子及豐度與綠原酸基本一致。同樣地，奎寧酸的MS2 圖譜顯示其主要碎片離子及豐度分別為m/z 191.1（100%）、m/z 173.0（12.1%）、m/z 127.0（21.7%）、m/z 111.0（13.1%）、m/z 109.0（15.1%）、m/z 93.0（21.8%）和m/z 85.0（20.3%），此結果表明，奎寧酸的MS2 圖譜與綠原酸及其同分異構體y–的MS3 圖譜相匹配（圖2B）。綜上可知， 3 個位置異構體（綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸）的c–和y–的MS3 圖譜能夠分別與其結構單元咖啡酸和奎寧酸的MS2 圖譜相匹配，進一步說明了具有相同離子結構的化合物能夠產(chǎn)生相同的MS3/MS2 圖譜。因此，依照簡單結構單元碎片離子的質譜行為對目標化合物進行結構解析的方法具有一定的可行性。

雙酯類化合物3，6′-二芥子?；崽呛袃蓚€酯基，經(jīng)CID 裂解產(chǎn)生特征碎片離子c–（m/z 223.1）和y–（m/z 547.3），其中， c–的m/z 值與芥子酸的準分子離子峰一致，而y–的m/z 值可對應于西伯利亞遠志糖苷A1 和西伯利亞遠志糖苷A6 的準分子離子峰。c–進一步裂解產(chǎn)生的主要碎片離子分別為[M–H]–（m/z 223.1， 65.6%）、[M–H–CH3·]– ·（m/z 208.1， 36.6%）、[M–H–CO2]–（m/z 179.0， 17.0%）、[M–H–CO2–CH3·]– ·（m/z 164.0， 100%）、[M–H–CO2–2CH3·]–（m/z 149.0， 60.5%）和[M–H–CO2–2CH3·–C2H4]–（m/z 121.0，5.1%），而芥子酸的MS2 圖譜所呈現(xiàn)的主要碎片離子及相對豐度分別為m/z 223.1（88.7%）、m/z 208.1（84.7%）、m/z 179.0（78.2%）、m/z 164.0（100%）、m/z 149.0（77.8%）和m/z 121.0（14.2%），這與c–裂解后的主要碎片離子相同（圖2C）。而y–的來源可能存在兩種途徑，分別是與果糖相連的酯基發(fā)生裂解和與葡萄糖相連的酯基發(fā)生裂解。y–進一步碎裂產(chǎn)生的MS3 圖譜信息顯示其主要碎片離子及相對豐度分別為[M–H]–（m/z 547.3， 100%）、[M–H–C6H10O5]–（m/z 385.2， 4.6%）、[M–H–C6H10O5–H2O]–（m/z 367.2，13.4%）、[M–H–C6H10O5–C2H4O2]–（m/z 325.2， 8.2%）、[M–H–C6H10O5–C3H6O3]–（m/z 295.2， 11.4%）、[M–H–C6H10O5–C3H6O3–2CH3·]–（m/z 265.2， 13.4%）、[M–H–C12H20O10]–（m/z 223.2， 56.0%）、[M–H–C12H20O10–H2O]–（m/z 205.1， 33.7%）、[M–H–C12H20O10–H2O–CH3·]– ·（m/z 190.1， 11.4%）、[M–H–C12H20O10–CO2–CH3·]– ·（m/z 164.1， 6.9%）和[M–H–C12H20O10–CO2–2CH3·]–（m/z 149.1， 2.8%）。同時，西伯利亞遠志糖苷A1 的MS2圖譜所包含的碎片離子及相對豐度分別為m/z 547.3（100%）、m/z 385.2（7.3%）、m/z 367.2（18.1%）、m/z 325.2（17.0%）、m/z 295.2（22.3%）、m/z 265.2（31.8%）、m/z 223.2（89.7%）、m/z 205.1（58.2%）、m/z 190.1（28.4%）、m/z 164.1（20.4%）和m/z 149.1（10.0%），這與3，6′-二芥子?；崽堑膟–進一步碎裂所產(chǎn)生的質譜信息基本吻合；而西伯利亞遠志糖苷A6 的MS2 圖譜信息與y–裂解產(chǎn)生的MS3 圖譜有明顯的區(qū)別，如圖2D 所示。因此，可以推測，在CID 過程中， 3，6′-二芥子?；崽桥c果糖相連的酯基更容易發(fā)生解離，產(chǎn)生相對穩(wěn)定的碎片離子。

通過對比5 種酯類化合物及其相應的結構單元的MS3 和MS2 質譜信息發(fā)現(xiàn)，在可以獲得對照品的情況下，通過對簡單結構單元化合物的MS2 質譜信息與目標化合物的MS3 圖譜進行匹配，可以快速判斷目標化合物的化學結構，從而推進化合物結構的精準鑒定。利用MS3 與MS2 圖譜匹配的質譜分析策略，通過對不同類型的天然酯類化合物結構的分析，總結出以下規(guī)律：（1）借助Qtrap 的LIT 雙碰撞池結構及功能，可以實現(xiàn)酯類化合物MS3 圖譜與其結構單元化合物MS2 圖譜的同步分析；（2）具有相同離子結構的化合物能夠產(chǎn)生相同的MS3/MS2 圖譜，酯類化合物的c–和y–的MS3 圖譜與結構單元化合物的MS2 圖譜相匹配，如綠原酸、EGCG 及其同分異構體化合物；（3）通過MS3 與MS2 圖譜的匹配，可以判斷碎片離子的來源及其化學結構，從而促進化合物結構的快速篩選和精準鑒定。

2.2 MS3與MS2圖譜匹配策略在酚酸類化合物結構鑒定中的應用

采用LC-QTof-MS 對TSA 進行分析， 并結合各數(shù)據(jù)庫的質譜信息以及相關文獻報道， 初步鑒定了36 種化合物，主要包含了大量的酚酸酯類化合物。TSA 的總離子流圖（Total ion chromatography， TIC）和化學信息分別見電子版文后支持信息圖S2 和表S2。

由于存在大量同分異構體如紫草酸及其同分異構體（m/z 537.1）等，在沒有結構單元化合物對照品的情況下難以實現(xiàn)對TSA 中酚酸類成分化學結構的精準分析。本研究結合MS3 與MS2 圖譜匹配策略以及現(xiàn)有對照品，準確鑒定了酯類化合物迷迭香酸（22）和丹酚酸B（25）的化學結構，驗證了本方法在化合物精準鑒定中的可行性。

迷迭香酸是一種天然酚酸類化合物，是由一分子咖啡酸和一分子丹參素縮合而成的單酯型化合物，其結構如圖3 所示。酯基CID 裂解可產(chǎn)生兩個特征碎片離子c–（m/z 179.0）和y–（m/z 197.1）[20]，兩個結構單元對照品咖啡酸和丹參素的準分子離子峰分別為m/z 179.0（[M–H]–）和m/z 197.1（[M–H]–）。根據(jù)MS3與MS2 圖譜匹配的規(guī)律，迷迭香酸c–的MS3 圖譜應與咖啡酸的MS2 圖譜相吻合，而y–的MS3 圖譜應與丹參素的MS2 圖譜吻合。結果表明，迷迭香酸c–和y–對應的MS3 圖譜能夠分別與其結構單元咖啡酸和丹參素的MS2 圖譜匹配，進一步證實了該規(guī)律的適用性，分析結果見圖3，化學信息見表1。此外，根據(jù)迷迭香酸對照品的保留時間（tR）信息進行指認，將化合物22 鑒定為迷迭香酸，同時將化合物2 和4 分別鑒定為丹參素和咖啡酸。通過對照品指認，驗證了MS3 和MS2 匹配策略鑒定結果的可靠性，同時說明此策略可以在化合物結構的精準鑒定中得到有效應用。

丹酚酸B 是從丹參中提取的水溶性成分，其結構是由三分子丹參素和一分子咖啡酸縮合而成的雙酯型酚酸類化合物，也可視為由一分子紫草酸和一分子丹參素通過酯基連接而成的化合物，結構見圖4。由于酯基結構不穩(wěn)定，在CID 過程中，兩個酯基都有可能裂解產(chǎn)生碎片離子，對其碎片離子的結構進行鑒定有助于判斷化學鍵斷裂的發(fā)生位點，也是進行化合物精準定性的必要步驟。首先，根據(jù)高分辨質譜信息初步將TSA 中的化合物25 鑒定為丹酚酸B，進一步利用MS3 與MS2 圖譜匹配的方法對其結構進行準確鑒定。丹酚酸B 酯基質譜裂解后產(chǎn)生特征碎片離子c–（m/z 537.1），此碎片離子與紫草酸準分子離子峰的m/z 值相同。采集丹酚酸B（c–）的MS3 圖譜和紫草酸對照品的MS2 圖譜，發(fā)現(xiàn)二者的主要碎片離子相同且圖譜基本吻合，如圖4 所示，化學信息見表2，進一步說明斷裂的位點可能是與呋喃環(huán)相連的酯基，而后形成更穩(wěn)定的碎片離子。這與文獻[21]報道的丹酚酸B 的裂解途徑一致，即有兩個酯鍵時，與呋喃環(huán)相連的酯鍵更易斷裂。采用MS3 與MS2 圖譜匹配的方法鑒定了此碎片離子的結構。同樣地，在EE 設定值相同的條件下， y–對應的MS3 圖譜也能夠與丹參素的MS2 圖譜相匹配，因此可以鑒定得出碎片離子m/z 197.1 的結構與丹參素的結構相同。綜上所述，通過解析酯基兩側結構單元的MS/MS 圖譜，實現(xiàn)了對復雜化合物丹酚酸B 結構的精準鑒定。為了驗證本方法的可靠性，利用丹酚酸B 的對照品進行峰指認，最終鑒定化合物25 為丹酚酸B，同時將化合物23 鑒定為紫草酸。綜合以上結果可知， MS3 和MS2 匹配策略有助于判斷雙酯型（甚至是多酯類化合物）天然產(chǎn)物化學鍵優(yōu)先斷裂的位點，獲得更多碎片離子之間的連接信息，推進化合物的精準定性分析。

對于TSA 中的其它化合物而言，由于缺乏部分結構單元的對照品，暫時無法實現(xiàn)對其結構的全面解析和精準鑒定。但是，通過丹參素結構單元及其MS/MS 信息（多為酚酸酯類化合物，均以丹參素作為結構單元）可以快速篩選酚酸酯類化合物，同時結合文獻報道和各類數(shù)據(jù)庫的相關化學信息[22-26]，實現(xiàn)了酚酸類化合物的初步鑒定（電子版文后支持信息表S2）。

3 結論

針對酯類化合物及其結構單元對照品進行了MS/MS 行為的研究，利用Qtrap-MS 的雙碰撞池功能，獲取了酯類化合物的碎片離子（c–和y–）的MS3 圖譜及其結構單元化合物（[M?H]–）的MS2 圖譜。研究發(fā)現(xiàn)，相同碎片離子的MS3 圖譜與結構單元的MS2 圖譜相匹配，從而得出以下規(guī)律：（1）基于LIT 碰撞池的功能，可以實現(xiàn)酯類化合物MS3 圖譜與其結構單元MS2 圖譜的同步分析；（2）酯類化合物c–和y–的MS3圖譜與具有相同結構的單元化合物的MS2 圖譜相匹配；（3）通過MS3 與MS2 圖譜的匹配，可以判斷碎片離子的來源及其化學結構，從而促進化合物結構的快速篩選和精準鑒定。最后，將MS3 與MS2 圖譜的匹配規(guī)律應用于TSA 的定性分析中，成功實現(xiàn)了對酚酸酯類化合物迷迭香酸和丹酚酸B 結構的精準鑒定，并通過對照品進行了驗證，證明了本方法的可行性和實用性。與傳統(tǒng)的質譜鑒定方法相比， MS3 和MS2圖譜匹配策略提供了更豐富的質譜信息，可以快速判斷碎片離子的來源，從而實現(xiàn)化合物的結構鑒定，尤其對于結構相似或同分異構體的鑒定具有一定的優(yōu)勢。其次，本研究所采取的“頭對尾”圖譜呈現(xiàn)方式，能夠更加直觀地呈現(xiàn)化學結構的質譜信息，實現(xiàn)目標化合物的三級質譜信息與其結構單元二級質譜信息的良好匹配。然而，在本研究中由于缺乏結構單元對照品和存在大量同分異構體，實現(xiàn)TSA 中所有化合物的精準鑒定仍存在一定的困難。針對此問題，后續(xù)可以結合多種數(shù)據(jù)庫進行質譜信息的獲取，還可將鑒定結果與公開數(shù)據(jù)庫進行比對，提高鑒定結果的可靠性和準確性。

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支持信息

利用三級質譜與二級質譜匹配策略鑒定丹參中酚酸類成分

李菡 張珂 李婷 陳蔚 李軍 屠鵬飛 趙云芳 宋月林

國家自然科學基金項目（No. 81973444）資助。