摘要急性腦梗死（Acute cerebral infarction， ACI）具有起病急、死亡率高的特點(diǎn)，快速判斷ACI 的發(fā)生發(fā)展對(duì)患者的診治和預(yù)后方案的制定具有關(guān)鍵作用。研究表明，人血清中觸珠蛋白（Haptoglobin， Hp）的含量水平與ACI 有關(guān)。本研究采用表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)（Surface enhanced Raman scattering， SERS）結(jié)合免疫反應(yīng)，建立了血清中Hp 的定量分析方法。首先，在硅片上制備銀納米粒子SERS 基底，以4-巰基苯甲酸（4-Mercaptobenzoic acid， MBA）為拉曼探針，通過(guò)形成Ag—S 鍵將其連接在納米粒子表面， MBA 的羧基與自制的高效價(jià)Hp 抗體的氨基通過(guò)酰胺鍵共價(jià)交聯(lián)連接到SERS 基底上，從而形成檢測(cè)Hp 的SERS 自組裝芯片（Ag/MBA/anti-Hp）。Hp 可以被Ag/MBA/anti-Hp 基底上的抗體特異性捕獲，從而引起MBA 的SERS 特征峰發(fā)生位移。結(jié)果表明， Hp 濃度的對(duì)數(shù)與MBA 的SERS 特征峰位移之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性范圍為1～1000 ng/mL（R2=0.988）。采用本方法對(duì)90 例ACI 患者血清中的Hp 濃度進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與ELISA方法的結(jié)果一致，證明了本方法的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。本方法特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)易便捷，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血清中Hp 的特異性識(shí)別及定量分析，有望成為臨床檢測(cè)血清中Hp 的有效手段，為ACI 患者的治療和預(yù)后方案的制定提供參考。

關(guān)鍵詞觸珠蛋白；急性腦梗死；表面增強(qiáng)拉曼散射；抗體

腦梗死（Cerebral infarction， CI）是由腦部血管閉塞或動(dòng)脈狹窄引起，臨床上定義為由于特定區(qū)域的血液供應(yīng)不足而引起的腦組織損傷[1]。急性腦梗死（Acute cerebral infarction， ACI）是指ACI 患者在1 周內(nèi)發(fā)病且診斷為輕型，或ACI 患者在1 個(gè)月內(nèi)發(fā)病且診斷為重型。近年來(lái)， ACI 已成為全球第三大死亡和致殘?jiān)?，而我?guó)ACI 的發(fā)病率、死亡率以及患病風(fēng)險(xiǎn)均高于全球平均水平[2]。ACI 具有靜息狀態(tài)發(fā)病、起病迅速、可在幾小時(shí)或幾天內(nèi)達(dá)到病情高峰期的特點(diǎn)。因此， ACI 的早期診斷對(duì)于提高療效、減少潛在的后遺癥和死亡率至關(guān)重要。目前，臨床上主要利用頭顱計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）以及磁共振成像（MRI）等醫(yī)學(xué)影像技術(shù)對(duì)患者進(jìn)行動(dòng)脈造影從而確定病灶位置[3]。但是，早期ACI 患者的醫(yī)學(xué)影像并不典型，對(duì)圖像解釋不一致的情況時(shí)有發(fā)生[4]，使得ACI 的診斷效率和準(zhǔn)確率大大降低。血液是臨床檢測(cè)中最容易獲取的樣本材料，隨著ACI 領(lǐng)域的研究深入[5]，研究者逐漸關(guān)注到尋找可用于ACI 的早期診斷和指導(dǎo)個(gè)體化治療的潛在ACI 血液標(biāo)志物具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。

ACI 致腦損傷是一系列復(fù)雜的神經(jīng)生理和神經(jīng)病理事件的結(jié)果，與興奮性毒性、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡以及淀粉樣蛋白的產(chǎn)生等過(guò)程密切相關(guān)[6]。觸珠蛋白（Haptoglobin， Hp）是一種與免疫球蛋白分子結(jié)構(gòu)相似的四聚體蛋白，在正常情況下，血液中Hp 濃度在300～2000 μg/mL 范圍內(nèi)（血紅蛋白結(jié)合法檢測(cè)）。當(dāng)機(jī)體處于急性應(yīng)激狀態(tài)時(shí)， Hp 水平顯著升高，提示機(jī)體發(fā)生了急性病理生理反應(yīng)[7-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，大鼠發(fā)生ACI 后， Hp 濃度顯著升高[9]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下，血清中Hp 水平高的人發(fā)生缺血性腦卒中的幾率比Hp 水平正常的人高2 倍，提示血清中Hp 水平有可能成為預(yù)測(cè)ACI發(fā)生的指標(biāo)[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，首次發(fā)生急性ACI 的患者入院10 d 后，其血清中Hp 濃度顯著高于初入院時(shí)，提示血清中Hp 水平有可能作為ACI 病情發(fā)展的指標(biāo)，并可用于判斷急性ACI 患者的預(yù)后情況[11]。研究者也對(duì)血清中Hp 水平與腦梗死發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)血清中Hp 水平與ACI 嚴(yán)重程度正相關(guān)[12]，并且是預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素[13-14]。綜上，血清中Hp 含量水平對(duì)ACI 患者的病情判斷、治療策略及預(yù)后均具有一定的參考價(jià)值。

表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface enhanced Raman scattering， SERS）技術(shù)因具有選擇性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而成為近年來(lái)生物分子標(biāo)志物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)技術(shù)之一[15]，廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷[16]和病毒檢測(cè)[17]等領(lǐng)域。SERS 檢測(cè)通常是以金、銀和石墨烯等物質(zhì)[18]為基底并與待檢測(cè)物質(zhì)相結(jié)合，使表面吸附分子的拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度增加106～1014 倍[19]。近年來(lái)， SERS 已被大量應(yīng)用于蛋白標(biāo)志物的定性和定量分析[20-22]。目前，有關(guān)SERS 檢測(cè)Hp 的報(bào)道不多，并且多是基于SERS 特征峰的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析[23-24]，而基于強(qiáng)度的定量分析方法不可避免地會(huì)因基底不均勻而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。與之相比，基于SERS 特征峰位移的定量分析方法具有更好的光譜重現(xiàn)性，已逐漸形成了位移定量分析法取代強(qiáng)度定量分析法的趨勢(shì)。

本研究采用可特異性識(shí)別Hp 的SERS 自組裝芯片對(duì)Hp 進(jìn)行定量分析。以4-巰基苯甲酸（MBA）為拉曼探針，通過(guò)Ag—S 鍵將其連接到均勻的SERS 基底上，進(jìn)一步通過(guò)其羧基與Hp 抗體的氨基形成酰胺鍵，將Hp 多克隆抗體固定在SERS 基底上。基于Hp 抗體對(duì)Hp 的特異性識(shí)別能力， Hp 可被芯片識(shí)別捕獲，引起MBA 特征峰位移， Hp 濃度的對(duì)數(shù)與MBA 特征峰位移之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，基于此實(shí)現(xiàn)Hp的定量分析。本研究制備的SERS 自組裝芯片具有特異性好及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為Hp 的臨床檢測(cè)提供了新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LabRAM ARAMIS 拉曼光譜儀（法國(guó)Horiba Jobin-Yvo 公司）；JEM-2100F 透射電子顯微鏡和JSM-7800F 掃描電子顯微鏡（日本JEOL 公司）；Neofuge 15R 冷凍離心機(jī)（力康公司）；GL124-1SCN 電子分析天平（美國(guó)Sartorius 公司）；Synergy H1 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

Hp 抗原標(biāo)準(zhǔn)品（Hp Ag）、AgNO3、牛血清蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和丙酮（分析純，美國(guó)Sigma 公司）；HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體（美國(guó)Signalway 公司）；1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、三乙胺（TEA）、H2O2（30%）、檸檬酸鈉（C6H5Na3O7，分析純）、H2SO4（98%）和氯仿（CHCl3）（分析純，北京化工廠）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，分析純，百靈威公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS， 0.01 mol/L KH2PO4-Na2HPO4， pH=7.2，含0.8%（m/V）NaCl，美國(guó)賽默飛公司）；MBA（C7H6O2S，上海凜恩科技發(fā)展有限公司）；乙醇和甘氨酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。Hp檢測(cè)ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技公司）；N 型100 單晶面硅片（中國(guó)電子科技集團(tuán)公司第四十六研究所）。清潔級(jí)大耳白兔（億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臨床樣本的采集。

本研究采用吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2019 年12 月到2021 年1 月未經(jīng)治療的ACI 患者血清，所有患者皆為首次發(fā)病且發(fā)病時(shí)間均在72 h 內(nèi)，共計(jì)90 例。取患者在入院后24 h 內(nèi)進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)的血液樣本離心后，取上層血清500 μL 至微量離心管中，于?80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩１狙芯恳勋@得吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文件編號(hào)：20201112），患者知情同意。

1.2.2 Hp多克隆抗體的制備

通過(guò)查詢(xún)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)UNIPROT 后獲得Hp 蛋白氨基酸序列，對(duì)Hp 的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，制定Hp 重組蛋白抗原的表達(dá)方案，表達(dá)純化測(cè)試后，選擇最佳的表達(dá)純化條件進(jìn)行放大。將Hp 重組蛋白抗原作為免疫原免疫清潔級(jí)大耳白兔，免疫時(shí)間和劑量如電子版文后支持信息表S1 所示。大耳白兔用酒精消毒后，對(duì)其背后固定免疫點(diǎn)位進(jìn)行6～8 點(diǎn)注射，對(duì)第3、第4 次免疫后的抗血清效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)（要求抗血清效價(jià)gt;32000）。第4 次免疫后，取大耳白兔心臟血液并離心收集血清，于?20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將Hp 重組蛋白抗原與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，將所得抗血清與PBS 等量混合后緩慢上樣，待抗體結(jié)合后，用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，得到純化抗體，立即在PBS 中進(jìn)行透析過(guò)夜。采用ELISA 法檢測(cè)抗體效價(jià)，將Hp 重組蛋白抗原濃度稀釋至5 μg/mL， 逐孔加入酶標(biāo)板后（每孔100 μL），于4 ℃包被過(guò)夜。用5% BSA室溫封閉1 h，棄去BSA 后，用PBS 洗板3 次，按照10 倍梯度法對(duì)Hp 多克隆抗體進(jìn)行系列梯度稀釋?zhuān)⒃O(shè)置陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔。依次加入Hp 多克隆抗體樣品后，用封板膜封板，于37 ℃溫育1 h， PBS 洗滌5 次，將HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG 按照最佳條件稀釋后加入孔內(nèi)，再次孵育1 h（37 ℃）。棄去封板膜和孔內(nèi)液體，甩干后每孔加滿(mǎn)PBS，靜置30 s 后棄去，重復(fù)洗滌5 次后，拍干孔板內(nèi)液體。每孔先加入顯色劑，輕輕振蕩混勻， 37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL 終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，依次測(cè)量各孔在450 nm 處的吸光度（OD 值）。Hp 重組蛋白樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后在100 V下轉(zhuǎn)膜， BSA 封閉1 h 后，洗膜3 次，每次10 min。以本研究中所得到的Hp 多克隆抗體為一抗，與二抗結(jié)合顯色后觀察結(jié)果。

1.2.3 SERS自組裝芯片的制備

本研究采用銀納米粒子（AgNPs）作為芯片的增強(qiáng)基底。將0.036 g AgNO3 加入到250 mL 燒瓶中，加入200 mL 超純水，攪拌溶解并加熱煮沸，加入1%檸檬酸鈉溶液，當(dāng)溶液顏色變?yōu)辄S色時(shí)，降溫至85 ℃，繼續(xù)加熱攪拌30 min，得到AgNPs[25]。采用本研究組前期建立的方法[26]制備SERS 自組裝芯片（圖1），其制備過(guò)程如下：（1）制備銀硅片基底。準(zhǔn)備一塊3 mm×3 mm 的硅片，分別使用超純水、乙醇、丙酮、氯仿、丙酮、乙醇和超純水依次超聲清洗，每次超聲5 min。清洗完畢后，對(duì)硅片進(jìn)行羥基化處理，即將洗凈的硅片放在H2O2/濃H2SO4（3∶7， V/V）溶液中，加熱煮沸至有氣泡冒出，繼續(xù)加熱，直至氣泡消失，冷卻至室溫，用超純水洗凈。羥基化處理后，將硅片浸泡到聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）溶液中孵育30 min，取出，反復(fù)沖洗后，將硅片置入制備好的AgNPs 溶液中，反應(yīng)6 h。（2）將上述基底浸潤(rùn)在100 μmol/L MBA 溶液中12 h， MBA 通過(guò)其巰基與Ag 形成Ag—S 鍵而連接到AgNPs 表面，然后再放入EDC-NHS（1∶2， n/n）溶液中2 h，進(jìn)行羧基活化。（3）取10 μg/mL Hp 多克隆抗體與制備好的帶有探針的基底浸泡混合，孵育2 h，用BSA 溶液（0.1 mg/mL）封閉2 h。將制備好的芯片用超純水沖洗3 次后，用氮?dú)獯蹈?，? ℃ 保存。

1.2.4 Hp的定量分析

將一定濃度的Hp 抗原標(biāo)準(zhǔn)品用0.01 mol/L PBS（pH 7.2）稀釋?zhuān)玫讲煌瑵舛忍荻龋?、5、10、50、100、500 和1000 ng/ml）的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將SERS 自組裝芯片浸泡在50 μL 不同濃度的Hp 標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，37 ℃下孵育2 h， 用水沖洗3 次后，氮?dú)獯蹈?，在激發(fā)光源633 nm、功率15 mW、掃描時(shí)間5 s 條件下進(jìn)行拉曼光譜測(cè)試。以0.01 mol/L PBS（pH 7.2）作為對(duì)照，記錄MBA 探針?lè)肿釉?070 cm–1 附近的SERS 特征峰位移。

用0.01 mol/L PBS（pH 7.2）將血清稀釋10 倍，將SERS 自組裝芯片浸泡在其中， 37 ℃反應(yīng)2 h， 用水沖洗3 次后，氮?dú)獯蹈桑诩ぐl(fā)光源633 nm、功率15 mW、掃描時(shí)間5 s 條件下進(jìn)行拉曼光譜測(cè)試，記錄MBA 探針?lè)肿釉?070 cm–1 附近的SERS 特征峰位移。

2 結(jié)果與討論

2.1 Hp重組抗原的設(shè)計(jì)與合成

經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)后得到Hp 的抗原信息：

MSALGAVIALLLNGQLFAVDSGNDVTDIADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTEGDGVYTLNDKKQWINKAVGDKLPECEADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYOCKNYYKLRTEGDGVYTLNNEKOWINKAVGDKLPECEAVCGKPKNPANPVQRILGGHLDAKGSFPWQAKMVSHHNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSENATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHPNYSQVDIGLIKLKOKVSVNERVMPICLPSKDYAEVGRVGYVSGWGRNANFKFTDHLKYVMLPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAEN

分析蛋白性質(zhì)后，采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)179-406aa 蛋白，載體采用pET28b， C 端添加GS linker 及6*His 標(biāo)簽，酶切位點(diǎn)采用Nco1/Xho1，表達(dá)菌株為BL21（DE3），進(jìn)行重組表達(dá)抗原制備。經(jīng)設(shè)計(jì)后，添加純化標(biāo)簽的Hp 重組蛋白抗原信息：

MVSHHNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSENATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHPNYSQVDIGLIKLKQKVSVNERVMPICLPSKDYAEVGRVGYVSGWGRNANFKFTDHLKYVMLPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAENHHHHHH

優(yōu)化后的Hp 重組蛋白抗原具有234 個(gè)氨基酸殘基，理論分子量為26.28 kDa， SDS-PAGE 結(jié)果如電子版文后支持信息圖S1 所示，在25 kDa 處Marker 上方可見(jiàn)1 條清晰條帶，實(shí)測(cè)蛋白分子量約為26 kDa，證實(shí)得到了純化的Hp。

2.2 Hp多克隆抗體的鑒定

采用純化的自制Hp 多克隆抗體包被酶標(biāo)板，利用ELISA 檢測(cè)抗體效價(jià)（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S2），結(jié)果表明， Hp 多克隆抗體效價(jià)最高可達(dá)1∶128000（OD=0.14）。采用Western Blot 實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)， Hp 特異性條帶顯示在26 kDa 附近，證明Hp 多克隆抗體有效且特異性好。

2.3 SERS基底的制備

硅片經(jīng)羥基化處理后表面帶有負(fù)電荷， PDDA 溶液帶有正電荷，基于靜電作用將PDDA 結(jié)合到硅片表面。制備的AgNPs 表面帶有負(fù)電荷，可與硅片表面吸附的PDDA 結(jié)合，至此完成了SERS 基底的自組裝。采用透射電子顯微鏡（SEM）觀測(cè)，所制備的AgNPs 粒徑約為40～50 nm， 并且較均勻（圖2A）；AgNPs 與硅片表面吸附的PDDA 結(jié)合后，所制備的SERS 基底表面均勻（圖2B）。

2.4 Hp在制備的SERS自組裝芯片上的拉曼響應(yīng)

2.4.1 SERS自組裝芯片與Hp的反應(yīng)

0.1 mmol/L MBA 通過(guò)Ag—S 鍵吸附在SERS 基底上，吸附過(guò)程與隨后Hp 抗體的偶聯(lián)可以通過(guò)SERS光譜證實(shí)。圖3A 為自組裝芯片制備過(guò)程中的SERS 譜圖，圖3B 為1070 cm?1 附近區(qū)域的放大圖。未吸附MBA 時(shí)， SERS 基底幾乎沒(méi)有SERS 峰（圖3A，曲線(xiàn)a）；吸附MBA 后，出現(xiàn)了MBA 的譜峰（圖3A，曲線(xiàn)b），其中， 1073 cm?1 處的峰歸屬為MBA 的具有C—S 鍵拉伸的平面內(nèi)環(huán)呼吸模式。當(dāng)將Hp 抗體偶聯(lián)在基底表面后，在1370 cm?1 處的SERS 峰消失。1370 cm?1 處的峰歸屬于MBA 的COO—拉伸模式[27]，當(dāng)基底與生物大分子（如抗體和蛋白質(zhì)）結(jié)合時(shí)，此峰消失（圖3A 曲線(xiàn)c 和d），證明Hp 抗體成功通過(guò)其氨基與MBA 的羧基形成酰胺鍵，并連接到SERS 基底上。上述結(jié)果表明成功制備了SERS 自組裝芯片。

隨著Hp 蛋白加入，抗原抗體的結(jié)合誘導(dǎo)拉曼探針?lè)肿覯BA 發(fā)生變形，即MBA 分子的極化率發(fā)生改變，這表現(xiàn)為SERS 特征峰位移變化[26]。如圖3所示，當(dāng)在SERS 自組裝芯片上加入Hp 后，由于Hp 與芯片上的Hp 抗體結(jié)合， MBA 在1073 cm?1 處的特征峰發(fā)生了明顯位移至1076 cm?1（圖3B）。因此，可以利用SERS 特征峰的位移實(shí)現(xiàn)對(duì)Hp 的痕量檢測(cè)。

2.4.2 Hp孵育時(shí)間的影響

將SERS 自組裝芯片浸泡在50 ng/mL Hp 溶液中，在37 ℃記錄不同孵育時(shí)間下MBA 在1073 cm?1 處特征峰的位移。如圖4 所示，在120 min 之前， MBA 的SERS 位移隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增大；120 min 之后， SERS 位移基本不變。因此，本研究選擇SERS 自組裝芯片與Hp 的孵育時(shí)間為120 min。

2.4.3 SERS自組裝芯片對(duì)Hp的檢測(cè)性能

采用自制的SERS 自組裝芯片檢測(cè)不同濃度的Hp 標(biāo)準(zhǔn)品溶液， SERS 圖譜如圖5 所示，隨著Hp 濃度（1～1000 ng/mL）增大，在1073 cm?1 處MBA 特征峰的位移逐漸增大，特征峰的位移（y）與Hp 濃度（ng/mL）的對(duì)數(shù)值（x）呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為y=0.743x+0.699（R2=0.988），檢出限為0.69 ng/mL（S/N=3）。

2.4.4 方法的特異性

采用本方法檢測(cè)前列腺特異性抗原（PSA）、胰島素自身抗體（IAA）和Hp，結(jié)果如圖6 所示。只有Hp 存在時(shí)， MBA 在1073 cm?1 處的SERS 特征峰才發(fā)生位移；10 倍濃度的PSA 和IAA 存在時(shí)，未發(fā)現(xiàn)明顯的SERS 位移。結(jié)果表明，制備的SERS 自組裝芯片具有良好的特異性，可特異性識(shí)別Hp。

2.4.5 血清中Hp的加標(biāo)回收試驗(yàn)

將一定濃度的Hp 抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入稀釋的人血清中，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示，回收率為91%～94%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于3.2%，表明本方法檢測(cè)血清樣品中的Hp的準(zhǔn)確性和實(shí)用性良好。

2.4.6 臨床樣本檢測(cè)

根據(jù)病人病情（輕、中、重）各抽取30 例血清（共90 例），采用本方法檢測(cè)血清中的Hp 含量，并與ELISA 試劑盒測(cè)得的Hp 濃度進(jìn)行比較，結(jié)果表明，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性（表2），因此，采用本方法可準(zhǔn)確檢測(cè)血清中的Hp 濃度。檢測(cè)結(jié)果也表明，隨著病情進(jìn)展， Hp 濃度逐漸升高，這與Hp濃度水平與ACI 嚴(yán)重程度呈正相關(guān)的研究報(bào)道[12]相符。

3 結(jié)論

Hp 參與ACI 的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過(guò)程，其在血液中的含量與ACI 患者的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究構(gòu)建了以Ag/MBA/anti-Hp 為基底的SERS 自組裝芯片，并通過(guò)測(cè)定MBA 的SERS 特征峰位移對(duì)Hp 進(jìn)行定量分析。Hp 濃度在1～1000 ng/mL 范圍內(nèi)，其對(duì)數(shù)值與MBA 的SERS 特征峰位移之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，基于此可特異性檢測(cè)臨床血液樣品中的Hp 含量。本研究為ACI 的診斷、療效觀察及預(yù)后提供了新的檢測(cè)方法。

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吉林省科技廳項(xiàng)目（No. 20200404193YY）資助。

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