摘要采用全自動(dòng)在線固相萃取凈化技術(shù)去除植物粗提物中的基質(zhì)干擾組分，建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）同步測(cè)定植物葉片組織中23 種全氟化合物（Per- and polyfluoroalkyl substances，PFASs）（13 種全氟羧酸類、4 種全氟磺酸類和6 種新型替代品）的新方法。植物樣品經(jīng)1%甲酸-甲醇溶液提取兩次再旋蒸至干，用70%甲醇溶液復(fù)溶后直接進(jìn)樣分析。通過WAX 在線固相萃取柱對(duì)PFASs 進(jìn)行自動(dòng)化凈化后，切換六通閥，將PFASs 沖洗至適用于堿性流動(dòng)相體系的C18 分析柱上，采用含0.4%氨水的甲醇/水二元流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫，在16 min 內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)各目標(biāo)化合物的色譜分離。采用串聯(lián)質(zhì)譜在多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下進(jìn)行PFASs 的在線檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。方法學(xué)考察結(jié)果表明，植物葉片樣品中23 種目標(biāo)PFASs 的平均加標(biāo)回收率為64.2%～125.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.7%～12.8%，各目標(biāo)PFASs在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.990，檢出限（LOD， S/N=3）在0.02～0.50 μg/kg之間。采用本方法對(duì)海洋綠潮藻滸苔和4 種樹葉實(shí)際樣品中的PFASs 進(jìn)行檢測(cè)，共檢出6 種PFASs，其中PFBA 為主要污染物。與文獻(xiàn)報(bào)道的離線固相萃取法相比，本方法簡化了樣品前處理過程，為植物組織中典型PFASs 及其新型替代品的日常監(jiān)測(cè)提供了一種簡便、快捷和準(zhǔn)確的方法。

關(guān)鍵詞在線固相萃??；植物葉片；全氟化合物；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

全氟化合物（Per- and polyfluoroalkyl substances， PFASs）是一種人造有機(jī)氟化物，其結(jié)構(gòu)通常為碳骨架上的氫原子全部或大部分被氟原子取代，支鏈上再連接一個(gè)親水基官能團(tuán)[1]。這種既疏水又親水的結(jié)構(gòu)使PFASs 表現(xiàn)出良好的疏水疏油性和化學(xué)穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于皮革保護(hù)劑、紡織品和農(nóng)藥等領(lǐng)域中[2]。其中，全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）已被列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》[3]。近年來，雖然PFASs 的產(chǎn)量和使用量大幅下降，但市場(chǎng)上出現(xiàn)了新的含氟替代品，例如一些短鏈的6∶2 氯代多氟烷基醚磺酸（6∶2 Cl-PFESA，商品名為F53-B）被廣泛應(yīng)用于電鍍行業(yè)[4]；全氟辛烷磺酰胺類（FOSAs）作為PFOA 和PFOS 的前體物質(zhì)[5]，在傳輸過程中會(huì)發(fā)生氧化，或進(jìn)入生物體后代謝轉(zhuǎn)化為PFOA 和PFOS[6]，也不容忽視。由于PFASs 有一定的水溶性[7]，當(dāng)植物暴露在含有PFASs 的環(huán)境中時(shí)，植物會(huì)從受污染的水和土壤中吸收PFASs，然后運(yùn)輸至莖和葉[8]。自20 世紀(jì)60 年代以來，植物葉子常被用作監(jiān)測(cè)環(huán)境中PFASs 的工具[9]，因此，建立簡便、靈敏和準(zhǔn)確測(cè)定植物葉片組織中典型PFASs 及其新型含氟替代品的分析方法，對(duì)了解PFASs 對(duì)環(huán)境的污染程度以及揭示PFASs 的轉(zhuǎn)化代謝過程具有重要意義。

目前，用于檢測(cè)PFASs 的方法主要有酶聯(lián)免疫法[10]、電化學(xué)傳感器法[11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[13]等，其中， LC-MS/MS 法準(zhǔn)確度高、靈敏度好，是目前檢測(cè)環(huán)境樣品中PFASs 的最佳方法。對(duì)于植物樣品中的PFASs，常采用堿消解法（ADM）[14]、離子對(duì)萃取法（IPE）[15-16]、QuEChERS 法[17]和固相萃取法（SPE）等進(jìn)行提取和凈化，其中， ADM 法提取時(shí)間一般為12 h， 耗時(shí)較長；雖然IPE 法對(duì)PFASs 有較好的提取選擇性，但是處理過程繁瑣、試劑消耗量大[18]；QuEChERS 法是一種高選擇性的前處理方法，但在處理過程中需要脫水，通過含GCB 和PSA 填料的凈化柱凈化處理，處理步驟較多，成本較高；固相萃取法分為離線固相萃取和在線固相萃取，但離線SPE 法對(duì)含量很低的PFASs 樣品進(jìn)行處理時(shí)容易引起交叉污染，并且離線SPE 操作復(fù)雜，自動(dòng)化程度和經(jīng)濟(jì)性都遠(yuǎn)不及在線SPE 法[13]。

在線SPE 法是一種自動(dòng)化的樣品凈化技術(shù)，具有自動(dòng)化程度高、有機(jī)溶劑用量小、樣品需要量小以及重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)[19]。莫靜等[20]通過在線SPE-LC-MS/MS 方法測(cè)定了人血液和尿液中31 種有毒植物化學(xué)組分的含量，檢出限低至0.01～5.00 μg/L， 加標(biāo)回收率為90%；Yu 等[21]建立了在線SPE-LC-MS/MS檢測(cè)人血清中PFASs 的方法， 10 min 內(nèi)即可完成12 種PFASs 的檢測(cè)，檢出限低至0.01 ng/mL；Shi 等[19]建立了在線SPE-LC-MS/MS 分析南極冰芯樣品中12 種PFASs 的方法，結(jié)果表明，在線SPE 技術(shù)在復(fù)雜樣品中PFASs 凈化領(lǐng)域有很好的應(yīng)用潛力。然而，將在線SPE 技術(shù)應(yīng)用于植物提取液樣品中不同類別PFASs 的快速凈化研究仍鮮有報(bào)道。本研究基于在線SPE 凈化技術(shù)，結(jié)合LC-MS/MS 分析，通過對(duì)在線SPE 條件和樣品前處理方法的系統(tǒng)優(yōu)化，發(fā)展了一種只需要對(duì)植物葉片中的PFASs 進(jìn)行簡單提取后即可直接進(jìn)樣測(cè)定的自動(dòng)化凈化檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1290 Ⅱ型超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有四元泵（在線固相萃取樣品加載泵）、二元泵（分析泵）、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱（帶有2 位6 通切換閥）；6470 型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司），配有噴射流電噴霧電離（AJS-ESI）源；HC-3018 型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；SK3300H 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；N-100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；高速粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；UNIQUE-R20 實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司）；ME104 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Alpha 1-4 LD plus 冷凍干燥機(jī)（德國CHRIST公司）；MIX-23P 迷你混合儀（杭州迷歐儀器有限公司）。

17 種PFASs 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，濃度為2000 ng/mL，純度大于98%，包括全氟丁酸（PFBA）、全氟戊酸（PFPeA）、全氟己酸（PFHxA）、全氟庚酸（PFHpA）、全氟辛酸（PFOA）、全氟壬酸（PFNA）、全氟葵酸（PFDA）、全氟十一酸（PFUnDA）、全氟十二酸（PFDoDA）、全氟十三酸（PFTrDA）、全氟十四酸（PFTeDA）、全氟十六酸（PFHxDA）、全氟十八酸（PFODA）、全氟丁烷磺酸（PFBS）、全氟己烷磺酸（PFHxS）、全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟葵烷磺酸（PFDS）。6 種單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均為50 μg/mL，純度均大于98%，包括N-乙基全氟-1-辛烷磺酰胺乙酸（N-EtFOSAA）、N-甲基全氟-1-辛烷磺酰胺乙酸（N-MeFOSAA）、全氟辛烷磺酰胺（PFOSA）、六氟環(huán)氧丙烷二聚體（HFPO-DA）、6∶2 氯代多氟烷基醚磺酸（6∶2 Cl-PFESA）、8∶2 氯代多氟烷基醚磺酸（8∶2 Cl-PFESA）。9 種內(nèi)標(biāo)混合溶液（MPFAC-MXA），濃度為2000 ng/mL，純度大于98%。以上溶液均購自加拿大Wellington Laboratories 公司。甲醇和甲酸（質(zhì)譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；氨水（含28.0%～30.0% NH3，優(yōu)級(jí)純，美國Sigma-Aldrich 公司）；甲酸銨（質(zhì)譜純，≥99.9%，上海阿拉丁生化科技有限公司）。

2022 年7 月在青島市石老人浴場(chǎng)采集海洋綠潮藻滸苔樣品2 份，于2022 年7 月在中國海洋大學(xué)嶗山校區(qū)采集4 種樹（單櫻、黃連木、楊樹和冬青）的葉片樣品各3 份，所有植物葉片樣品均經(jīng)冷凍干燥處理，再進(jìn)行粉碎研磨。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液將濃度為2000 ng/mL 的9 種PFASs 內(nèi)標(biāo)混合液用甲醇稀釋至50.0 ng/mL，作為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃密封保存。

外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液將濃度為2000 ng/mL 的17 種PFASs 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為50 μg/mL 的6 種PFASs 單標(biāo)溶液用甲醇稀釋成各種PFAS 濃度均為100.0 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3 節(jié)的方法處理空白樹葉樣品，得到基質(zhì)空白溶液；采用基質(zhì)空白溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，得到濃度為20.0 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用基質(zhì)空白溶液逐級(jí)稀釋，得到系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，其內(nèi)標(biāo)濃度均為1.0 ng/mL。

1.3 樣品制備條件

準(zhǔn)確稱取0.20 g 樣品，置于15 mL 聚丙烯離心管中，加入1.0 ng 內(nèi)標(biāo)和3 mL 含1%甲酸的甲醇溶液，渦旋振蕩1 min， 超聲輔助提取30 min， 9000 r/min 離心5 min， 收集上清液，重復(fù)提取1 次，合并提取液并于35 ℃旋蒸至干，加入1 mL 70%甲醇溶液復(fù)溶， 10000 r/min 離心7 min 后，取上清液至LC 進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

1.4 在線SPE-LG-MS/MS條件

在線SPE 條件采用WAX 柱（4.0 mm × 30 mm， 30 μm，美國Waters 公司）作為在線SPE 凈化柱，進(jìn)樣體積10 μL；樣品加載流動(dòng)相A 為超純水（用甲酸調(diào)至pH = 5），流動(dòng)相B 為0.1%氨水-甲醇溶液，流速0.5 mL/min。樣品加載泵梯度程序：0～6.0 min， 0% B；6.0～6.5 min， 0～100% B；6.5～9.5 min， 100% B；9.5～13.5 min， 100%～0% B。六通閥切換示意圖如圖1 所示， 0～6.0 min 時(shí)，六通閥1 位和6 位相連（圖1A），此時(shí)四元泵加載流動(dòng)相將進(jìn)樣器中的樣品加載至在線固相萃取柱，二元泵流動(dòng)相平衡分析柱；6.0～15.5 min 時(shí)，六通閥的1 位和2 位相連（圖1B），此時(shí)四元泵加載流動(dòng)相直接進(jìn)廢液，二元泵流動(dòng)相將在線固相萃取柱中的目標(biāo)化合物反沖至分析柱，經(jīng)分析柱分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。

LG-MS/MS 分析條件Poroshell HPH C18 柱（3.0 mm × 30 mm， 1.9 μm，美國Agilent 公司）作為分析柱，配有HPH C18 保護(hù)柱（3.0 mm × 5 mm， 1.9 μm，美國Agilent 公司），柱溫30 ℃；流動(dòng)相A 為含2.5 mmol/L 甲酸銨和0.4%氨水的水溶液；流動(dòng)相B 為0.4%氨水-甲醇溶液，流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～6.0 min， 35% B；6.0～15.5 min， 35%～100% B。AJS-ESI 負(fù)離子模式檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），霧化氣壓力為206.8 kPa，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為11.0 L/min；霧化氣溫度為300 ℃，流速為8 L/min；毛細(xì)管電壓為3500 V， 噴嘴電壓為500 V。PFASs 質(zhì)譜分析的定性和定量離子見電子版文后支持信息表S1。

1.5 質(zhì)量控制方法

為了消除外源污染，在樣品采集、提取和測(cè)定過程中都應(yīng)避免接觸聚四氟乙烯（PTFE）和含氟聚合物材料的物品；所有容器在使用之前用超純水和甲醇清洗3 次；在每批次樣品提取過程中同時(shí)做流程空白實(shí)驗(yàn)，以監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過程中的污染問題；在每批次樣品分析過程中，通過質(zhì)控樣、溶劑空白樣和基質(zhì)加標(biāo)樣對(duì)儀器的狀態(tài)以及背景污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)。為了降低在線SPE 樣品加載泵引起的PFASs 背景干擾，在樣品加載泵和進(jìn)樣器之間裝一個(gè)凈化柱，用于捕獲系統(tǒng)中的PFASs。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的確定

反相C18 色譜柱是LC-MS/MS 分離分析多種PFASs 最常用的色譜柱[22-24]，基于采用的流動(dòng)相體系不同，可分為酸性流動(dòng)相（甲醇/乙腈-水-甲酸/乙酸）[22]和堿性流動(dòng)相（甲醇/乙腈-水-氨水）[23-24]體系。由于本研究采用在線SPE 與LC-MS/MS 聯(lián)用模式分離多種PFASs，因此，所確定的液相色譜流動(dòng)相體系需滿足從在線SPE 柱上高效洗脫P(yáng)FASs 的要求。當(dāng)采用WAX 在線SPE 柱時(shí)，酸性流動(dòng)相無法從SPE 柱洗脫各種PFASs，最終選擇由甲醇-水-氨水組成的堿性流動(dòng)相體系。液相色譜流動(dòng)相的pH 值會(huì)影響目標(biāo)分析物的分離度和峰形，本研究對(duì)流動(dòng)相中添加不同體積分?jǐn)?shù)（0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和1.0%）氨水的分離效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相中添加的氨水體積分?jǐn)?shù)≥0.4%時(shí)，各種典型PFASs 及新型替代品的色譜峰尖銳對(duì)稱；當(dāng)氨水的體積分?jǐn)?shù)≤0.2%時(shí)，出現(xiàn)了色譜峰拖尾的現(xiàn)象，并且隨著氨水濃度下降，峰拖尾現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。因此，本研究確定添加氨水的體積分?jǐn)?shù)為0.4%。此外，由于具有不同鏈長和結(jié)構(gòu)的PFASs 的極性相差較大，采用梯度洗脫才能實(shí)現(xiàn)PFASs 的有效分離，而分析柱梯度洗脫程序初始流動(dòng)相中甲醇的占比對(duì)在線SPE-LC-MS/MS 成功分離檢測(cè)多種PFASs 有重要影響，初始流動(dòng)相中甲醇占比過低，會(huì)降低從在線SPE 柱洗脫P(yáng)FASs 的效率，進(jìn)而導(dǎo)致部分PFASs 色譜峰展寬；初始流動(dòng)相中甲醇占比過高，會(huì)引起短鏈PFASs 在分析柱上無法保留而降低分離度，通過對(duì)流動(dòng)相洗脫程序的系統(tǒng)優(yōu)化，確定初始流動(dòng)相中甲醇占比為35%，此時(shí)可以實(shí)現(xiàn)PFASs 的在線SPE-LC-MS/MS 分離分析， 23 種PFASs 標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子圖見圖2，各PFAS 的色譜峰尖銳對(duì)稱，分離度良好。

2.2 在線SPE條件優(yōu)化

目前，用于富集和凈化環(huán)境樣品中PFASs 的SPE 柱類型主要有WAX[25]、HLB[26]和PLRP-S[27]等，本研究對(duì)這3 種SPE 柱在線富集23 種PFASs 的效率進(jìn)行了比較，結(jié)果表明， HLB 柱（3.0 mm × 20 mm，5 μm，美國Waters 公司）對(duì)C4～C11 PFASs 的富集效率低于WAX，并且對(duì)長鏈PFASs（gt;C11）的富集效率非常低；PLRP-S 柱（2.1 mm × 12.5mm， 20 μm，美國Agilent 公司）對(duì)C7～C10 PFCAs、PFHxS、PFOSA、PFOS 和6∶2 Cl-PFESA 的富集效率優(yōu)于HLB 柱，但仍低于WAX 柱，并且C12～C18 PFASs 都未被檢出；WAX 柱對(duì)各PFASs 的富集效果均優(yōu)于HLB 和PLRP-S 小柱， 23 種PFASs 均可檢出，并且峰形尖銳對(duì)稱。綜上所述， WAX 柱對(duì)各種類型PFASs 的富集效率均最高。因此，本研究選擇WAX-SPE 柱用于PFASs 的在線凈化。

WAX-SPE 柱的填料屬于混合型弱陰離子交換反相吸附劑，通常在酸性條件下對(duì)陰離子的交換效率更高（吸附劑的pKa = 6）[1]，因此，當(dāng)在線WAX-SPE 柱的加載流動(dòng)相偏酸性時(shí)可能會(huì)提高樣品中PFASs的富集效率。本研究考察了加載流動(dòng)相的pH 值（8、5 和3）對(duì)目標(biāo)化合物在線富集效率的影響（圖3A），結(jié)果表明當(dāng)加載流動(dòng)相pH = 5 和pH = 8 時(shí)，所有目標(biāo)化合物均被檢出，總體上， pH = 5 時(shí)對(duì)中短鏈PFASs 富集效果優(yōu)于pH = 8，這與Brumovsky等[1]的研究結(jié)果一致，即pH=5 時(shí)離線WAX-SPE 柱對(duì)PFASs 的吸附效率更高。加載流動(dòng)相pH = 3 時(shí)， WAX-SPE 柱對(duì)各種PFASs 的富集效果最差，特別是對(duì)長鏈PFASs 的富集效率非常低，這可能是因?yàn)殚L鏈PFASs 的pKa gt; 2[28]，在pH = 3 時(shí)難以電離，導(dǎo)致其與WAX 吸附劑的相互作用力顯著下降。因此，本研究采用pH=5 的水溶液為在線SPE 加載流動(dòng)相。

在線SPE 分析過程中，樣品加載時(shí)間會(huì)影響樣品溶液中干擾組分的去除率和目標(biāo)化合物的峰形，加載時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致干擾物質(zhì)無法有效去除，加載時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物損失[27]，并且會(huì)降低樣品分析效率，加載時(shí)間一般以3～5 min 為宜。本研究對(duì)樣品加載時(shí)間（2、4 和6 min）進(jìn)行了考察，如圖3B 所示，親水性強(qiáng)的短鏈PFASs（PFBA、PFPeA 和PFBS）在不同加載時(shí)間條件下的峰面積相差較??；但疏水性強(qiáng)的長鏈PFASs 在加載時(shí)間為6 min 的條件下的效果明顯優(yōu)于2 和4 min，這可能是因?yàn)橐运鳛榧虞d溶劑，對(duì)疏水性化合物的加載效率相對(duì)較低，需要更長的加載時(shí)間。綜合考慮各PFASs 的分析效果和方法的分析效率，本研究確定樣品的加載時(shí)間為6 min。

2.3 樣品制備條件的確定

采用超聲波輔助提取法提取植物葉片樣品中的PFASs 時(shí)，選擇合適的提取溶劑既能促進(jìn)目標(biāo)化合物的提取，又能降低基質(zhì)干擾。甲醇[29-31]和乙腈[17， 22-32]常用于PFASs 的提取，由于PFASs 為酸性化合物，加入少量甲酸可提高提取效率[33]，通過考察含1%甲酸的乙腈溶液和含1%甲酸的甲醇溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)乙腈作為提取溶劑時(shí)方法的穩(wěn)定性不及甲醇，而且在旋蒸時(shí)容易暴沸。因此，本研究選擇含1%甲酸的甲醇溶液作為植物樣品中PFASs 的提取溶劑。

由于植物葉片樣品中葉綠素含量較高，甲醇粗提液一般不能直接進(jìn)行LC-MS/MS 分析，多采用HLB[34]或多孔石墨化碳黑（ENVI-Carb）[35-36]SPE 小柱進(jìn)行樣品除雜處理。本研究采用ENVI-Carb 柱分別對(duì)凈化和未凈化的冬青甲醇粗提液進(jìn)行在線SPE-LC-MS/MS 分析，結(jié)果如圖4A 所示，采用ENVI-Carb 柱（3 mL， 0.25 g，美國Supelclean 公司）凈化時(shí)，樣品中PFBA（137.2%）、PFPeA（130.1%）、PFOA（136.5%）和PFDA（155.0%）的回收率明顯偏高，而長鏈PFODA 的回收率明顯低于未凈化樣品，這可能由于此化合物與ENVI-Carb 吸附材料結(jié)合能力較強(qiáng)，導(dǎo)致此化合物在凈化過程中損失[37]；對(duì)未凈化的冬青甲醇提取液直接進(jìn)行在線SPE-LC-MS/MS 分析，各PFASs 的回收率明顯更好，說明采用WAX-SPE 柱對(duì)植物粗提液進(jìn)行在線凈化也能獲得滿意的檢測(cè)效果，并且縮短了樣品的處理時(shí)間，降低了成本。

樣品復(fù)溶溶劑也是影響PFASs 分析方法穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素，若以純甲醇作為復(fù)溶溶劑會(huì)增大葉綠素等疏水性有機(jī)雜質(zhì)的溶解量，導(dǎo)致基質(zhì)干擾增大；若在復(fù)溶溶劑中加入一定比例的水，則會(huì)降低一部分疏水性化合物的干擾。但是， PFASs 化合物種類多，化學(xué)性質(zhì)差異大，為了既能降低非極性物質(zhì)的干擾，又能盡可能多地將目標(biāo)化合物充分溶解在復(fù)溶溶劑中，對(duì)50%甲醇溶液、70%甲醇溶液和純甲醇溶液作為復(fù)溶溶劑的效果進(jìn)行了比較（圖4B）。結(jié)果表明，采用純甲醇溶液復(fù)溶時(shí)，大部分PFASs 的回收率在110%～190%之間，精密度也較差，并且樣品顏色深，容易對(duì)污染儀器的離子源；對(duì)于短鏈PFASs，采用50%甲醇溶液或70%甲醇溶液復(fù)溶的效果近似；對(duì)于長鏈PFASs，由于其親水性差，導(dǎo)致采用50%甲醇溶液復(fù)溶的回收率明顯低于70%甲醇溶液。因此，本研究選擇70%甲醇溶液作為樣品的復(fù)溶溶劑。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

樣品基質(zhì)復(fù)雜，可能存在基質(zhì)效應(yīng)。在3 份冬青葉片空白基質(zhì)提取液中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，與純甲醇配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行在線SPE-LC-MS/MS 分析比較，以此評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式[37]如下所示：

ME（%） = （As-Ax ） / As × 100 （1）

其中， ME 為基質(zhì)效應(yīng)， Ax 為基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各PFASs 的峰面積， As 為用甲醇配制的相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品中PFASs 的峰面積。ME（%）在0～±20%范圍內(nèi)可忽略不計(jì)，±20%～±50%之間為中等程度基質(zhì)效應(yīng)，gt; 50%或lt; –50%為基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)。結(jié)果表明， 23 種PFASs 均有不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，其中PFBA（92.5%）、PFPeA（85.5%）、HFPO-DA（75.4%）、PFHxA（53.5%）、PFOSA（74.7%）、N-MeFOSAA（63.6%）、N-EtFOSAA（62.1%）和PFODA（51.6%）的基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，其它目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)較小，因此，需采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行實(shí)際樣品中PFASs 的定量測(cè)定。

2.4.2 方法的檢出限、定量限和線性范圍

以冬青葉片樣品為代表，采用空白提取溶液作為基質(zhì)溶液配制不同濃度的PFASs 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2 和0.1 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度均為1.0 ng/mL，由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣。以各組分和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，PFBA 和PFPeA 在0.5～20.0 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其它21 種PFASs 在0.1～20.0 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.990。以3 倍信噪比確定方法的檢出限（LOD， S/N=3）， 10 倍信噪比確定方法的定量限（ LOQ， S/N=10） ， 23 種PFASs 的LOD 為0.02～0.50 μg/kg， LOQ 為0.04～1.47 μg/kg（見電子版文后支持信息表S2）。其中， PFBA 和3 種PFSAs（PFBS、PFHxS 和PFDS）的LOD 略高于其它化合物，這與Zhang 等[14]采用離線固相萃取法對(duì)樹葉中PFASs 的測(cè)定結(jié)果類似，但檢出限略低（0.02～1.43 ng/g）， 說明本方法可以滿足對(duì)植物葉片中PFASs 定量分析的要求。

2.4.3 方法的回收率和精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確度，進(jìn)行低、中、高3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別向冬青葉片樣品中添加2.5、5.0 和25.0 μg/kg 濃度水平的PFASs 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3 節(jié)的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，每個(gè)加標(biāo)水平平行處理3 份，測(cè)定加標(biāo)樣品中各目標(biāo)化合物的濃度，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明， 3 個(gè)加標(biāo)濃度的回收率在64.6%～125.5%之間， RSD 在0.7%～12.8%之間（見電子版文后支持信息表S2），與其它文獻(xiàn)[14，30，38-39]方法（表1）相當(dāng)，說明本方法的回收率和精密度良好，可用于分析實(shí)際植物葉片樣品中的23 種PFASs。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)海洋綠潮藻滸苔和4 種樹葉（單櫻、黃連木、冬青和楊樹）樣品中的23 種PFASs 進(jìn)行測(cè)定，其中，在滸苔樣品中均檢出5 種PFASs，分別為PFBA、PFDA、PFUnDA、PFDoDA 和PFTrDA，含量范圍分別為0.80～2.41 μg/kg、0.25～0.77 μg/kg、0.51～0.53 μg/kg 和0.21～0.27 μg/kg， PFTrDA 含量均為0.13 μg/kg；在單櫻、黃連木和冬青樹葉樣品中均檢出PFBA，其濃度分別為11.97～14.19 μg/kg、10.00～12.92 μg/kg 和3.55～6.19 μg/kg， 楊樹葉樣品中未檢測(cè)到PFBA；4 種樹葉樣品中均檢出PFOA，單櫻、楊樹和冬青樹葉樣品中濃度范圍分別為0.08～0.15 μg/kg、0.24～0.27 μg/kg 和0.16～0.19 μg/kg；只在1 份黃連木葉樣品中檢出PFOA，濃度為0.30 μg/kg。總體而言，在滸苔和4 種樹葉樣品中檢出的PFASs中， PFBA 的濃度最高，這與Tian 等[5]報(bào)道的天津市雙口和寶坻區(qū)域內(nèi)松針、梧桐以及楊樹葉片中PFASs 濃度結(jié)果類似。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化在線SPE 柱填料類型、樣品加載流動(dòng)相的pH 值和樣品加載時(shí)間等條件，成功建立了基于在線WAX-SPE 凈化、LC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定植物葉片粗提物中23 種PFASs 的新方法。結(jié)果表明，植物葉片樣品只需1%甲酸-甲醇溶液超聲提取，無需其它凈化處理即可直接進(jìn)樣分析，簡化了樣品前處理步驟，節(jié)省了人力和物力的消耗。本方法具有良好的精密度、回收率和檢測(cè)靈敏度，適用于不同植物葉片樣品中23 種PFASs 的準(zhǔn)確測(cè)定，為植物葉片中傳統(tǒng)以及新型PFASs 的監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支撐。

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支持信息

申楠 韓同竹 盛璨璨 何秀平 陳軍輝

浙江省污染暴露與健康干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（No. 20220104）和國家自然科學(xué)基金委-山東省聯(lián)合基金項(xiàng)目（No. U1706217）資助。