摘 要： 旨在探究玻璃化冷凍對豬孤雌激活（parthenogenetic activation， PA）囊胚基因表達(dá)的影響。本研究以豬PA囊胚為研究對象，根據(jù)試驗處理分為新鮮組、玻璃化冷凍組Ⅰ和玻璃化冷凍組Ⅱ，隨后從每組挑選3枚形態(tài)良好的囊胚，利用Smart-seq2單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果顯示，玻璃化冷凍組Ⅰ與新鮮組相比，共鑒定到772個差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs），GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些DEGs與細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程、細(xì)胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關(guān)；玻璃化冷凍組Ⅱ與新鮮組相比，共鑒定到1 613個DEGs，主要與糖異生、代謝途徑、氨基酸生物合成等相關(guān)；玻璃化冷凍組Ⅱ與玻璃化冷凍組Ⅰ相比，鑒定到822個DEGs，主要與丙酮酸代謝過程、N-聚糖生物合成、細(xì)胞衰老等相關(guān)。綜上，本研究基于Smart-seq2單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)揭示了玻璃化冷凍對豬PA囊胚脂質(zhì)代謝、能量代謝、MAPK信號通路等相關(guān)基因表達(dá)的影響。

關(guān)鍵詞： Smart-seq2；玻璃化冷凍；豬；孤雌激活；囊胚

中圖分類號： S828.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0366-6964（2024）09-3936-11

Exploring the Effect of Vitrification on Gene Expression in Porcine Parthenogenetic

Blastocysts by Smart-seq2

YANG" Baigao" LONG" Xi1， ZHANG" Liang1， XU" Jiehuan3， DAI" Jianjun3， ZHAO" Xueming2， PAN" Hongmei1*

（1.Chongqing Academy of Animal Sciences， Chongqing 402460，" China;

2.Institute of

Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China;

3.Institute of Animal Science and Veterinary Science， Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 201106，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the effect of vitrification on gene expression in porcine parthenogenetic activation （PA） blastocysts. In this study， porcine PA blastocysts were divided into fresh， vitrification group I and vitrification group II according to the experimental treatments， and then 3 well-morphologised blastocysts were selected from each group and analysed by transcriptome sequencing using Smart-seq2 single-cell full-length transcriptome sequencing technology. As a result， compared with the fresh group， a total of 772 differential expression genes （DEGs） were identified in the vitrification group Ⅰ. GO and KEGG enrichment analysis results showed that these DEGs were related to cellular lipid metabolic process， cell glucose homeostasis， MAPK signaling pathway， PI3K-Akt signaling pathway， etc. Compared with the fresh group， a total of 1 613 DEGs were identified in the vitrification group Ⅱ， which mainly related to gluconeogenesis， metabolic pathways， biosynthesis of amino acids， etc. Compared with the vitrification group Ⅰ， 822 DEGs were identified in the vitrification group Ⅱ， which mainly involved in pyruvate metabolic process， N-Glycan biosynthesis， cellular senescence， etc. In summary， this study revealed the effects of vitrification on the expression of genes related to lipid metabolism， energy metabolism， MAPK signalling pathway and other related genes in porcine PA blastocysts based on Smart-seq2 single-cell full-length transcriptome sequencing technology.

Key words： Smart-seq2; vitrification; pig; parthenogenetic activation; blastocyst

*Corresponding author：PAN Hongmei， E-mail：panhm_2118@163.com

玻璃化冷凍技術(shù)是利用高濃度保護(hù)劑使動物遺傳資源載體在超低溫環(huán)境下凝固形成不規(guī)則玻璃化樣固體，進(jìn)而使其可以在超低溫環(huán)境下長期保存的冷凍保存方法。目前，玻璃化冷凍技術(shù)已成為動物遺傳資源冷凍保存及活體復(fù)原的重要技術(shù)手段，在牛、馬、羊等家畜動物卵母細(xì)胞、精子、胚胎等的保存和傳遞中得到廣泛應(yīng)用。然而，現(xiàn)有玻璃化冷凍技術(shù)在豬胚胎冷凍保存中仍存在不足，如凍后胚胎存活率和孵化率降低［1］。研究顯示，玻璃化冷凍不僅導(dǎo)致豬胚胎線粒體損傷、DNA損傷和細(xì)胞骨架機械損傷［2］，還引起生長發(fā)育、缺氧、線粒體自噬相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變［3］。因此，亟需加快改善現(xiàn)有豬胚胎玻璃化冷凍體系。

豬孤雌激活（parthenogenetic activation，PA）胚胎來源于單卵母細(xì)胞，易于在體外進(jìn)行大批量生產(chǎn)，是研究豬胚胎玻璃化冷凍體系的理想模型。研究表明，相比于桑葚胚和擴(kuò)張囊胚，對豬早期囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍可以獲得更高的孵化率，因此，囊胚期是豬胚胎玻璃化冷凍的理想階段［2］。然而，目前有限的研究未能以單囊胚水平解析玻璃化冷凍對豬PA囊胚基因表達(dá)的影響［4-5］，難以為玻璃化冷凍體系改良提供更為精細(xì)的理論基礎(chǔ)。

隨著單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，Smart-seq2技術(shù)以其高精度、高覆蓋率特點，在人［6］、豬［7］、小鼠［8，9］胚胎研究中受到廣泛應(yīng)用?；诖?，本研究利用Smart-seq2單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對新鮮組、玻璃化冷凍組Ⅰ和玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以期揭示玻璃化冷凍對其轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的影響，為豬胚胎玻璃化冷凍技術(shù)研究和促進(jìn)豬種質(zhì)資源保存進(jìn)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

除特殊說明，所有試劑均購自于美國Sigma公司。

1.2 豬卵母細(xì)胞采集和體外成熟

從屠宰場采集豬卵巢，37 ℃生理鹽水（加入青霉素75 μg·mL-1和鏈霉素50 μg·mL-1）清洗3遍，在2 h內(nèi)運回實驗室。采用10 mL注射器從直徑為2～8 mm的卵泡中抽取卵泡液，采集到的卵泡液靜置15 min后，在體式顯微鏡下挑取含有2～3層卵丘細(xì)胞且胞質(zhì)均勻的豬卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（cumulus-oocyte complexes， COCs）。

COCs在M199中洗滌3次后，每50枚一組移入含500 μL體外成熟（in vitro maturation，IVM）液（M-199含0.1 g·L-1 丙酮酸鈉、0.55 g·L-1 葡萄糖、0.07 g·L-1 半胱氨酸、10 IU·mL-1 FSH、10 IU·mL-1 LH、10 ng·mL-1 EGF和10%豬卵泡液）的培養(yǎng)孔中，隨后在38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)44 h。

1.3 孤雌激活

使用0.1%透明質(zhì)酸酶消化去除COCs中的卵丘細(xì)胞，在M199中充分洗滌，選擇含第一極體且胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞用于孤雌激活（parthenogenetic activation， PA）。卵母細(xì)胞在電激活液（50 μmol·L-1 CaCl2、0.1 mmol·L-1 MgCl2和0.3 mol·L-1甘露醇）中預(yù)清洗30 s，隨后移入電激活池，設(shè)置參數(shù)為1.2 kV·cm-1、30 μs，脈沖一次。電激活后將卵母細(xì)胞移入化學(xué)輔激活液（PZM-3+5 μg·mL-1 CB+10 μg·mL-1放線菌酮）中培養(yǎng)4 h，隨后在PZM-3中繼續(xù)培養(yǎng)6 d后挑選優(yōu)質(zhì)囊胚用于后續(xù)試驗。

1.4 玻璃化冷凍和解凍

玻璃化冷凍：囊胚在冷凍液Ⅰ（PZM-3含7.5% EG、7.5% DMSO、20% FBS）中平衡5 min，在冷凍液Ⅱ（PZM-3含0.4 mol·L-1蔗糖、15% EG、15% DMSO、20% FBS）中平衡20 s，隨后移至Cryotop載片，迅速投入液氮。

玻璃化解凍：將含囊胚的Cryotop載片浸入37 ℃預(yù)熱解凍液Ⅰ（PZM-3含0.3 mol·L-1蔗糖、20% FBS），輕輕晃動使囊胚滑落，平衡3 min，隨后移入37 ℃解凍液Ⅱ（PZM-3含0.15 mol·L-1蔗糖、20% FBS），平衡3 min后用PZM-3洗滌3次，隨后在PZM-3中培養(yǎng)24 h，挑選形態(tài)恢復(fù)良好的囊胚用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。

玻璃化冷凍組Ⅰ豬PA囊胚按照上述步驟進(jìn)行冷凍和解凍，玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚采用實驗室改良冷凍液（在冷凍液Ⅰ和冷凍液Ⅱ基礎(chǔ)上添加組分以提高其熱傳遞效率等，申請專利號：202311731656.6）進(jìn)行，玻璃化冷凍程序不變。

樣本收集：從新鮮組（AA）、玻璃化冷凍組Ⅰ（BB）和玻璃化冷凍組Ⅱ（CC）中各選取3枚形態(tài)良好的囊胚，在每管裂解液中放入1枚胚胎，共收集9份測序樣本。

1.5 單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建及上機測序

RNA反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增：在裂解液中加入CA磁珠，充分震蕩后離心5 min，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用AMPure XP磁珠純化PCR產(chǎn)物，采用Fragment Analyzer 1.0.2.9對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后用于文庫構(gòu)建。

文庫構(gòu)建及測序：根據(jù)廠商說明，利用KAPA Hyper Prep Kits （KK8504）試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，對cDNA進(jìn)行片段化、PCR 富集、AMPure XP 磁珠純化分選片段等步驟后，利用Fragment Analyzer（1.0.2.9）對文庫大小進(jìn)行質(zhì)檢，片段主要分布在300～700 bp之間，隨后利用極客基因科技有限公司illlumina Novaseq6000 PE150平臺進(jìn)行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用Trimmomatic（v0.39）對原始reads進(jìn)行過濾，去除adapter序列、低質(zhì)量的堿基和受污染的序列。隨后使用STAR（v2.7.9a）將過濾后的reads映射到到豬參考基因組Sscrofa11.1上，參數(shù)為：-runThreadN 30-alignIntronMax 100000-chimSegmentReadGapMax parameter 3-alignSJstitchMismatchNmax 5-1 5 5。利用featurets（v1.6.5）計算表達(dá)量，使用StringTie（v2.1.7）獲得標(biāo)準(zhǔn)化基因水平FPKM值，采用DEseq2計算基因表達(dá)差異，以log2（FC）≥1和Plt;0.01為差異顯著?；贕ene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫，利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因功能分析。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)

從9個測序樣本中總共獲得34 830萬條讀數(shù)，過濾后保留23 226萬條讀數(shù)，Q20在98.93%～99.22%之間，Q30在96.61%～97.49%之間，比對到豬參考基因組（Sscrofa11.1）的讀數(shù)在80.15%～91.76%之間。本研究中使用的原始數(shù)據(jù)已上傳到CNSA數(shù)據(jù)庫，項目號為：CNP0005353。

2.2 新鮮組、玻璃化冷凍組Ⅰ、玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚轉(zhuǎn)錄組差異分析

與新鮮組相比，從玻璃化冷凍組Ⅰ豬PA囊胚中鑒定到772個差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs），其中686個上調(diào)，86個下調(diào)（圖1A，圖2A，表1）；與新鮮組相比，從玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚共鑒定到781個上調(diào)基因，832個下調(diào)基因（圖1A，圖2B，表2）；與玻璃化冷凍組Ⅰ相比，從玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚鑒定到131個上調(diào)基因，691個下調(diào)基因（圖1A，圖2C，表3）。此外，基于玻璃化冷凍組Ⅰ vs._新鮮組差異基因集，在玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚中有607個基因的表達(dá)水平與新鮮組相近（圖1B，圖3）。

2.3 基因功能分析

通過GO富集分析，與新鮮組相比，玻璃化冷凍組Ⅰ豬PA囊胚中的差異表達(dá)基因被富集到59個生物學(xué)過程（biological process， BP）條目，如激酶活性的正向調(diào)節(jié)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、蛋白質(zhì)自磷酸化等；30個細(xì)胞組分（cellular component， CC）條目，如受體復(fù)合物、基底外側(cè)質(zhì)膜、雙細(xì)胞緊密連接等；47個分子功能（molecular function， MF）條目，如ATP結(jié)合、跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白激酶活性等（圖4A）。

而玻璃化冷凍組Ⅱ與新鮮組相比，差異表達(dá)基因被富集到糖異生、細(xì)胞遷移、蛋白質(zhì)泛素化等133個BP條目；細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等72個CC條目；金屬離子結(jié)合、丙酮酸羧化酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等77個MF條目（圖4B）。此外，玻璃化冷凍組Ⅱ與玻璃化冷凍組Ⅰ相比，差異表達(dá)基因被富集到丙酮酸代謝過程、糖異生、脂質(zhì)代謝過程等53個BP條目；溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等29個CC條目；丙酮酸羧化酶活性、生物素結(jié)合、O-?；D(zhuǎn)移酶活性等26個MF條目（圖4C）。

通過KEGG富集分析，與新鮮組相比，玻璃化冷凍組Ⅰ豬PA囊胚中差異表達(dá)基因被富集到35條信號通路，如胞吞作用、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等（圖5A）。玻璃化冷凍組Ⅱ與新鮮組相比，差異表達(dá)基因被富集到87條信號通路，如代謝途徑、氨基酸的生物合成、碳代謝等（圖5B）。玻璃化冷凍組Ⅱ與玻璃化冷凍組Ⅰ相比，差異表達(dá)基因被富集到13條信號通路，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、N-聚糖生物合成、MAPK信號通路等（圖5C）。

3 討 論

3.1 Smart-seq2單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

相較于常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為解析細(xì)胞分子機制提供了更精細(xì)的視角。Smart-seq2是Picelli等［10］基于Smart-seq改良的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，具有高靈敏度、準(zhǔn)確性和全長覆蓋率等優(yōu)點，受到廣泛關(guān)注。Li等［11］利用Smart-seq2測序技術(shù)揭示了玉米赤霉烯酮對綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育的損傷機制。Yang等［7］通過Smart-seq2測序技術(shù)解析了豬對稱及不對稱2細(xì)胞期胚胎的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異。Smart-seq2測序技術(shù)是研究動物卵母細(xì)胞、胚胎分子機制的有力手段。

現(xiàn)有研究表明，玻璃化冷凍導(dǎo)致卵母細(xì)胞、胚胎基因表達(dá)發(fā)生改變。Jia等［12］的研究顯示，玻璃化冷凍引起豬未成熟卵母細(xì)胞成熟率降低，其AQP1、MEF2C、MT1A等基因的表達(dá)發(fā)生改變。Xu等［13］的研究顯示，原核受精卵階段進(jìn)行玻璃化冷凍會降低其后續(xù)發(fā)育率以及4細(xì)胞和8細(xì)胞期胚胎的整體轉(zhuǎn)錄活性。豬體內(nèi)胚胎基因表達(dá)也會受玻璃化冷凍影響發(fā)生變化［3］。易于體外批量生產(chǎn)的豬PA囊胚是加快豬胚胎玻璃化冷凍體系發(fā)展的理想研究模型。然而，鮮有報道基于單胚胎轉(zhuǎn)錄組水平研究玻璃化冷凍對豬PA囊胚基因表達(dá)的影響。

本研究采用Smart-seq2測序技術(shù)對新鮮組、玻璃化冷凍組Ⅰ、玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以期探究玻璃化冷凍對豬PA囊胚基因表達(dá)的影響。

3.2 玻璃化冷凍對豬PA囊胚基因表達(dá)的影響

與其他哺乳動物相比，豬胚胎內(nèi)含有大量以脂滴形式存在的脂質(zhì)，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［14-15］。與新鮮組相比，玻璃化冷凍組Ⅰ豬PA囊胚中BBS1、SREBF1、ANGPTL3等23個差異表達(dá)基因參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、甘油三脂穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過程。BBS1編碼脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，其缺失引起膜相關(guān)蛋白的積累［16］，以及小鼠體重和脂肪的增加［17］。SREBF1參與脂肪合成，在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其缺失導(dǎo)致脂肪合成受阻及相關(guān)復(fù)合物的脂質(zhì)組成發(fā)生變化［16，18］。ANGPTL3編碼分泌蛋白家族成員，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，其缺失導(dǎo)致小鼠脂肪酸生成增加［19］，ANGPTL3還參與胎兒發(fā)育過程［20］。表明玻璃化冷凍可能導(dǎo)致豬PA囊胚的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而影響其發(fā)育能力［21］。

ATP是胚胎發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子，如胚胎細(xì)胞增殖、凋亡等［22］。在玻璃化冷凍豬PA囊胚中，C1QTNF12、GCK、NDUFS6等81個差異表達(dá)基因參與ATP結(jié)合、ATP酶活性、細(xì)胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)功能。C1QTNF12參與調(diào)節(jié)葡萄糖水平，其在豬卵巢顆粒細(xì)胞（GC）中表達(dá)并通過激活蛋白激酶B（Akt）促進(jìn)GC增殖和MAPK3/1信號通路促進(jìn)孕酮、睪酮、雌二醇的分泌［23］。GCK參與糖代謝，GCK調(diào)節(jié)己糖6-磷酸水平，是胰腺β細(xì)胞中的葡萄糖傳感器，其突變可導(dǎo)致葡萄糖糖代謝失調(diào)［24］。NDUFS6是線粒體電子傳遞鏈的酶復(fù)合物亞基，參與ATP生成，其缺失引起細(xì)胞衰老［25］。已有研究表明，玻璃化冷凍導(dǎo)致豬胚胎中ATP水平降低［2，26］，這可能與能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的異常有關(guān)。

細(xì)胞結(jié)構(gòu)是細(xì)胞生物學(xué)活動的功能基礎(chǔ)，在玻璃化冷凍組Ⅰ豬PA囊胚中，ACTG2、CLDN18、ADRM1等基因的表達(dá)下調(diào)（表1）。ACTG2編碼的γ肌動蛋白，是細(xì)胞骨架的組成部分；CLDN18編碼膜蛋白，主要參與構(gòu)成緊密鏈接，調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運和溶質(zhì)滲透性以及細(xì)胞骨架［27］，在玻璃化冷凍過程中保護(hù)細(xì)胞骨架有助于豬胚胎發(fā)育［28］。ADRM1編碼粘附調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘性［29］。此外，玻璃化冷凍引起豬PA囊胚M(jìn)APK信號通路（FGF10、MAPK12、DUSP7等）、PI3K-Akt信號通路（ITGA6、LAMC1、MAGI1等）等重要信號通路相關(guān)基因表達(dá)水平的改變。MAPK通路活性參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，Mo等［30］的研究顯示，利用白血病抑制因子LIF可通過MAPK途徑介導(dǎo)改善牛胚胎體外發(fā)育。Wang等［31］的研究顯示，MAPK3參與人胚胎干細(xì)胞的維持。PI3K-Akt不僅在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮重要作用，也參與隨后的胚胎發(fā)育，PI3K抑制導(dǎo)致胚胎發(fā)育能力降低［32］。因此，由玻璃化冷凍引起的豬PA囊胚細(xì)胞結(jié)構(gòu)、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路相關(guān)基因表達(dá)水平的變化可能影響其發(fā)育能力。

3.3 玻璃化冷凍液成分參與影響豬PA囊胚基因表達(dá)

為了探究玻璃化冷凍液成分的變化是否參與影響豬PA囊胚基因表達(dá)，本研究在玻璃化冷凍組Ⅰ的冷凍液基礎(chǔ)上調(diào)整冷凍液成分，進(jìn)行玻璃化冷凍組Ⅱ試驗并分析其基因表達(dá)水平。

與新鮮組相比，玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚中有1 613個DEGs，差異顯著性最高的上、下調(diào)基因中，SLC30A9的表達(dá)水平高于新鮮組和玻璃化冷凍組Ⅰ，表明其可能具有更高的鋅離子調(diào)節(jié)活性［33］，研究表明適量補充鋅可促進(jìn)豬胚胎體外發(fā)育［34］。MKNK2編碼蛋白是MAP激酶激活的下游激酶之一，其上調(diào)可能促進(jìn)MAPK通路活性，已經(jīng)證明其在卵巢癌中促進(jìn)細(xì)胞增殖［35］。ZYX參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，其缺失導(dǎo)致胚胎形態(tài)缺陷［36］，ZYX還通過Akt/mTOR通路調(diào)控細(xì)胞增殖［37］，其下調(diào)可能引起胚胎發(fā)育障礙。FTL編碼鐵蛋白輕鏈，參與細(xì)胞鐵吸收、存儲和釋放，F(xiàn)TL下調(diào)可誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞死亡［38］。MRPL28編碼線粒體核糖體蛋白，參與調(diào)節(jié)線粒體活性［39］；PFKL在糖酵解中催化D-果糖6-磷酸向果糖1-6-二磷酸的轉(zhuǎn)化，兩者的下調(diào)可能引起豬PA囊胚ATP水平下降［40］。此外，其余DEGs參與子宮內(nèi)胚胎發(fā)育（NOTCH2、ACVR1、SMAD4等）、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)（PRKCE、LMNA、PDGFB等）、糖酵解/糖異生信號通路（MINPP1、GPI、PFKL等）等生物學(xué)功能。

與玻璃化冷凍組Ⅰ相比，在玻璃化冷凍組Ⅱ豬PA囊胚中有822個DEGs（圖1A），差異顯著性最高的上下調(diào)基因中，RAB21編碼蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和能量平衡，其缺失影響葡萄糖攝取和自噬通量增加［41］，自噬水平穩(wěn)態(tài)對胚胎發(fā)育至關(guān)重要［42］，而玻璃化冷凍誘導(dǎo)的自噬異常影響胚胎發(fā)育［43］，SNX18表達(dá)水平的改變可能影響胚胎自噬水平［44］。PCNP［45］和USP3［46］參與蛋白質(zhì)泛素化，PCNP通過與β-catenin結(jié)合激活Wnt/β-actin通路，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生殖，抑制凋亡［47］；USP3參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［48］。SLC30A9參與子線粒體鋅離子轉(zhuǎn)運，其缺失引起線粒體鋅離子失衡以及ROS生成增加［49-50］。此外，其余DEGs參與糖異生（PC、SLC25A11）、氧化還原酶活性（POR、HSD17B1、OSGIN1等）、細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)（TFAP2A、LAMA5、TFAP2C等）、細(xì)胞凋亡過程（PPP1R15A、BRAT1、EMP2等）、MAPK信號通路（RET、PLA2G4F、MAP3K1）等生物學(xué)功能。玻璃化冷凍組Ⅱ與玻璃化冷凍組Ⅰ之間部分基因的表達(dá)水平存在差異，基于BB_vs._AA DEGs，在玻璃化冷凍組Ⅱ中有607個基因的表達(dá)水平與新鮮組相近（圖1B），表明兩者之間具有不同的基因表達(dá)模式，這可能是冷凍液成分變化所致。

綜上所述，玻璃化冷凍引起豬PA囊胚脂質(zhì)代謝、能量代謝、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關(guān)基因表達(dá)水平的改變，可能影響其隨后發(fā)育能力。此外，通過比較玻璃化冷凍組Ⅰ和玻璃化冷凍組Ⅱ轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異，表明玻璃化冷凍液成分的改變可能參與影響豬PA囊胚基因表達(dá)。

4 結(jié) 論

本研究利用Smat-seq2單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組技術(shù)揭示了玻璃化冷凍對豬PA囊胚脂質(zhì)代謝、能量代謝、MAPK信號通路等相關(guān)基因表達(dá)的影響，同時發(fā)現(xiàn)璃化冷凍液成分的變化參與影響豬PA囊胚的基因表達(dá)。本研究為改善豬胚胎玻璃化冷凍技術(shù)提供一定理論基礎(chǔ)。

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（編輯 郭云雁）