摘 要： 旨在建立豬輪狀病毒（porcine rotavirus， PoRV）的抗體檢測方法。本研究以PoRV截短的VP6*（aa149-332）蛋白作為檢測抗原，建立PoRV抗體的間接ELISA檢測方法。結(jié)果顯示：截短的重組VP6*（aa149-332）以包涵體和可溶性兩種形式存在，大小為22.5 ku。優(yōu)化后的ELISA反應條件：VP6*（aa149-332）包被量為25 ng·孔-1，抗原4 ℃過夜包被，5%脫脂奶粉溶液37 ℃封閉2 h，待檢血清1∶400稀釋、37 ℃孵育30 min，酶標羊抗鼠IgG二抗1∶24 000稀釋、37 ℃孵育30 min，顯色15 min。試驗確定陰陽性臨界值OD450 nm=0.418，可檢測到抗體的最大稀釋度為1∶3 200，批內(nèi)和批間重復變異系數(shù)均小于10%，并具有較好的特異性。28份血清與Western blot結(jié)果符合率為 96.42%。ELISA OD450 nm值與中和抗體效價log2相關系數(shù)R2=0.878 5。綜上所述，本研究建立的PoRV抗體間接ELISA具有較高的特異性和敏感性，可應用于PoRV的臨床血清樣本抗體檢測。

關鍵詞： 豬輪狀病毒；VP6*蛋白；間接ELISA；原核表達

中圖分類號：S852.659.4;S854.43

文獻標志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4021-08

Prokaryotic Expression of Recombinant VP6* Protein of Porcine Rotavirus and Establishment of Indirect ELISA Detection Method

GAO" Liguo1， SHEN" Hanqin2， CHEN" Yiquan1， CHEN" Sheng1， LIN" Wencheng1， CHEN" Feng1*

（1.College of Animal Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China;

2.Guangdong Jingjie Inspection and Testing Co.， Ltd， Yunfu 527400，" China）

Abstract：" This study was designed to establish an antibody detection method for porcine rotavirus （PoRV）. We utilized the truncated VP6* （aa149-332） protein of PoRV as the detection antigen to develop an indirect ELISA detection method for PoRV antibodies. The truncated recombinant VP6* （aa149-332） exists in two forms： inclusion bodies and soluble， with a size of 22.5 ku. The ELISA reaction conditions were as follows： the antigen was coated at 25 ng/well and left overnight at 4 ℃， the wells were blocked with 5% skimmed milk at 37 ℃ for 2 hours， the test serum was diluted 1∶400 and incubated at 37 ℃ for 30 minutes， the secondary antibody was diluted 1∶24 000 and incubated at 37 ℃ for 30 minutes，

The optimized reaction conditions of the ELISA were as follows： the optimal coating antigen concentration， coating time and temperature were found to be 25 ng per well， and left overnight at 4 ℃; the plates were blocked with 5% skimmed milk at 37 ℃ for 2 hours; the optimal dilution of test serum and the secondary antibody were found to be 1∶400 and 1∶24 000， respectively. The optimal incubation time and temperature for test serum and the secondary antibody were 30 minutes and 37 ℃， respectively，

and the color development time was 15 minutes. Testing 30 negative sera determined the cutoff value at OD450 nm=0.418， the maximum dilution of detectable antibodies is 1∶3 200. The intra-batch and inter-batch coefficient of variation were both less than 10%， and it exhibited good specificity. The agreement rate with Western Blot results for 28 sera was 96.42%. The correlation coefficient （R2） between ELISA OD450 nm values and neutralizing antibody log2 values was 0.878 5. In summary， the indirect ELISA established in this study for detecting porcine rotavirus antibodies has high specificity and sensitivity， making it applicable for clinical sample testing of porcine rotavirus.

Key words： porcine rotavirus; VP6* protein; indirect ELISA; prokaryotic expression

*Corresponding author：" CHEN Feng， E-mail： fengch@scau.edu.cn

輪狀病毒（rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，為雙鏈RNA病毒（dsRNA），基因組包括11個RNA片段［1］。自50年前發(fā)現(xiàn)輪狀病毒以來，輪狀病毒被認為是嬰兒和兒童發(fā)病率和死亡率的主要原因，特別是在發(fā)展中國家［2］。Woode等在1976年首次從感染的豬中分離到豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV），隨后PoRV在多個國家和地區(qū)的豬場傳播［3-6］。PoRV感染主要引起仔豬腹瀉、嘔吐等癥狀，從而導致仔豬成活率和日增重下降［7-8］。PoRV在我國豬場仍廣泛存在，給我國養(yǎng)豬行業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失［9-10］。目前，對PoRV的防控主要以免疫預防為主，無特異治療藥物［11］。因此，建立快速、靈敏的PoRV診斷方法檢測PoRV流行情況及抗體水平，對PoRV的防控至關重要。

PoRV的基因組編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～4、VP6和VP7）和6種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1～NSP6）［12-14］。其中VP6蛋白是中心核衣殼蛋白，占病毒結(jié)構(gòu)蛋白的51%，具有高度保守性，是臨床檢測的重要抗原［15］。VP6全長原核表達以包涵體形式存在，蛋白復性過程繁瑣且影響蛋白活性［16］。因此，本研究以PoRV-YT株的VP6*（aa149-332）基因片段作為目的基因，構(gòu)建截短的VP6*（aa149-332）基因原核達質(zhì)粒并在大腸桿菌中進行表達與純化，得到了以可溶性形式存在的VP6*（aa149-332）蛋白，并以此蛋白作為包被抗原建立PoRV血清IgG抗體間接ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株及試劑

pET-28a（+）表達載體、E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）（常州基宇生物科技有限公司；NdeⅠ、XhoⅠ、MluⅠ、T4 DNA連接酶（TaKaRa）；NiIDA Beads 6 FF（天地人和生物科技有限公司）；鼠抗 His-tag mAb*（Genscript公司）；HRP標記的羊抗鼠IgG（Sigma公司）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；HRP標記羊抗豬IgG酶標二抗（Seracare）；豬輪狀病毒（PoRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus， TGEV）、豬丁型冠狀病毒（porcine deltacoronavirus， PDCoV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）陽性血清均由本實驗室制備。豬輪狀病毒分離株CHN/YT/2022由本實驗室保存，MARC-145細胞購買于武漢尚恩生物技術有限公司，并于本實驗室保存。

1.2 重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

VP6*（aa149-332）基因由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。VP6*（aa149-332）基因合成產(chǎn)物、pET-28a（+）載體膠回收產(chǎn)物分別經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ進行雙酶切，回收片段經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接2h連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布于LB平板，37℃過夜培養(yǎng)；次日隨機挑取單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（含30 μg·mL-1卡那霉素），37 ℃振搖過夜，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒進行測序分析。

分別用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切處理VP6*（aa149-332）基因合成產(chǎn)物和pET-28a（+）載體，隨后在16 ℃下用T4 DNA連接酶連接2 h，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞，于LB平板培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)；隨機挑取單個菌落，接種于含30 μg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定分析。

1.3 VP6*（aa149-332）重組蛋白的誘導表達及純化

將鑒定正確的重組原核表達質(zhì)粒pET-28a（+）-VP6*（aa149-332）及pET-28a（+）空載體分別轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)，挑取單一菌落至LB液體培養(yǎng)基（30 mg·mL-1卡那霉素），37℃振搖培養(yǎng)至OD600 nm≈0.6，加入終濃度0.5 mmol·mL-1 IPTG，25℃誘導過夜。分別取1 mL誘導前與誘導后菌液，離心收集菌體，以0.01 mol·L-1 PBS（pH 7.4）重懸菌體并進行冰浴超聲破碎至清亮不黏稠。裂解物10 000×g離心30 min，分別收集上清和沉淀，進行12% SDS-PAGE 分析。將重組菌pET-28a（+）-VP6*（aa149-332）-BL21在37℃條件下用終濃度為1 mmol·L-1的IPTG誘導4 h，經(jīng)超聲后提取破碎上清，過鎳柱純化VP6*（aa149-332）蛋白作為抗原。純化后的蛋白用SDS-PAGE分析其純度，用紫外分光光度計測定純化后的蛋白的質(zhì)量濃度。

在37 ℃培養(yǎng)3 h至菌液濃度OD600 nm≈0.6，加入終濃度1 mmol·mL-1 IPTG，25 ℃過夜誘導。離心收集菌體并以0.01 mol·L-1 PBS（pH 7.4）重懸，進行冰浴超聲破碎。裂解物10 000×g離心30 min，分別收集上清和沉淀，上清過鎳柱純化獲得的VP6*（aa149-332）蛋白作為抗原。SDS-PAGE分析純化后VP6*（aa149-332）蛋白的純度，用紫外分光光度計測定純化后的VP6*（aa149-332）蛋白的質(zhì)量濃度。

1.4 Western blot鑒定分析VP6*（aa149-332）

表達的重組VP6*（aa149-332）蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用鼠抗His-tag單抗（1∶2 000稀釋）為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶5 000稀釋）為二抗進行蛋白鑒定分析。

1.5 基于VP6*（aa149-332）的間接ELISA的建立

1.5.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定" 對間接ELISA方法的最佳VP6*（aa149-332）的包被條件、HRP標記羊抗豬IgG二抗和作用條件、血清最佳作用條件、封閉條件進行優(yōu)化。

1.5.2 間接ELISA結(jié)果判定標準的確定" 用上述建立的間接ELISA對30份經(jīng)病毒中和試驗呈PoRV陰性血清進行檢測。計算檢測樣品的平均值（）和標準差（s），得出陽性臨界值（＋3s），當檢測樣品的OD450 nm值＞＋3s時可在99.9％的可信度上判定為陽性。

1.5.3 間接ELISA重復性試驗" 用同一批次包被的ELISA板分別檢測3份PoRV陽性血清，以確保批次內(nèi)重復性。用包被不同批次的純化VP6*（aa149-332）蛋白的ELISA板，分別檢測3份PoRV陽性血清，以確保批次間重復性。

1.5.4 間接ELISA敏感性分析" PoRV陽性血清分別以1∶100連續(xù)稀釋2倍至1∶6 400，每個稀釋梯度3次重復，以PoRV陰性血清為對照進行敏感性試驗。

1.5.5 間接ELISA特異性試驗" 在相同條件下，用“1.5”建立的基于重組VP6*（aa149-332）蛋白的ELISA方法對常見豬病毒——PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV的陽性血清進行檢測，同時設PoRV的陰性血清、陽性血清對照和空白對照。

1.5.6 檢測符合率試驗" 取28份豬血清樣品，使用“1.5”建立的基于重組VP6*（aa149-332）蛋白的ELISA方法進行檢測，同時通過Western blot（以豬血清為一抗，以HRP標記羊抗豬IgG作為酶標二抗，方法同“1.4”）平行檢測該28份豬血清樣品。分析2種方法檢測的符合率。

1.5.7 臨床樣本的檢測" 利用本研究“1.5”建立的基于重組VP6*（aa149-332）蛋白間接ELISA檢測方法對本實驗室保存的180份豬血清進行檢測，其中含88份待產(chǎn)母豬血清和92份斷奶仔豬血清。

1.5.8 間接ELISA與中和試驗的相關性" 選取24份OD450 nm值不同的血清檢測PoRV的中和抗體效價。將24份血清的OD450 nm值與中和抗體效價做相關性分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達質(zhì)粒的鑒定

用NdeⅠ/XhoⅠ分別雙酶切目的基因和pET28a（+）空載體，用膠回收試劑盒純化回收酶切片段，經(jīng)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到E. coli BL21感受態(tài)細胞中獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)MluI/XhoI雙酶切，如圖1所示出現(xiàn)大小約為1 452和4 399 bp片段用T4連接酶連接酶切片段，轉(zhuǎn)化到E. coli BL21感受態(tài)細胞中獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)MluⅠ/XhoⅠ雙酶切，如圖1所示出現(xiàn)大小約為1 452和4 399 bp的DNA片段，與預期結(jié)果相符，證明獲取了陽性重組質(zhì)粒。

2.2 重組蛋白的誘導表達及Western blot鑒定

IPTG誘導重組菌，經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳檢測，如圖2A可見到相對分子質(zhì)量為22.5 ku的目的蛋白條帶，與預期相符，且目的蛋白以包涵體和可溶性兩種形式存在。蛋白樣品經(jīng)Western blot檢測，顯色后出現(xiàn)單一且特異的清晰目的條帶，結(jié)果如圖2B。純化后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1。

2.3 間接ELISA檢測方法的優(yōu)化及臨界值的確定

經(jīng)條件篩選，經(jīng)條件篩選，采用0.25 μg·mL-1的抗原——重組VP6*（aa149-332）蛋白4 ℃過夜包被。在4 ℃下用5%脫脂奶粉溶液中封閉過夜，待檢樣品和標準品按1∶400稀釋，酶標二抗稀釋1∶24 000，樣品反應時間為30 min，二抗作用時間為30 min，底物作用時間為15 min。采用建立的PoRV間接ELISA方法檢測30份陰性血清，確定臨界值。經(jīng)計算，最終平均OD450 nm值（）為0.201，標準差（s）為0.072，確定陰性與陽性的臨界值（＋3s）OD450 nm=0.418。若樣本OD 450 nm值＞0.418時，判為陽性；若OD450 nm值＜0.418時，判為陰性。

2.4 重復性試驗

對3份血清用“1.5”建立的ELISA進行重復性試驗，每份血清做3孔重復。批內(nèi)和批間血清OD450 nm值的變異系數(shù)均小于10%，表明批內(nèi)重復性和批間重復性均良好。

2.5 敏感性分析

對已知的豬輪狀病毒陽性血清，自1∶100開始"" 做連續(xù)稀釋，做3個重復，按照“1.5”建立的間接ELISA進行檢測，計算OD450 nm，Ｐ/OD450nm，N值。結(jié)果顯示，當陽性血清稀釋至1∶3 200的時候，OD450 nm的值大于0.418，OD450 nm，Ｐ/OD450 nm，N值大于2，仍可將其判斷為陽性，表明該方法可檢測到抗體的最大稀釋度為1∶3 200（結(jié)果未展示）。

2.6 特異性試驗

對PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV的陽性血清用“1.5”建立的間接ELISA進行檢測，檢測結(jié)果如表1所示，建立的間接ELISA只與PoRV陽性血清反應，而不與PEDV、TGEV、PDCoV和PRRSV陽性血清發(fā)生反應，方法的特異性良好，不存在交叉反應。

2.7 符合率試驗

取28份豬血清樣品，采用“1.5”建立的間接ELISA與Western blot（見“1.5.6”）平行檢測，以驗證方法的準確性，結(jié)果顯示：Western blot檢測到13份陽性血清，15份陰性血清；間接ELISA方法檢測到14份陽性血清，14份陰性血清，2種方法總符合率為96.42%（表2）。

2.8 臨床樣本檢測

對180份臨床血清樣品用“1.5”建立的間接ELISA進行檢測，其中含88份待產(chǎn)母豬血清和92份斷奶仔豬血清。結(jié)果如表3所示：總陽性率為46.11%（83/180），其中待產(chǎn)母豬和斷奶仔豬血清樣品陽性率分別為65.90%（58/88）和27.17%（25/92）。斷奶仔豬血清中的PoRV抗體陽性率顯著低于待產(chǎn)母豬血清。

2.9 間接ELISA 與中和試驗檢測結(jié)果的相關性分析

取24份血清樣品，分別平行進行間接ELISA和病毒中和試驗，分析OD450 nm值與病毒中和抗體效價的相關性，結(jié)果如圖3顯示，OD450nm值與中和抗體效價呈線性相關，相關系數(shù)R2=0.8785。

3 討 論

近年來，豬輪狀病毒仍在我國廣泛流行，很多省份及地區(qū)都有豬輪狀病毒傳播的相關報道，給我國養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了較大經(jīng)濟損失［17-20］。劉小蘭等［7］報道，在江西某發(fā)生仔豬腹瀉的豬場鑒定并成功分離一株G9P［23］基因型豬輪狀病毒。樊高等［21］報道在廣東某豬場采集仔豬腹瀉樣本為豬輪狀病毒陽性。周群等在四川40多個豬場采集303份病料，其中98份病料為輪狀病毒陽性，陽性率為32.34%［10］。豬輪狀病毒可破壞豬小腸細胞，使腸絨毛萎縮，降低小腸消化吸收能力，從而引起仔豬腹瀉，降低養(yǎng)殖生產(chǎn)效益［22-23］。因此，建立快速、靈敏的豬輪狀病毒的抗體檢測方法，對豬輪狀病毒防控至關重要。

據(jù)報道，黃曉星［24］通過原核表達輪狀病毒VP7蛋白建立豬輪狀病毒血清IgG抗體的間接ELISA檢測方法。崔蕾［25］通過原核表達豬輪狀病毒VP8蛋白建立豬輪狀病毒血清IgG抗體的間接ELISA檢測方法。豬輪狀病毒流行基因型種類較多，不同基因型豬輪狀病毒之間VP7及VP4（VP8）基因差異較大［22］。VP6蛋白是輪狀病毒中心核衣殼蛋白，具有高度保守性，利用原核表達全長VP6蛋白主要以包涵體形式存在，蛋白復性過程繁瑣且影響蛋白活性［16，26］。原霖［27］通過桿狀病毒表達VP6蛋白建立豬輪狀病毒血清IgA抗體間接ELISA檢測方法。本研究以原核表達截斷的VP6*（aa149-332）蛋白，呈可溶性和包涵體兩種形式，且和豬輪狀病毒陽性血清發(fā)生特異性反應。在此基礎上，作者以VP6*（aa149-332）蛋白作為包被抗原，建立了豬輪狀病毒血清IgG抗體的間接ELISA檢測方法。

本研究以VP6*（aa149-332）蛋白為包被抗原建立ELISA檢測方法，并優(yōu)化了ELISA反應條件。特異性試驗顯示，本研究建立的間接ELISA方法不與PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV等常見豬病毒的陽性血清發(fā)生反應，該方法的特異性良好。靈敏性試驗顯示，該方法可檢測到抗體的最大稀釋度為1∶3 200。批間與批內(nèi)重復性試驗結(jié)果顯示，該方法的變異系數(shù)均小于10%，重復性良好。該間接ELISA檢測方法與Westblot blot檢測結(jié)果的符合率為96.42%。通過該方法對180份臨床血清進行檢測，PoRV抗體總陽性率為46.11%（83/180），其中待產(chǎn)母豬血清PoRV抗體陽性率為65.90%（58/88），斷奶仔豬血清PoRV抗體陽性率為27.17%（25/92）。ELISA抗體與中和抗體效價log2相關性試驗顯示相關系數(shù)R2=0.8587?？傊摍z測方法可用于確定豬輪狀病毒對豬的感染，對豬輪狀病毒抗體水平監(jiān)測，為豬輪狀病毒防控提供技術支持。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了pET-28a（+）-VP6*（aa149-332）重組原核表達質(zhì)粒，表達純化了豬輪狀病毒截短的VP6*（aa149-332）蛋白，以VP6*（aa149-332）蛋白為包被抗原建立了豬輪狀病毒血清IgG抗體間接ELISA檢測方法，可用于豬輪狀病毒感染的檢測和對豬輪狀病毒抗體水平的監(jiān)測。

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（編輯 白永平）