摘 要： 為了解新出現(xiàn)的H3N3亞型禽流感病毒（AIV）的遺傳變異特征，對(duì)2022—2023年分離鑒定的H3亞型AIV進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析，并對(duì)代表株進(jìn)行了抗原差異分析。結(jié)果共分離鑒定出15株家禽源和1株野鳥源H3N3亞型AIV。全基因遺傳演化分析結(jié)果顯示，16株分離株均屬于歐亞分支，其HA基因均源自H3N8亞型AIV，與人源H3N8亞型AIV的核苷酸相似性為97.3%～99.2%；NA基因均源自H10N3亞型AIV，與人源H10N3亞型毒株的核苷酸相似性為98.1%～98.4%；內(nèi)部基因片段均來(lái)自H9N2亞型AIV。分離株HA基因裂解位點(diǎn)均符合低致病性AIV的分子特征。分離毒株存在多個(gè)能增強(qiáng)病毒對(duì)哺乳動(dòng)物適應(yīng)性及致病性的突變位點(diǎn)，如PB2蛋白的A588V和E627V突變、PB1蛋白的I368V和S375N突變等?？乖町愋苑治鼋Y(jié)果表明，分離株與華東地區(qū)早期流行株的HI抗體滴度相差1 log2～3 log2。因此，本研究分離的16株H3N3亞型AIV均為三源重組病毒，由H9N2亞型AIV提供全部?jī)?nèi)部基因，毒株存在多個(gè)哺乳動(dòng)物適應(yīng)性及致病性增強(qiáng)的突變，并已傳播給野禽。本研究揭示了新型H3N3亞型AIV的遺傳特征、變異和多宿主分布情況，為禽流感的防控提供理論支持。

關(guān)鍵詞： 禽流感病毒；新型；H3N3亞型；基因變異；抗原變異

中圖分類號(hào)： S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4029-12

Genetic Variation Analysis of Sixteen Novel H3N3 Subtype Avian Influenza Viruses

ZHAO" Kangning" YANG" Zhonglong" CHEN" Yi" ZHU" Chuncheng" GUO" Yunfei

YIN" Yuncong" QIN" Tao" CHEN" Sujuan1，2*， PENG" Daxin1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China;

2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal，

Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：" In order to understand the genetic variation characteristics of the newly emerged H3N3 subtype avian influenza virus （AIV）， we conducted whole-genome sequence analysis of H3 subtype AIV isolated during 2022-2023， and analyzed antigenic differences among representative strains. A total of 15 strains of H3N3 subtype AIV from poultry origin and 1 strain from wildfowl origin were isolated and identified. Phylogenetic analysis of the whole genome revealed that all 16 isolates belonged to the Eurasian lineage， with the HA gene derived from H3N8 subtype AIV， sharing a nucleotide homology of 97.3% to 99.2% when compared to human H3N8 subtype AIV isolates. The NA gene was derived from H10N3 subtype AIV， with a nucleotide homology of 98.1% to 98.4% when compared to human H10N3 subtype AIV isolates. The internal gene segments were all derived from H9N2 subtype AIVs. The cleavage sites of the HA gene of the isolates are consistent with the molecular characteristics of low pathogenic AIV. The isolated strains have multiple mutation sites that can enhance the adaptability and pathogenicity of the virus in mammals， such as the A588V and E627V mutations in the PB2 protein， the I368V and S375N mutations in the PB1 protein. Antigenic difference analysis showed that the isolates had HI antibody titers 1 log2-3 log2 different from those of earlier circulating strains in East China. Therefore， all 16 strains of H3N3 AIVs in this study are triple-recombinant viruses， with H9N2 AIV serving as the donor for all internal genes， and they harbor multiple amino acid mutations that enhance their adaptability and pathogenicity in mammals. These strains have already spread to wildfowl. This study reveals the genetic characteristics， variation and multi host distribution of the novel H3N3 AIVs， providing theoretical support for the prevention and control of avian influenza.

Key words： avian influenza virus; novel type; H3N3 subtype; genetic variation; antigenic variation

*Corresponding authors：" CHEN Sujuan， E-mail： chensj@yzu.edu.cn; PENG Daxin， E-mail： pengdx@yzu.edu.cn

禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）是正黏病毒科A型流感病毒屬的重要成員，其基因組由8個(gè)單股負(fù)鏈的RNA片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS）構(gòu)成，容易發(fā)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換［1］，是一種引起禽類感染和疾病綜合征的重要病原［2］。AIV血清型眾多，目前，可分成16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型［3］。AIV的宿主范圍廣泛，主要感染家禽和野禽，偶爾感染哺乳動(dòng)物。因野禽種類繁多，是許多亞型AIV的自然儲(chǔ)存宿主，再加之候鳥遷徙路徑復(fù)雜［4］，中國(guó)處于多個(gè)候鳥遷徙帶上，家禽和野禽接觸的機(jī)會(huì)多，為病毒的傳播和重組提供了有利條件。H3亞型AIV在全球水禽中廣泛流行［5］，在中國(guó)多個(gè)地區(qū)的家禽和野禽中持續(xù)存在，不僅危害養(yǎng)禽業(yè)，還對(duì)多種哺乳動(dòng)物甚至人類構(gòu)成潛在的公共衛(wèi)生威脅［6］，有必要對(duì)其進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。

近期，本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)華東地區(qū)AIV的監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，H3N3亞型AIV突然出現(xiàn)且逐漸增多。為深入了解監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)的H3N3亞型AIV的遺傳變異情況，本研究對(duì)分離株進(jìn)行了全基因序列測(cè)定，與人源H3和H10亞型毒株進(jìn)行比較分析，并和實(shí)驗(yàn)室早期分離株進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)分析其抗原性。研究為進(jìn)一步了解H3N3亞型AIV的遺傳變異特點(diǎn)以及禽流感的防控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與引物

RNA提取試劑盒和DNA Gel Extraction Kit購(gòu)自Axygen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑（RRI）及Taq DNA聚合酶購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；無(wú)酶無(wú)菌水購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DL1000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix、T3載體購(gòu)自TransGen公司；胎牛血清、MEM（Minimum essential medium， MEM）培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Media）高糖培養(yǎng)液（2×）購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；其余相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品；AIV的反轉(zhuǎn)錄引物為12堿基特異性引物：5′-AGCAAAAGCAGG-3′，其余基因片段擴(kuò)增依據(jù)上傳序列設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增測(cè)序毒株基因的PCR引物，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司（南京分部）合成。

1.2 樣品和雞胚

樣品源于2022年12月—2023年5月江蘇省某活禽交易市場(chǎng)的隨機(jī)抽樣、華東地區(qū)野禽棲息地的新鮮野禽糞便樣品以及畜禽門診臨床病例樣品。SPF種蛋購(gòu)自浙江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司，于本實(shí)驗(yàn)室孵化至9～10日齡。

1.3 病毒的分離與鑒定

試驗(yàn)使用SPF雞胚分離AIV，具體方法參照高致病性禽流感診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB-T18936-2020）第6章操作流程與標(biāo)準(zhǔn)。通過血凝抑制試驗(yàn)（HI）對(duì)樣品的單一性進(jìn)行初步鑒定，混合感染的樣品采用空斑法進(jìn)行病毒純化。

1.4 病毒RNA的提取、RT-PCR、克隆及序列測(cè)定

取各病毒尿囊液200 μL使用Axygen試劑盒抽提AIV總RNA，具體流程見Axygen說明書。使用試劑盒提取病毒全基因組RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為PCR擴(kuò)增模板，參照錢忠明［7］、Qiu等［8］的方法通過RT-PCR試驗(yàn)進(jìn)行AIV 血凝素（hemagglutinin， HA）及神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase， NA）基因亞型的鑒定。

用1%濃度的瓊脂糖，對(duì)全基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢后對(duì)目的條帶進(jìn)行回收，按DNA Gel Extraction Kit的說明書進(jìn)行。對(duì)膠回收的PCR產(chǎn)物，用分光光度計(jì)測(cè)定其DNA濃度，當(dāng)濃度達(dá)到≥50 ng·μL-1符合測(cè)序要求后，將PCR回收產(chǎn)物連同引物送北京擎科生物技術(shù)有限公司（南京分部）進(jìn)行雙向測(cè)序；若回收的PCR產(chǎn)物濃度較低，則將回收產(chǎn)物連接到T3 Easy Vector并轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，具體方法參見T3 Easy Vector說明書。在IPTG+、X-gal+和Amp+ LB平板上挑取白色菌落，以常規(guī)方法小提質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ 酶切鑒定正確后，陽(yáng)性質(zhì)粒送北京擎科生物技術(shù)有限公司（南京分部）測(cè)序。

1.5 基因序列的拼接比對(duì)、分子特性和遺傳演化分析

應(yīng)用在線生物信息學(xué)工具NetNGlyc1.0 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/），基于“N-X-S/T”（X不為P）的氨基酸序列，對(duì)毒株的HA、NA基因上的潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。應(yīng)用Lasergene 7.1軟件對(duì)雙向測(cè)序的基因片段進(jìn)行拼接，通過GenBank中的BLAST工具查找測(cè)序基因序列的同源性較近的序列，應(yīng)用PhyloSuite軟件進(jìn)行序列的比對(duì)并選出最佳的檢測(cè)算法，應(yīng)用IQ-TREE繪制遺傳演化樹。

1.6 交叉血凝抑制試驗(yàn)

通過制備新型H3N3亞型AIV A/chicken/NanTong/NT02101/2023（H3N3）（NT02101）的抗血清與實(shí)驗(yàn)室早期分離的毒株A/chicken/Jiangsu/W23910/2017（H3N2）（W23910）以及抗血清進(jìn)行HI試驗(yàn)測(cè)定交叉HI抗體效價(jià)。其中NT02101來(lái)源于發(fā)病雞群、W23910來(lái)源于活禽市場(chǎng)雞群。研究使用甲醛滅活病毒后，制成油包水型油乳劑滅活疫苗，免疫21日齡SPF雞，在14、21 d分別測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)HI抗體效價(jià)大于8 log2后，采血制備抗血清測(cè)定交叉HI抗體效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 H3N3亞型禽流感病毒鑒定

通過血凝、血凝抑制試驗(yàn)及RT-PCR方法，對(duì)2022年12月—2023年5月在華東地區(qū)活禽交易市場(chǎng)（live bird markets， LBMs）、動(dòng)物醫(yī)院的臨床病料、野禽棲息地分離的陽(yáng)性樣品進(jìn)行分離鑒定，共獲得16株H3N3亞型AIV，其中雞源病毒14株，鴨源病毒1株，野禽源病毒1株（表1）。

2.2" HA、NA基因序列分析

2.2.1 HA基因序列分析

序列測(cè)定結(jié)果顯示，AIV分離株的HA基因ORF全長(zhǎng)為1 701 bp，編碼566個(gè)氨基酸，HA1區(qū)編碼344個(gè)氨基酸，HA2區(qū)編碼221個(gè)氨基酸，不存在核苷酸插入和缺失現(xiàn)象。分析顯示分離株的HA蛋白裂解模式有兩種，其中13株為340PEKQTR↓GLF348、3株為340PEKQTR↓GIF348，均只有1個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性AIV的分子特征［9］。

潛在糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果表明，HA肽鏈上均具有5個(gè)保守的潛在N-糖基化位點(diǎn)，分別位于HA1編碼區(qū)的22、38、165、285和HA2編碼區(qū)的483位，與禽源毒株A/duck/Fujian/SD063/2017（H3N3）和A/chicken/Jiangsu/W23910/2017（H3N2）相比缺少6位潛在糖基化位點(diǎn)，W23910單獨(dú)存在第2位潛在糖基化位點(diǎn)。

AIV HA基因的HA1球狀區(qū)的頂端為受體結(jié)合部位，包括190螺旋（第190～198位）、130環(huán)（第135～138位）和220環(huán)（第221～228位）三個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)原件，以及其它保守的氨基酸位點(diǎn)（Y98、W153、H183與Y195）［10］，參考人源H3亞型流感病毒（A/Achi/2/68）的HA基因的氨基酸序列，對(duì)分離到的16株H3N3亞型AIV的HA基因上受體結(jié)合位點(diǎn)的情況進(jìn)行了比對(duì)。分析顯示AIV分離株226Q和228G均為典型的禽型受體結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)先結(jié)合α-2，3-半乳糖唾液酸受體。與禽源毒株SD063和W23910相比，分離株的右側(cè)臂均發(fā)生了G137S的改變。

根據(jù)已確定于HA1球狀頭部的5個(gè)抗原決定簇，對(duì)分離株的HA蛋白相關(guān)抗原表位進(jìn)行分析［11］，分析發(fā)現(xiàn)分離株與禽源毒株SD063和W23910相比均發(fā)生了T83K、G137S和N159S的改變，此外野禽源分離株還出現(xiàn)了Q189X的突變，YZ032702出現(xiàn)了E275G的突變。

2.2.2 NA基因序列分析

16株H3N3亞型AIV的NA基因ORF全長(zhǎng)1 410 bp，共編碼469個(gè)氨基酸。對(duì)16株H3N3亞型AIV的NA基因上的潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，H3N3分離株NA序列均存在14、57、66、72和146位潛在糖基化位點(diǎn)，與禽源參考株A/duck/Fujian/SD063/2017（H3N3）相比增加了14位潛在糖基化位點(diǎn)，有12株分離株出現(xiàn)308位潛在糖基化位點(diǎn)的缺失。

NA蛋白的神經(jīng)氨酸酶催化活性位點(diǎn)包括第118、151、152、224、276、292、371和406位等催化部位，此外還有酶活性中心周圍輔助位點(diǎn)，分別為第119、156、178、179、198、222、227、274、277、294和425位［12-13］。分析發(fā)現(xiàn)，16株H3N3亞型分離株的NA基因均未出現(xiàn)氨基酸的替換。

2.3 核苷酸同源性分析

研究將分離鑒定的16株H3N3亞型AIV與2021和2022年報(bào)道的人源H3N8亞型AIV A/China/CSKFQ-22-5/2022（H3N8）（CSKFQ-22-5）、A/China/ZMD-22-2/2022（H3N8）（ZMD-22-2）和H10N3亞型AIV A/China/0428/2021（H10N3）（0428）進(jìn)行核苷酸序列的對(duì)比分析。結(jié)果顯示分離毒株的HA基因與人源H3N8毒株CSKFQ-22-5和ZMD-22-2的核苷酸相似性分別為97.3%～98.2%和97.4%～99.2%；分離株的NA基因與人源毒株0428的核苷酸相似性最高，為98.1%～98.4%；PB2基因中有5株分離株與人源H3N8毒株CSKFQ-22-5的核苷酸相似性最高，為98.8%～98.9%；分離株P(guān)B1基因與毒株CSKFQ-22-5的核苷酸相似性在92.5%～99.2%；有10株P(guān)A基因與ZMD-22-2毒株的核苷酸相似性高于98.0%；NP基因中有6株分離株與人源分離株0428的核苷酸相似性介于98.3%～98.5%；分離株的M基因與人源H3N8毒株ZMD-22-2的相似性最高，為98.1%～99.1%；NS基因中有3株分離株與人源H10N3毒株0428的核苷酸相似性為97.8%～97.9%。有4株分離株與人源H3N8毒株ZMD-22-2的核苷酸相似性最高，為97.5%～97.6%。

2.4 遺傳演化分析

分析結(jié)果顯示，16株H3N3亞型AIV均屬于歐亞分支。其HA基因與北美AIV分支、豬流感病毒（SIV）分支和人源流感病毒分支的距離較遠(yuǎn)，分離株的核苷酸相似性為96.9%～100%，氨基酸相似性為97.1%～100%。16株分離株與人源H3N8亞型AIV CSKFQ-22-5和ZMD-22-2處于同一個(gè)分支中（圖1 a）；16株NA基因的核苷酸相似性為97%～100%，氨基酸相似性為96.8%～100%。分離株與A/chicken/China/189-6/2021（H10N3）和A/Environment/China/04940NA/2021（H10N3）毒株的同源率最高，與人源H10N3 AIV 0428處于同一分支（圖1 b）。

內(nèi)部基因的遺傳演化分析顯示，分離株的PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因均與H9N2亞型AIV處于同一個(gè)分支，人源H3N8毒株CSKFQ-22-5、ZMD-22-2和人源H10N3毒株0428的內(nèi)部基因也位于H9N2亞型AIV的分支當(dāng)中（圖1、2）。

2.5 內(nèi)部基因關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

PB2基因氨基酸序列分析結(jié)果表明，所有毒株均具有保守的318R、256D、271T、333T、591Q、627E、675L、683T和701D位點(diǎn)，為典型的禽源病毒特征［14-16］。分離株均存在L89V、I292V、G309D、T339K、R477G、I495V、A588V（SY01除外）和V598T/I等影響病毒致病力、聚合酶活性、宿主適應(yīng)性以及在哺乳動(dòng)物中的復(fù)制和對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生高致病性的關(guān)鍵位點(diǎn)突變。此外，有近一半的分離株出現(xiàn)了E627V突變，SY01還出現(xiàn)了K526R突變；PB1基因共同表現(xiàn)出13P、198K的位點(diǎn)特征以及I368V、S375N、H436Y和L473V的突變。有3株在171位氨基酸為I，其余13株為171M；分離株的PA基因均出現(xiàn)A100V、R142K、L295P、N383D、K552T、S631G和F666L的突變，部分分離株還存在K356R和S409N的氨基酸突變；在NP基因中，分離株均出現(xiàn)M105V、A184K、V286A、H289Y和M437T的突變；分離株的M1基因存在N30D、I43M和T215A突變，M2基因存在S31N、P64S和L69P突變；在NS1基因中分離株均表現(xiàn)P42S、D97E、C138F、V149A和N209D的氨基酸突變。

2.6 抗原性分析

交叉血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株NT02101和W23910制備的抗血清，與自身抗原的HI效價(jià)都達(dá)到9 log2以上。NT02101的抗血清與華東地區(qū)早期流行株W23910的HI抗體滴度相差約3 log2，W23910的抗血清與新型H3N3亞型AIV的HI抗體滴度相差1 log2～2 log2（表2）。

3 討 論

H3亞型流感病毒廣泛存在于多種宿主中，通常以隱性感染狀態(tài)存在，為病毒基因重排提供了有利的條件［17］。與此同時(shí)，活禽交易市場(chǎng)的存在也為候鳥等野鳥、水禽和家禽提供了交叉感染不同亞型AIV的場(chǎng)所，也增加了AIV與人類接觸的頻率［18］。近期人感染H3亞型AIV的事件時(shí)有報(bào)道，如2022年河南省、湖南省均出現(xiàn)的人感染H3N8亞型AIV病例［19-20］，2023年世界衛(wèi)生組織也有報(bào)道H3N8亞型AIV致人死亡的病例，可見H3亞型AIV對(duì)公共衛(wèi)生安全存在明顯威脅。候鳥作為AIV的天然宿主，在其演化、維持和傳播中起著重要作用［21］，候鳥與家禽的接觸給AIV的基因交換創(chuàng)造了有利條件，可能導(dǎo)致新型AIV的產(chǎn)生［22］。實(shí)驗(yàn)室在對(duì)華東地區(qū)AIV的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，近幾年來(lái)除了H5、H9亞型AIV仍然存在外，H3亞型AIV出現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)，其中H3N3亞型AIV在2022年12月份突然出現(xiàn)，并在之后持續(xù)增多。值得注意的是，研究在候鳥遷徙路徑的新鮮糞便中也分離到了一株H3N3亞型AIV，這提示H3N3亞型AIV已在野禽界面?zhèn)鞑?，可能造成更大范圍的流行?/p>

本研究對(duì)華東地區(qū)分離的16株H3N3亞型AIV進(jìn)行了全基因組的擴(kuò)增，并與人源H3、H10亞型毒株進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，分離株的HA基因裂解位點(diǎn)僅存在1個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性AIV的分子特征。遺傳演化分析表明，分離株的HA基因與2022年在華東和華南地區(qū)流行的H3N8亞型AIV的相似性最高，推測(cè)分離株的HA基因來(lái)源于H3N8亞型AIV。NA基因與H10N3亞型AIV的相似性最高，并且與之前報(bào)道的H3N3亞型AIV的NA來(lái)源均不同，毒株位于不同的遺傳演化分支，有研究指出近兩年H10N3亞型AIV在華東地區(qū)存在廣泛流行［23］，推測(cè)H3亞型AIV很可能與H10N3亞型AIV發(fā)生基因重排，產(chǎn)生新型重組的H3N3亞型AIV。這提示我們也需要加強(qiáng)對(duì)H10N3亞型AIV的監(jiān)測(cè)，該亞型也很可能與H5或其他亞型AIV發(fā)生重排；有研究表明H9N2亞型AIV不僅可以作為其他AIV的供體，也可參與新型

AIV的產(chǎn)生［24-25］，如1997年中國(guó)香港暴發(fā)的高致病性H5N1禽流感、2013年人類感染的H7N9亞型禽流感，以及近年來(lái)在中國(guó)華東地區(qū)檢測(cè)到的高致病性H5N2 AIV等，它們的內(nèi)部基因均來(lái)自H9N2亞型AIV［26-27］，這些以H9N2亞型AIV為母本的毒株對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了巨大威脅。本研究分離株的內(nèi)部基因絕大多數(shù)與H9N2亞型AIV的內(nèi)部基因核苷酸相似性最高，少部分毒株與H3N8等亞型AIV的核苷酸相似性接近，但通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些亞型AIV的內(nèi)部基因也來(lái)源于H9N2亞型AIV，這與遺傳演化分析的結(jié)果一致，分離株的內(nèi)部基因均來(lái)源于H9N2亞型AIV。由此可見本研究分離的H3N3亞型AIV是以H9N2亞型AIV為內(nèi)部基因的新型三源重組病毒。分離株的HA基因與人源H3N8毒株遺傳距離接近，NA基因與人源H10N3毒株處于同一個(gè)演化分支，其內(nèi)部基因與人源毒株均位于同一分支，且具有較高的相似性，這提示H3N3亞型分離株具備感染人的潛在可能。

關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，新型H3N3亞型分離株的NA基因均存在K110E的位點(diǎn)突變，有研究表明該位點(diǎn)突變可增強(qiáng)NA蛋白的活性［28］；分離株的PB2基因中普遍存在L89V、T339K、R477G、I495V和A588V的突變，研究表明這些突變可以增強(qiáng)對(duì)哺乳動(dòng)物的毒力和體內(nèi)復(fù)制效率［29-30］。此外，分離株還存在I292V、G309D和V598T/I等突變，研究表明I292V和G309D突變可以增強(qiáng)H7N9亞型AIV在哺乳動(dòng)物中的傳播能力，而V598T/I突變可以提高病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高聚合酶的活性［31-33］。野禽分離株SY01還出現(xiàn)了K526R的突變，研究表明該突變能增強(qiáng)病毒對(duì)小鼠的毒力［34］，可見野禽的遷徙對(duì)病毒的變異具有推動(dòng)作用。需要注意的是，有近一半分離株的PB2基因存在E627V突變，研究表明，E627V突變位于禽源標(biāo)記E和哺乳動(dòng)物標(biāo)記K之間，這種突變可顯著增強(qiáng)病毒在哺乳動(dòng)物中的適應(yīng)性［35］；所有分離株均表達(dá)了全長(zhǎng)PB1-F2蛋白，分離株P(guān)B1基因中的13P、171M、198K等位點(diǎn)和I368V、S375N等突變，都是對(duì)哺乳動(dòng)物高致病性的特征［36-38］。分離株均發(fā)生了L473V的氨基酸替換，這可能使病毒更易于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制［39］。有研究指出H436Y突變會(huì)增強(qiáng)病毒對(duì)鴨的致病性和傳播性［40］，本研究的分離株均存在此突變；PA基因所編碼的病毒蛋白與流感病毒的宿主特異性和適應(yīng)性密切相關(guān)。分離株P(guān)A基因的變異包括A100V、R142K、L295P、K356R、S409N、K552T、S631G和F666L等，這些突變均與哺乳動(dòng)物高致病性相關(guān)［38-39，41-43］，研究指出分離株存在的N383D突變可增加病毒在鴨中的毒力［44］；NP基因在AIV內(nèi)部基因中相對(duì)保守，是宿主細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別的主要抗原，在流感病毒感染中起到重要的作用。在研究NP基因片段對(duì)毒力的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)NP基因A184K和N319K的氨基酸突變是增強(qiáng)H5亞型AIV對(duì)小鼠致病力的關(guān)鍵，本次分離株的184位均為K，而319位氨基酸則較為保守，仍為氨基酸N［45-46］。分離株均表現(xiàn)出M105V、V286A、H289Y和M437T的突變，研究表明M105V突變可能增加對(duì)雞的致病性［47］，H289Y突變是小鼠的適應(yīng)性突變［48］，V286A和M437T突變會(huì)增加病毒對(duì)小鼠的毒力［49］；研究表明M1基因的N30D、I43M和T215A以及M2基因的P64S和L69P突變可以增加病毒對(duì)小鼠的毒力［41，50-51］，本研究分離株均存在以上突變；NS基因一般認(rèn)為與高致病性禽流感病毒（HPAIV）的毒力有關(guān)，研究指出NS1中P42S、D97E、F103L、I106M、C138F和V149A的氨基酸突變均能夠增強(qiáng)AIV對(duì)雞和小鼠的致病力［52-53］，N209D突變會(huì)增加病毒在小鼠上的復(fù)制和致死率［54］，分離株NS1基因中均存在P42S、D97E、C138F、V149A和N209D等突變；M2基因的第26、27、30、31和34位是M2蛋白中可能影響離子通道阻斷劑（金剛烷胺和金剛乙胺）抗性的突變位點(diǎn)，分離株均發(fā)生S31N的突變［55］，表明毒株獲得了對(duì)離子通道阻斷劑的抗性；在HA基因抗原位點(diǎn)中野禽分離株出現(xiàn)Q189X的突變、YZ032702出現(xiàn)E275G的突變，分離株的NA基因均增加第14位NTT潛在糖基化位點(diǎn)，有8株分離株在NA上缺失第308位NET潛在糖基化位點(diǎn)，以上變化是否導(dǎo)致病毒在生物學(xué)功能的差異，還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證；綜上所述，新型H3N3亞型分離株的病毒基因組包含多個(gè)增強(qiáng)病毒對(duì)哺乳動(dòng)物適應(yīng)性和致病性的突變。這表明新型H3N3亞型AIV適應(yīng)哺乳動(dòng)物的潛力顯著增加，其對(duì)公共衛(wèi)生安全的威脅潛力也越大。

抗原性分析結(jié)果表明，新型H3N3亞型AIV比華東地區(qū)早期流行的H3N2亞型AIV的HI抗體滴度相差1 log2～3 log2，存在較小的抗原差異性。有研究表明糖基化會(huì)顯著影響受體結(jié)合和前體HA0蛋白的裂解，從而進(jìn)一步影響病毒的抗原性［56］。在流感病毒中，抗原決定簇和受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)與病毒的演化和毒力相關(guān)［57］。新型H3N3亞型AIV與早期H3N2亞型流行株W23910相比存在第2位和第6位HA蛋白潛在糖基化位點(diǎn)的缺失，在HA基因受體結(jié)合位點(diǎn)的右側(cè)臂上存在氨基酸的差異，在HA1區(qū)抗原位點(diǎn)的第83、137、159、160、193和275位的氨基酸種類均不相同，共涉及到4個(gè)抗原決定簇位點(diǎn)。HA基因的受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原位點(diǎn)氨基酸的突變使分離株的抗原特性發(fā)生改變。這提示新型H3N3亞型AIV發(fā)生了一定程度的抗原變異。

4 結(jié) 論

本研究在華東地區(qū)分離的16株AIV是以H9N2亞型AIV為內(nèi)部基因，以H3N8亞型AIV的HA和H10N3亞型AIV的NA重排產(chǎn)生的新型H3N3亞型AIV。分離株的氨基酸位點(diǎn)存在多個(gè)對(duì)哺乳動(dòng)物適應(yīng)性和致病性的突變，與人源H3亞型和H10亞型毒株具有較高的同源率，處于相同的演化分支，毒株具備感染人的潛在可能，對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅。

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（編輯 白永平）