摘 要： 為探究Rab32對禽偏肺病毒C型（aMPV/C）復制的影響，將A549細胞接種aMPV/C后進行激光共聚焦顯微鏡觀察，并用Image J軟件對所采集圖像的共定位系數(shù)進行分析；將pCMV-Flag-Rab32、pCMV-Flag、siRab32以及siNC分別轉染A549細胞后接種aMPV/C，分別采用熒光定量PCR（qPCR）、Western blot和TCID50檢測收集樣品中aMPV/C N基因轉錄水平、aMPV/C N和Rab32蛋白的表達水平以及病毒效價；將pCMV-mcherry-Rab32分別與可融合表達GFP的aMPV/C結構蛋白的重組載體共轉染A549細胞，24 h后采用激光共聚焦顯微鏡觀察；將pCMV-Flag-Rab32分別與可融合表達GFP的aMPV/C結構蛋白的重組載體共轉染HEK293T細胞，36 h后收集細胞樣進行免疫共沉淀試驗。結果顯示，Rab32與aMPV/C在細胞質(zhì)中存在明顯的共定位；Rab32與aMPV/C的共定位系數(shù)極顯著高于未接毒組（Plt;0.01）；過表達Rab32后aMPV/C N基因轉錄水平，Rab32和N蛋白表達水平以及病毒效價均極顯著升高（Plt;0.01）；而干擾Rab32表達后，N基因的轉錄水平，Rab32和N蛋白的表達水平以及病毒效價均極顯著降低（Plt;0.01）；Rab32可與多個aMPV/C 蛋白（N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）在細胞質(zhì)中存在共定位，而與L3蛋白無明顯共定位；IP樣品中表達N和M2-2蛋白的樣品出現(xiàn)特異性條帶，其他蛋白無特異性條帶。綜上表明Rab32可能通過與aMPV/C N和M2-2蛋白之間的互作從而調(diào)控病毒的復制。相關研究結果可為深入闡明Rab32調(diào)控aMPV/C復制的分子機理提供研究基礎。

關鍵詞： Rab32；禽偏肺病毒C型；復制；表達水平；互作

中圖分類號： S852.659.5

文獻標志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4041-10

Effect of Rab32 on the Replication of Avian Metapneumovirus Type C

FENG" Xufei 4， QI" Yuxiang3， YU" Hanzhe3， ZHANG" Zhengzhou3， WANG" Rujia3， MENG" Chuang4， DONG" Kui1，2*

（1.School of Public Health，Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，" China;

2.College of veterinary medicine （institute of comparative medicine）， Yangzhou University，

Yangzhou 225009，" China;

3.Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou University，

Yangzhou 225009，" China;

2. Key Laboratory of Coal Environmental Pathogenicity and Prevention of Ministry of Education，

Shanxi Medical University， Taiyuan， 030001， China;

3. College of Veterinary

Medicine （Institute of Comparative Medicine）， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China;

4.Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis， Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：" To investigate the effect of Rab32 on the replication of avian metapneumovirus type C （aMPV/C）， confocal images were obtained and co-localization coefficients were analyzed by Image J software after infected with A549 cells by aMPV/C. Furthermore， the plasmids of pCMV-Flag-Rab32 or pCMV-Flag as well as siRab32 or siNC RNA sequences were transfected into A549 cells before aMPV/C infection， respectively. The transcription level of aMPV/C N gene， the expression level of aMPV/C N and Rab32 proteins， and the viral titers in collected samples were detected by quantitative real-time PCR （qPCR）， Western blot， and the half tissue culture infective dose （TCID50） method， respectively. Then， the plasmids of pCMV-mcherry-Rab32 and GFP-tagged aMPV/C proteins were co-transfected into A549 cells before conducting confocal imaging， respectively. Subsequently， the plasmids of pCMV-Flag-Rab32 and GFP-tagged aMPV/C proteins were co-transfected into HEK293T cells before collecting cell samples at 36 h post-transfection and conducting the co-immunoprecipitation assay. The results showed that obvious co-localized fluorescent signals of Rab32 and aMPV/C were observed in the cytoplasm. The co-localization coefficients of Rab32 and N proteins were significantly higher than that of mock-infected group. The transcription level of the N gene， the expression level of Rab32 and N proteins， and the viral titers were significantly increased （Plt;0.01） after overexpression of Rab32， respectively. On the contrary， the transcription level of the N gene， the expression level of Rab32 and N proteins， and the viral titers were significantly decreased （Plt;0.01） after knockdown expression of Rab32， respectively. Obvious co-localized fluorescent signals of Rab32 and aMPV/C proteins （N， F， M， G， SH， P， M2-1， M2-2， L1， L2， and L4） were observed in the cytoplasm， while scarcely co-localized signals of Rab32 and L3 protein were found. Specific bands of N and M2-2 proteins were found in immunoprecipitation samples while no bands of other GFP-tagged aMPV/C proteins were found. These results indicating that Rab32 interacts with aMPV/C N and M2-2 proteins. In summary， Rab32 might affect aMPV/C replication by interacting with multiple viral proteins （N and M2-2）. The relevant results can provide the basis for elucidating the mechanism of Rab32 regulating aMPV/C replication via protein interaction.

Key words： Rab32; avian metapneumovirus type c; replication; expression level; interaction

*Corresponding author：" DONG Kui， E-mail： sxdongkui@163.com

禽偏肺病毒C型（avian metapneumovirus type C，aMPV/C）屬于副黏病毒科，肺炎病毒亞科，偏肺病毒屬，是一種單股負鏈RNA病毒，其基因組大小約13 kb，共編碼9個結構蛋白，分別為核蛋白（N）、磷蛋白（P）、囊膜蛋白（M）、融合蛋白（F）、小膜蛋白1（M2-1）、小膜蛋白2（M2-2）、小疏水蛋白（SH）、糖蛋白（G）、大蛋白（L）。鳥類感染該病毒后可引起明顯的產(chǎn)蛋量降低和呼吸道癥狀。在我國，雞群和鴨群體內(nèi)均檢測到該病毒的感染，嚴重威脅我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［1-3］。

Rab蛋白是一大類GTP酶依賴性膜運輸相關蛋白。目前為止，哺乳動物體內(nèi)共鑒定出大約60個不同的Rab成員。這些Rab蛋白定位于不同的細胞器/亞細胞區(qū)室，與真核細胞內(nèi)的貨物分選、囊泡出芽、囊泡形成、囊泡運輸以及囊泡與靶膜的對接、系結和融合等生物學過程密切相關［4］。其中，Rab32在調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細胞器（如線粒體、高爾基體）的接觸、自噬體的形成以及溶酶體相關細胞器（如黑素體）的生物過程中發(fā)揮了重要的作用［5-6］。此外，Rab32 也參與了調(diào)控病原對宿主的感染過程。研究顯示，Rab32可特異性靶定于包裹沙門菌的囊泡膜上，抑制宿主細胞內(nèi)鼠傷寒沙門菌的復制［7］。而沙門菌的SopD2蛋白在不改變宿主細胞內(nèi)Rab32總量的情況下，以抑制Rab32向包裹沙門菌囊泡膜招募的方式促進其復制［8］。同樣，Rab32可定位于結核分枝桿菌的吞噬體表面，招募組織蛋白酶D（一種溶酶體蛋白酶）靶向該吞噬體的轉運，抑制該病原的進一步感染與復制［9］。然而，Rab32 是否影響aMPV/C的復制目前尚不清楚。因此，該研究聚焦于宿主因子Rab32，旨在探索Rab32是否參與調(diào)控aMPV/C的復制。

1 材料與方法

1.1 細胞、質(zhì)粒及病毒

本研究所使用的細胞系分別為人胚腎細胞（HEK-293T）、非洲綠猴腎細胞（Vero）、人非小細胞肺癌細胞（A549）。重組質(zhì)粒pCMV-Flag-Rab32、pCMV-Flag、pCMV-GFP-C3、pCMV-mcherry-Rab32以及融合表達GFP的aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3、L4）的重組質(zhì)粒均由本實驗室保存。aMPV/C JC株由本實驗室保存［10］。

1.2 主要試劑

HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、CCK-8 Cell Counting Kit、Trizol裂解液、180 kDa Plus Prestained Protein Marker以及ECL 化學發(fā)光試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；aMPV/C N蛋白鼠單克隆抗體（mAb），由本實驗室自制并保存；Flag mAb、GFP mAb、GAPDH 兔多克隆抗體（pAb）以及Rab32 pAb均購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體、Alex488標記的驢抗兔IgG抗體、Alex546標記的驢抗鼠IgG抗體均購自上海生工生物有限公司；轉染試劑jet PRIME和INTERFERin均購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；RIPA蛋白裂解液、NP-40蛋白裂解液以及4×蛋白上樣緩沖液均購自碧云天生物技術有限公司；Rab32 siRNA（GCUAGUGGCUCUGUAACUUTT）和siNC（UUCUCCGAACGUGUCACGU）均購自蘇州吉瑪生物技術有限公司。

1.3 引物的設計與合成

分別根據(jù)NCBI中人源GAPDH mRNA（NM_002046.7）和aMPV/C JC株N基因（MZ274340.1）序列，分別設計一對引物用于定量擴增GAPDH和 aMPV/C N基因。引物由擎科生物科技有限公司合成（表1）。

1.4 Rab32與aMPV/C的共定位分析

將A549細胞（1×104個·孔-1）接種于共聚焦小皿中，待其匯合度達到60%以上時接種aMPV/C（MOI 1），感染48 h后收集細胞樣品。經(jīng)40 g·L-1多聚甲醛固定，2 mL·L-1 Triton X-100 37℃破膜和50 g·L-1脫脂奶室溫封閉2 h后，用aMPV/C N mAb和Rab32 pAb（1∶100）4℃孵育過夜，經(jīng)Alex546標記的驢抗鼠IgG和Alex488標記的驢抗兔抗體（1∶400）室溫孵育2 h，DAPI染色15 min后，用激光共聚焦顯微鏡觀察和拍照。同時設置無病毒感染對照。隨后用Image J軟件對aMPV/C N蛋白和Rab32的共定位系數(shù)進行分析。

1.5 細胞活力的測定

按照CCK-8 Cell Counting Kit的操作指南測定細胞活力。測定方法如下：將A549細胞（1×103個·孔-1）接種于96孔板中，待其匯合度達到80%左右時采用轉染試劑jet PRIME（或INTERFERin）分別將pCMV-Flag-Rab32和pCMV-Flag（siRab32或siNC）（0.5 μg·孔-1）分別轉染A549細胞，24 h后棄液，加入110 μL CCK-8溶液，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后采用多功能酶標儀（TECAN P200）測量各孔的OD450 nm吸光值。同時設置未轉染對照，每個處理重復8孔。

1.6 過表達Rab32對aMPV/C復制影響的檢測

將A549細胞接種到6孔板中（1×105 個·孔-1），待其匯合度達到70%左右時利用轉染試劑jet PRIME將pCMV-Flag-Rab32和pCMV-Flag（2 μg·孔-1）分別轉染A549細胞，24 h后接種aMPV/C（MOI 1），感染48 h后收集細胞上清和細胞樣品。

將部分細胞樣品利用Trizol裂解法提取總RNA，按照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper） 操作說明將提取的RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，利用表1中引物和Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix進行實時熒光定量PCR（qPCR）檢測aMPV/C N基因的轉錄水平，結果采用2-ΔΔCt法進行分析。

將另一部分細胞樣品用適量RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000×g離心10 min后收集上清，加入適量4×蛋白上樣緩沖液，用12% SDS-PAGE膠進行蛋白電泳。將分離的蛋白轉印到NC膜上，經(jīng)50 g·L-1脫脂奶室溫封閉2 h，特異性一抗（GAPDH pAb、aMPV/C N mAb、Rab32 pAb）（1∶500）4℃孵育過夜，隨后用HRP標記的（山羊抗鼠IgG與山羊抗兔IgG）二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，滴加適量ECL顯色液進行顯示，用蛋白成像儀（AI800， GE生命科學）采集圖像。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，檢測aMPV/C N的相對表達水平。

將收集的細胞上清進行10倍系列稀釋，然后加入鋪有單層Vero細胞的96孔板中（100 μL·孔-1），48 h后用40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，經(jīng)2 mL·L-1 Triton X-100破膜和50 g·L-1脫脂奶封閉后，用aMPV/C N mAb（1∶100）4℃孵育過夜，用Alex546標記的驢抗鼠IgG抗體（1∶400）室溫孵育2 h后用熒光倒置顯微鏡觀察并計算熒光陽性孔數(shù)。病毒滴度（TCID50）按照Reed and Muench 法進行測定［11］。

1.7 干擾Rab32的表達對aMPV/C復制影響的檢測

將A549細胞接種到6孔板中（1×105個·孔-1），待其匯合度達到60%左右時利用轉染試劑INTERFERin將siRab32和siNC（40 nmol·L-1）分別轉染到A549細胞內(nèi)，24 h后接種aMPV/C（MOI 1），感染48 h后收集細胞上清和細胞樣品。按照“1.4”中樣品處理方法用qPCR、Western blot、TCID50分別測定aMPV/C N基因轉錄水平、aMPV/C N表達水平以及病毒滴度。

1.8 Rab32與aMPV/C各蛋白在A549細胞中的共定位分析

將A549細胞（1×104個·孔-1）接種于共聚焦小皿中，待其匯合度達到60%左右時利用轉染試劑jet PRIME將pCMV-mcherry-Rab32分別與表達融合GFP標簽的aMPV/C蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3、L4）的質(zhì)粒共轉染A549細胞，24 h后用40 g·L-1多聚甲醛固定，經(jīng)DAPI染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察Rab32與aMPV/C各蛋白的共定位。隨后用Image J軟件對aMPV/C N蛋白和Rab32的共定位系數(shù)進行分析。

1.9 Rab32與aMPV/C的相互作用的免疫共沉淀

將239T細胞接種到6孔板中（1×105 個·孔-1），待其匯合度達到70%左右時利用轉染試劑jet PRIME將pCMV-Flag-Rab32分別與表達融合GFP標簽的aMPV/C蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）的質(zhì)粒共轉染HEK293T細胞。其中，pCMV-Flag-Rab32和pCMV-GFP-C3共轉染HEK293T細胞為對照組。36 h后收集細胞樣品，使用NP-40裂解液冰上裂解30 min，12 000×g離心15 min收集上清液，一部分做input樣品，另一部分上清蛋白樣品用proteinA/G瓊脂糖珠孵育2 h，3 000×g離心5 min后收集上清液，用Flag或GFP抗體標記的瓊脂糖珠4℃孵育過夜，3 000×g離心5 min后沉淀用NP-40裂解液洗滌3次，加入適量4×蛋白上樣緩沖液后，按照“1.4”中方法進行Western blot分析。其中，一抗為（Flag mAb、GFP mAb）（1∶500）。

1.10 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

本研究中所有試驗數(shù)據(jù)均來自于3次重復的結果，所有結果均采用“平均值±標準差（±s）”表示，采用Graphpad prism 7軟件中t-test分析各組試驗數(shù)據(jù)的差異性，采用origin 2018軟件繪圖，**表示差異極顯著，即Plt;0.01。

2 結 果

2.1 Rab32與aMPV/C共定位的共聚焦檢測

激光共聚焦顯微鏡成像結果顯示，Rab32蛋白在細胞質(zhì)中表達后呈點狀綠色熒光，aMPV/C N蛋白在細胞質(zhì)中表達后呈小點狀的紅色熒光，Rab32與aMPV/C N蛋白的熒光存在明顯的共定位，而未接毒對照組無紅色熒光信號，也無重疊的黃色熒光（圖1A）。進一步用Image J軟件對綠色和紅色熒光的共定位系數(shù)的分析結果顯示，接種aMPV/C組的共定位系數(shù)極顯著高于未接毒組（Plt;0.01）（圖1B）。

為了分析Rab32是否參與調(diào)控aMPV/C的復制，將A549細胞感染aMPV/C后進行激光共聚焦成像。結果顯示，Rab32蛋白在細胞質(zhì)中表達后呈點狀（綠色），aMPV/C N蛋白在細胞質(zhì)中同樣表達后呈小點狀（紅色），Rab32與aMPV/C N蛋白的熒光信號存在重疊現(xiàn)象，而未接毒對照組未發(fā)現(xiàn)明顯的N蛋白表達信號，也無重疊的熒光（圖1A），表明Rab32與aMPV/C N蛋白存在共定位。進一步用Image J軟件對共聚焦圖片的共定位系數(shù)分析結果顯示，接種aMPV/C組的共定位系數(shù)極顯著高于未接毒組（Plt;0.01）（圖1B），表明Rab32可能參與調(diào)控aMPV/C的復制。

2.2 過表達Rab32對aMPV/C復制的影響

樣品檢測結果顯示，轉染pCMV-Flag-Rab32和pCMV-Flag后的細胞與未轉染的細胞之間的細胞活力無明顯差異（Pgt;0.05）（圖2A）；與未接毒對照組相比，接種aMPV/C后可在約40 ku位置出現(xiàn)一條特異性的N蛋白條帶（圖2B）；與轉染pCMV-Flag的樣品相比，轉染pCMV-Flag-Rab32的樣品中Rab32蛋白的表達水平明顯增加（圖2B），其中，N蛋白的表達水平極顯著增加（Plt;0.01）（圖2C）；qPCR檢測結果顯示，轉染pCMV-Flag-Rab32的樣品中aMPV/C N基因轉錄水平極顯著高于轉染pCMV-Flag的樣品（Plt;0.01）（圖2D）；TCID50檢測結果顯示，轉染pCMV-Flag-Rab32的樣品中病毒滴度極顯著高于轉染pCMV-Flag的樣品（Plt;0.01）（圖2E）。為了分析增加Rab32表達后對aMPV/C復制的影響，將pCMV-Flag-Rab32或pCMV-Flag轉染A549細胞后接種aMPV/C，48 h后分別用qPCR、Western blot和TCID50檢測aMPV/C N基因轉錄水平、 aMPV/C N蛋白（Rab32蛋白）表達水平和病毒效價。結果顯示，轉染pCMV-Flag-Rab32或pCMV-Flag后的細胞與未轉染細胞之間的細胞活力無明顯差異（Pgt;0.05）（圖2A），表明本試驗中轉染pCMV-Flag-Rab32或pCMV-Flag無細胞毒性；接種aMPV/C后可檢測到特異性的N蛋白條帶（約40 ku），而未接毒對照組無此現(xiàn)象（圖2B）；轉染pCMV-Flag-Rab32的樣品中Rab32蛋白的表達水平與轉染pCMV-Flag的樣品相比發(fā)生了明顯的升高（圖2B），其中，N蛋白的表達水平也出現(xiàn)了相同的現(xiàn)象（Plt;0.01）（圖2C）；與轉染pCMV-Flag組相比，轉染pCMV-Flag-Rab32的樣品中aMPV/C N基因轉錄水平極顯著升高（Plt;0.01）（圖2D）；細胞上清中的病毒滴度也發(fā)生了相同的趨勢（Plt;0.01）（圖2E）。結果表明，過表達Rab32表達促進aMPV/C的復制。

2.3 干擾Rab32表達對aMPV/C復制的影響

為了探究干擾Rab32表達對aMPV/C復制的影響，將siRab32和siNC分別轉染A549細胞后接種aMPV/C，48 h后收集細胞樣品和上清，分別用qPCR檢測aMPV/C N基因轉錄水平、Western blot檢測aMPV/C N蛋白表達水平、TCID50檢測病毒效價。結果顯示，轉染siRab32和siNC后的細胞與未轉染細胞之間的細胞活力無明顯差異（Pgt;0.05）（圖3A）；與未接毒對照組相比，接種aMPV/C后可在約40 ku位置出現(xiàn)一條特異性的N蛋白條帶（圖3B）；與轉染siNC的樣品相比，轉染siRab32的樣品中組Rab32蛋白的表達水平明顯降低（圖3B），其中，N蛋白的表達水平極顯著減少（Plt;0.01）（圖3C）；qPCR檢測結果顯示，轉染siRab32的樣品中aMPV/C N基因轉錄水平極顯著低于轉染siNC的樣品（Plt;0.01）（圖3D）；TCID50檢測結果也發(fā)現(xiàn)，轉染siRab32的樣品中病毒滴度極顯著低于轉染siNC的樣品（Plt;0.01）（圖3E）。表明，干擾Rab32表達抑制aMPV/C的復制。

為了分析降低Rab32表達后對aMPV/C復制的影響，將siRab32或siNC轉染A549細胞后接種aMPV/C，48 h后分別用qPCR、Western blot和TCID50檢測aMPV/C N基因轉錄水平、 aMPV/C N蛋白（Rab32蛋白）表達水平和病毒效價。結果顯示，轉染siRab32或siNC后的細胞與未轉染細胞之間的細胞活力無明顯差異（Pgt;0.05）（圖3A），表明本試驗中轉染siRab32或siNC無細胞毒性；接種aMPV/C后可檢測到特異性的N蛋白條帶（約40 ku），而未接毒對照組無此現(xiàn)象（圖3B）；轉染siRab32的樣品中Rab32蛋白的表達水平與轉染siNC的樣品相比發(fā)生了明顯的降低（圖3B），其中，N蛋白的表達水平也出現(xiàn)了相同的現(xiàn)象（Plt;0.01）（圖3C）；與轉染siNC組相比，轉染siRab32的樣品中aMPV/C N基因轉錄水平極顯著降低（Plt;0.01）（圖3D）；細胞上清中的病毒滴度也發(fā)生了相同的趨勢（Plt;0.01）（圖3E）。結果表明，干擾Rab32表達抑制aMPV/C的復制。

2.4 Rab32與aMPV/C 各蛋白的共定位分析

為探究Rab32與aMPV/C各蛋白是否存在共定位，將pCMV-mcherry-Rab32分別與表達融合GFP的aMPV/C各蛋白和pCMV-GFP-C3轉染A549細胞，24 h后利用激光共聚焦顯微鏡成像。結果顯示，Rab32蛋白呈紅色表達于細胞質(zhì)中；aMPV/C N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3、L4和GFP蛋白呈綠色主要在細胞質(zhì)中表達；Rab32與多個aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3）存在熒光信號共定位，而Rab32與aMPV/C L3蛋白或轉染vector的GFP蛋白無明顯的共定位（圖4A）。進一步用Image J對共聚焦圖像的共定位系數(shù)進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，Rab32與多個aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）之間的共定位系數(shù)極顯著高于Rab32與Vector（Plt;0.01），而Rab32和L3蛋白之間的共定位系數(shù)與Rab32和Vector之間無明顯差異（Pgt;0.05）（圖4B）。表明，Rab32可以與多個aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3）存在共定位為分析Rab32與aMPV/C各蛋白是否存在共定位現(xiàn)象，將pCMV-mcherry-Rab32分別與攜帶GFP標簽的aMPV/C各蛋白或pCMV-GFP-C3（Vector）轉染A549細胞，24 h后進行激光共聚焦觀察。結果顯示，Rab32蛋白可在細胞質(zhì)中表達（紅色）；aMPV/C各蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3、L4）均在細胞質(zhì)中表達（綠色）而Vector中GFP蛋白均勻表達于細胞核與細胞質(zhì)中； Rab32與多個aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）的熒光信號存在重疊，而Rab32與aMPV/C L3蛋白或Vector的GFP蛋白無明顯的熒光信號重疊現(xiàn)象（圖4A）。進一步用Image J進行共定位系數(shù)分析結果顯示Rab32與多個aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）之間的共定位系數(shù)極顯著高于Rab32與Vector（Plt;0.01），而Rab32與L3蛋白或Vector之間的共定位系數(shù)無明顯差異（Pgt;0.05）（圖4B）。表明，Rab32可以與多個aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）存在共定位。

2.5 Rab32與aMPV/C結構蛋白相互作用的免疫共沉淀分析

將pCMV-Flag-Rab32分別與表達融合GFP的aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）共轉染HEK293T細胞，隨后進行Co-IP試驗。結果顯示，Input樣品中Rab32和aMPV/C的結構蛋白分別與Flag抗體或GFP抗體結合后出現(xiàn)特異性條帶，表明Rab32和aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3）在HEK293T細胞中均獲得了高效表達（圖5）。" IP結果顯示，共轉染pCMV-Flag-Rab32和表達融合GFP的aMPV/C N或M2-2蛋白的細胞樣品，分別與Flag MAb或GFP MAb反應后出現(xiàn)了特異性條帶，而其他樣品（N、F、M、G、SH、M2-2、L1、L2、L4、C3）均無特異性條帶（圖5），進一步表明Rab32與aMPV/C N和M2-2蛋白存在特異性相互作用。

將pCMV-Flag-Rab32分別與攜帶GFP標簽的aMPV/C各結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L4）共轉染HEK293T細胞，隨后按照常規(guī)方法進行Co-IP試驗。結果顯示，Input樣品中分別用Flag抗體和GFP抗體孵育后檢測到Rab32和aMPV/C各結構蛋白的特異性條帶，表明Rab32和aMPV/C結構蛋白（N、P、F、SH、G、M、M2-1、M2-2、L1、L2、L3）在HEK293T細胞中均成功表達（圖5）。共轉染pCMV-Flag-Rab32和攜帶GFP標簽的aMPV/C N或M2-2質(zhì)粒的IP細胞樣品經(jīng)Flag MAb或GFP Mab孵育后檢測到特異性條帶，而其他樣品（F、M、G、SH、P、M2-1、L1、L2、L4、C3）均未檢測到特異性條帶（圖5），進一步表明Rab32與aMPV/C N和M2-2蛋白存在相互作用。

3 討 論

aMPV/C最早在美國患有呼吸道疾病的火雞中被發(fā)現(xiàn)［12］，此后各國的研究人員從綠頭鴨、番鴨、野雞、珍珠雞、鴕鳥、鵝以及一些野生鳥類中分離到該病原［13-16］。在中國，自1999年首次發(fā)現(xiàn)aMPV感染以來［3］，研究人員開展了一系列的血清學調(diào)查，結果表明aMPV已在雞群中流行［17-18］。2013年，研究人員首次從中國東南地區(qū)患有急性呼吸道疾病的當?shù)?0日齡肉雞中分離出一株aMPV/C（JC株）［10］。該毒株的成功分離為深入探究aMPV/C的致病機理提供了重要的生物材料。盡管Vero細胞是培養(yǎng)aMPV/C常用的細胞系，該細胞是否為擴增aMPV/C的最佳細胞仍不是很清楚。研究人員利用17種不同細胞對從明尼蘇達州分離的aMPV/C毒株的生長情況進行了評估，細胞病變（CPE）結合免疫熒光的檢測結果發(fā)現(xiàn)，aMPV/C在BGM、QT-35和DF-1細胞中生長后可獲得較高的病毒滴度［19］。然而aMPV/C是否可感染A549細胞，目前尚不清楚。該研究發(fā)現(xiàn)aMPV/C不僅可感染A549細胞，而且可利用A549細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)完成子代病毒的復制（圖2、3）。研究人員利用該毒株接種BALB/c小鼠后發(fā)現(xiàn)，aMPV/C可在小鼠肺中進行高效的復制，肺部炎癥因子和趨化因子（MCP-1、MIP-1α、RANTES、IL-1β、IFN-γ和TNF-α）的表達水平也顯著上調(diào)［20］。這些結果提示，aMPV/C可能為一種潛在的人畜共患病原體。

Rab超家族中的成員以GTP酶依賴的方式在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復合體、核內(nèi)體以及質(zhì)膜的運輸中發(fā)揮作用。如：Rab1、Rab2、Rab6和Rab33等Rabs可以調(diào)節(jié)高爾基復合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體網(wǎng)絡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間囊泡的順行和逆行運輸。然而，一部分Rabs （Rab32或Rab24）不僅調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細胞器（如線粒體）的接觸，還調(diào)節(jié)自噬體的形成［5］。研究人員通過過表達GTP結合形式的Rab32（Rab32 WT與Rab32Q85L）或GTP非結合形式的Rab32（Rab32T39N-和rab32N143I），發(fā)現(xiàn)Rab32不僅通過影響LC3的募集來調(diào)節(jié)自噬體的形成，而且還會影響聚合體的形成［4-5］。Wang等［21］進一步研究發(fā)現(xiàn)Rab32通過影響果蠅體內(nèi)自噬的發(fā)生，從而調(diào)控果蠅的脂質(zhì)儲存。Rab32也參與了調(diào)控腫瘤的侵襲。有研究表明，Rab32將Drp1從細胞質(zhì)轉運到線粒體，并招募ERK1/2，激活Drp1的ser616位點，進而介導線粒體分裂，促進星形膠質(zhì)瘤的間質(zhì)轉移、遷移和侵襲［22］。此外，Rab32在抑制細胞內(nèi)病原菌的擴散方面也發(fā)揮重要作用［23］。研究表明Rab32可特異性靶向囊泡包裹的胞內(nèi)細菌，在抑制細菌的增殖和擴散中發(fā)揮作用［7-9］。同樣，Rab32在宿主抗病毒感染過程中也發(fā)揮了作用。研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染后促進了Rab32蛋白和mRNA的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染后可導致GTP結合型Rab32向GDP結合性Rab32的轉變，引起GDP結合型Rab32的累積，降低了Rab32的降解。而GDP結合的Rab32通過與HCV核心蛋白的相互作用，將病毒核心蛋白運輸?shù)郊毎酥艿牟《竞铣晌稽c，從而利用病毒粒子的組裝［24］。該研究發(fā)現(xiàn)，過表達Rab32顯著增加了aMPV/C N基因的轉錄水平、N蛋白的表達和子代病毒的數(shù)量（圖2），而干擾Rab32顯著降低了aMPV/C N基因的轉錄水平、N蛋白的表達和子代病毒的數(shù)量（圖3）。結合激光共聚焦顯微鏡成像結果（圖1）可知，Rab32參與調(diào)控aMPV/C的復制。進一步利用激光共聚焦顯微鏡成像和免疫共沉淀技術，發(fā)現(xiàn)Rab32可與aMPV/C N和M2-2蛋白發(fā)生互作（圖4、5）。該結果與HCV感染過程中Rab32發(fā)揮的作用相似［24］。由此推測，宿主因子Rab32在促進子代病毒的有效組裝過程中發(fā)揮作用，該猜想需要通過設計一系列的試驗來驗證，也是本研究后續(xù)開展的主要側重點。

4 結 論

Rab32可能通過與aMPV/C N和M2-2蛋白之間的相互作用從而調(diào)控aMPV/C 的復制，相關研究結果可為深入探索Rab32調(diào)控aMPV/C復制的分子機理提供研究基礎，也可為進一步探究Rab32是否參與調(diào)控其他肺炎病毒感染提供參考信息。

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（編輯 白永平）