摘 要： 旨在探討植物精油（商品名：舒檸500）對(duì)禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）人工感染雛雞的防治效果。將260羽1日齡健康非免疫雛雞分成空白組、模型對(duì)照組（A、B、C）、預(yù)防組（A、B、C）、治療組（A、B、C）和陽(yáng)性藥物組（A、B、C）共13組，每組20只。除空白組外，其余各A組雛雞均在8日齡單感染IBV毒株GX-QZ20181028（LX4型），各B組雛雞均在8日齡單感染IBV毒株GX-NN20200723（Taiwan型），各C組雛雞均在8日齡共感染IBV毒株GX-QZ20181028（LX4型）和GX-NN20200723（Taiwan型）。預(yù)防組在3日齡（感染前5 d）飲水給藥（植物精油，1 mL·L-1水）；治療組（植物精油1 mL·L-1水）和陽(yáng)性藥物組（雙黃連口服液，0.7 mL·L-1水）均在感染后半數(shù)以上的雛雞表現(xiàn)臨床癥狀時(shí)給藥治療，連續(xù)給藥5 d。在雛雞8、9、13、14、15、16、17、18、19、20日齡時(shí)，評(píng)定臨床癥狀計(jì)分與療效；在雛雞19、22日齡時(shí)，觀察病理組織學(xué)病變、測(cè)定免疫器官指數(shù)并檢測(cè)氣管和腎臟病毒載量；在雛雞8、9、15、17、19、22日齡時(shí)，對(duì)IBV特異性抗體和血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-6進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，預(yù)防組A、B和C的保護(hù)率分別為75.00%、85.00%和70.00%；治療組A、B、C的有效率分別為92.31%、78.57%、77.78%。模型對(duì)照組雛雞可見大量氣管黏膜上皮細(xì)胞纖毛減少或消失，并發(fā)生變性壞死，腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，其余組均無(wú)明顯病變。預(yù)防組、治療組和陽(yáng)性藥物組氣管和腎組織病毒載量均顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05）。模型對(duì)照組胸腺與法氏囊指數(shù)顯著低于其余各組（P＜0.05）。17日齡（給藥后第5天），預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組抗體水平上升，至22日齡（停藥后第5天），抗體水平顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。13至22日齡（給藥前至停藥后第5天），模型對(duì)照組的IL-4、IFN-γ含量均顯著低于其余各組（P＜0.05），但I(xiàn)L-6含量顯著高于其余各組（P＜0.05）。綜上，在本試驗(yàn)條件下，植物精油對(duì)IBV單感染和共感染雛雞均有較好的防治作用，其防治作用主要通過(guò)抑制病毒復(fù)制、促進(jìn)免疫器官發(fā)育和抗體生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究為禽傳染性支氣管炎（IB）防治提供新思路，也為其它動(dòng)物冠狀病毒病有效防治提供了參考。

關(guān)鍵詞： 傳染性支氣管炎病毒；精油；預(yù)防；治療

中圖分類號(hào)：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4605-15

收稿日期：2023-09-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32360871）；廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（桂科AB21238003）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020GXNSFDA297004）；廣西大學(xué)2022年“大創(chuàng)計(jì)劃”自治區(qū)級(jí)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（S202210593418）；橫向項(xiàng)目（202201133）

作者簡(jiǎn)介：林家杰（2002-），男，廣西柳州人，本科生，主要從事禽病防治研究，E-mail：1564307786@qq.com

*通信作者：磨美蘭，主要從事禽病防治與病原分子生物學(xué)研究，E-mail：momeilan@163.com

Effect of Plant Essential Oil on Prevention and Treatment of Chicks Artificially Infected

with Infectious Bronchitis Virus

LIN" Jiajie1， LIN" Zixue1， WANG" Lijia1， WANG" Guowei1， HUANG" Yanping1， ZHANG" Yu1， ZHANG

Taoni1， JIN" Yinghao1， MO" Meilan1，2，3，4*

（1.College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530004，" China;

2.Guangxi Zhuang Autonomous Region Engineering Research Center of Veterinary Biologics， Nanning 530004，

China;

3.Guangxi Key Laboratory of Animal Breeding， Disease Control and Prevention， Nanning 530004，

China;

4.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Prevention and Control for Animal Disease，

Nanning 530004，" China）

Abstract："" The aim was to investigate the efficacy of plant essential oil （Commercial name： Shu-ning 500） on chicks artificially infected with avian infectious bronchitis virus （IBV）. A total of 260 1-day-old non-immunized healthy chicks were divided into 13 groups， including blank group， model control groups （A， B， C）， preventive groups （A， B， C）， treatment groups （A， B， C）， and positive drug groups （A， B， C）， with 20 chicks in each group. Except the blank group，" all the chicks in group A were mono-infected with IBV strain GX-QZ20181028 （LX4 type） at 8-day-old， and all the chicks in group B were mono-infected with IBV strain GX-NN20200723 （Taiwan type） at 8-day-old. All group C chicks were co-infected with IBV strains GX-QZ20181028 （LX4） and GX-NN20200723 （Taiwan type） at 8-day-old. The preventive groups were given the drug（essential oil， 1 mL·L-1 water）in drinking water from 3-day-old （5 days before infection）. Both the treatment groups and the positive drug group （Shuanghuanglian Oral Liquid， 0.7 mL·L-1 water） were administered when more than half of the chicks showed clinical symptoms， and the drug was administered continuously for 5 days. Clinical symptoms and efficacy were evaluated at 8， 9， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， and 20 days old， while pathological histopathological changes， immune organ indexes， and viral loads in trachea and kidneys were observed at 19 and 22 days old. IBV-specific antibodies， as well as cytokines IFN-γ， IL-4， and IL-6 in sera were detected at 8， 9， 15， 17， 19， and 22 days old. The results showed that the protection rates of prevention group A， B and C were 75.00%， 85.00% and 70.00%， respectively. The effective rates of treatment group A， B and C were 92.31%， 78.57% and 77.78%， respectively. In the model control groups， cilia of a large number of epithelial cells in the tracheal mucosa decreased or disappeared， and degeneration and necrosis occurred， and lymphocytes were infiltrated in the renal mesenchyme， and no obvious lesions were observed in other groups. The viral loads of trachea and kidney in the prevention， treatment and positive drug groups were significantly lower than those in the model control groups （Plt;0.05）. The thymus and bursa indices in the model control groups were significantly lower than those in the remaining groups （Plt;0.05）. At 17 days old （the 5th day after administration）， the antibody levels of prevention， treatment and positive drug groups increased， and at 22 days old （the 5th day after withdrawal）， the antibody levels were significantly higher than those in the model control groups （Plt;0.05）. The levels of IL-4 and IFN-γ in the model control groups were significantly lower than those in other groups from pre-administration to the 5th day after withdrawal （Plt;0.05） at 13 to 22 day-old （5 days before treatment to 5 days after withdrawal）， and the contents of IL-6 were significantly higher than those in other groups （Plt;0.05）. In conclusion， under the condition of the current study， the plant essential oil has good preventive and therapeutic effects on chicks both mono-infected and co-infected with IBV， and the preventive and curative effects are mainly exerted through inhibiting viral replication， promoting immune organ development and antibody production， and regulating cytokines. The present study provides a new idea for the prevention and treatment of avian infectious bronchitis （IB）， and also provides a reference for the effective treatment and prevention of coronavirus diseases in other animals.

Key words： infectious bronchitis virus; essential oil; prevention; treatment

*Corresponding author： MO Meilan，E-mail：momeilan@163.com

禽傳染性支氣管炎（infectious bronchitis， IB）是由傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus， IBV）引起的一種急性、高度接觸性呼吸道疾病，不同日齡、性別、品種雞均易感，導(dǎo)致雞死亡以及增重、產(chǎn)蛋量、蛋品質(zhì)和飼料報(bào)酬率等降低，還常常引起支原體、大腸桿菌等繼發(fā)感染，從而使雞群死亡率增加。此外，某些IBV毒株感染還導(dǎo)致“假母雞”，造成產(chǎn)蛋障礙綜合征，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。IBV基因組極易發(fā)生突變和重組，導(dǎo)致血清型復(fù)雜，各血清型之間的交叉保護(hù)性較差［1-3］。疫苗接種是目前防控IB的主要措施，但疫苗研發(fā)速度永遠(yuǎn)跟不上病毒變異速度，因此，非常有必要探索有效防治IB的替代方案。目前發(fā)現(xiàn)天然植物化合物對(duì)病毒感染存在抑制作用，抗病毒藥物的開發(fā)和應(yīng)用可能是免疫防控IBV的替代或補(bǔ)充策略。

植物精油是從植物中提取的次級(jí)代謝物。研究表明，植物精油具有抗病毒、抗菌、抗氧化、毒性小、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、在體內(nèi)無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)［4-6］。目前，植物精油已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品添加劑領(lǐng)域，在養(yǎng)殖業(yè)上漸有應(yīng)用。Nameghi等［7］研究表明，隨著肉雞日糧中百里香精油、薄荷精油和桉葉油添加量的增加，新城疫病毒、IBV和傳染性法氏囊病病毒的抗體滴度呈線性增加，肉雞的發(fā)病率有所降低，免疫力有所增強(qiáng)。El-Shall等［8］通過(guò)血清學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物精油對(duì)禽流感病毒、IBV、傳染性法氏囊病病毒具有免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)新城疫病毒有抗病毒作用，特別是在感染前使用。朱曉磊等［9］發(fā)現(xiàn)百里香精油可通過(guò)促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞的增殖和成熟，調(diào)節(jié)麻雞的細(xì)胞免疫功能。Barbour等［10］評(píng)價(jià)桉樹精油、薄荷精油治療肉雞免疫抑制病的效果，結(jié)果表明，精油能夠顯著降低發(fā)病率，防治免疫抑制病引起的脾腫大、法氏囊充血和肝增大。以上研究表明植物精油在養(yǎng)禽業(yè)具有應(yīng)用前景。

IB給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失非常大，但目前應(yīng)用植物精油防治IB的報(bào)道非常有限。Jackwood等［11］探索了一種植物油性樹脂和精油的混合物對(duì)IBV的抑制效果，結(jié)果顯示這種植物精油混合物可降低Vero細(xì)胞和雞胚中的IBV滴度，但該試驗(yàn)只在細(xì)胞和雞胚上進(jìn)行，沒(méi)有進(jìn)行動(dòng)物臨床試驗(yàn)。而藥效試驗(yàn)對(duì)植物精油的臨床治療或預(yù)防應(yīng)用是非常必要的。本課題組前期研究表明，植物精油（舒檸500）對(duì)雞胚中的IBV具有明顯的抑制作用（數(shù)據(jù)未發(fā)表），為進(jìn)一步了解該植物精油對(duì)IB的防治效果，非常有必要開展動(dòng)物試驗(yàn)。因此，本研究擬以植物精油（舒檸500）對(duì)人工感染IBV的雛雞進(jìn)行預(yù)防和治療，并從臨床癥狀評(píng)分和療效、病理組織學(xué)變化、免疫器官指數(shù)、病毒載量、體液免疫和細(xì)胞免疫等方面來(lái)綜合評(píng)價(jià)該植物精油對(duì)IB的臨床防治效果，為利用精油防治IB提供新思路，也為應(yīng)用精油防治其它動(dòng)物冠狀病毒感染提供參考，同時(shí)為開展植物精油無(wú)抗綠色生態(tài)養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、病毒、試驗(yàn)動(dòng)物

IBV毒株GX-QZ20181028（LX4型）和GX-NN20200723（Taiwan型）均為本課題組分離保存。植物精油（舒檸500）為廣州納生生物科技有限公司提供，主要成分為山蒼子油與肉桂醛。陽(yáng)性藥物雙黃連口服液購(gòu)自北京瑞先農(nóng)科技有限公司。310羽1日齡健康非免疫雛雞購(gòu)自廣西南寧市良源種禽有限責(zé)任公司。IBV特異性抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京愛德士元亨生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最佳攻毒劑量的確定

1日齡健康非免疫雛雞50羽，飼養(yǎng)至3日齡，隨機(jī)分成10組，每組5羽。測(cè)定GX-QZ20181028和GX-NN20200723毒價(jià)，分別為EID50為10-5/0.2 mL和 10-4.3/0.2 mL。GX-QZ20181028單感染組經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻分別接種104、104.5和105 EID50的病毒尿囊液；GX-NN20200723單感染組經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻分別接種104、104.2和104.3 EID50的病毒尿囊液；GX-QZ20181028和GX-NN20200723共感染組則分別接種兩種病毒對(duì)應(yīng)毒價(jià)攻毒劑量的各一半。以半數(shù)發(fā)病組攻毒劑量?jī)杀秳┝繛樵囼?yàn)攻毒劑量。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組及攻毒給藥方案

將260羽1日齡健康非免疫雛雞分成空白組、模型對(duì)照組（A、B、C）、預(yù)防組（A、B、C）、治療組（A、B、C）和陽(yáng)性藥物組（A、B、C）共13組，每組20只。除空白組外，其余各組均在8日齡分別以最佳攻毒劑量單感染或共感染GX-QZ20181028和GX-NN20200723毒株，單感染組攻毒劑量均為2×104 EID50，共感染則分別接種兩種病毒對(duì)應(yīng)毒價(jià)攻毒劑量的各一半。預(yù)防組在3日齡（感染前5 d）飲水給藥；治療組和陽(yáng)性藥物組均在感染后半數(shù)以上的雛雞表現(xiàn)臨床癥狀時(shí)給藥治療（實(shí)際試驗(yàn)中，攻毒5 d后半數(shù)以上雛雞已表現(xiàn)出臨床癥狀），連續(xù)給藥5 d。各組喂以基礎(chǔ)日糧，自由采食。具體分組和給藥處理方案如表1所示。

1.2.3 臨床癥狀與療效評(píng)定

參考何怡寧等［12］和林春發(fā)等［13］的方法制定IB實(shí)驗(yàn)性臨床評(píng)價(jià)記分標(biāo)準(zhǔn)和植物精油療效判定標(biāo)準(zhǔn)。攻毒后每天觀察雞的臨床癥狀變化，進(jìn)行計(jì)分計(jì)算，統(tǒng)計(jì)各組的發(fā)病率、保護(hù)率、治愈率和有效率，評(píng)價(jià)植物精油對(duì)IB的療效。

1.2.4 病理組織切片觀察

在19日齡（治療組和陽(yáng)性藥物組停藥后第2天）和22日齡（治療組和陽(yáng)性藥物組停藥后第5天）時(shí)，空白組、模型對(duì)照組、預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組分別剖殺5只雛雞，觀察大體病變后采集氣管和腎組織進(jìn)行病理組織切片觀察。

1.2.5 病毒載量檢測(cè)

在19日齡（治療組和陽(yáng)性藥物組停藥后第2天）和22日齡（治療組和陽(yáng)性藥物組停藥后第5天）時(shí)，空白組、模型對(duì)照組、預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組分別剖殺5只雛雞，采集5只試驗(yàn)雞的氣管和腎組織，采用本課題組建立的IBV N基因片段real-time PCR方法［14］檢測(cè)氣管和腎組織的病毒載量。

1.2.6 增重量與免疫器官指數(shù)測(cè)定

在19日齡（治療組和陽(yáng)性藥物組停藥后第2天）和22日齡（治療組和陽(yáng)性藥物組停藥后第5天）時(shí)，空白組、模型對(duì)照組、預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組分別剖殺5只雛雞，采集5只試驗(yàn)雞的胸腺、脾和法氏囊并稱重，計(jì)算各組雞只的免疫器官指數(shù)（免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/雞體重量）。

1.2.7 特異性抗體檢測(cè)

各組雛雞在3日齡（預(yù)防組給藥前）、8日齡（攻毒前）、13日齡（攻毒后5天，治療組和陽(yáng)性藥物組給藥前）、15日齡（攻毒后7天，治療組和陽(yáng)性藥物組給藥后第3天）、17日齡（攻毒后9天，治療組和陽(yáng)性藥物組給藥后第5天）、19日齡（攻毒后11天，治療組和陽(yáng)性藥物組停藥后第2天）、22日齡（攻毒后14天，治療組和陽(yáng)性藥物組停藥后第5天）分別自雞翅下靜脈采血，每組均采集5份血清樣本，使用IDEXX商品試劑盒檢測(cè)IBV特異性抗體。

1.2.8 細(xì)胞因子檢測(cè)

與特異性抗體檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，雞翅下靜脈采血，每組均采集5份血清樣本，用雞IL-4、IFN-γ和IL-6 ELISA試劑盒測(cè)定相應(yīng)細(xì)胞因子的含量，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以95%置信區(qū)間的幾何均值表示，統(tǒng)計(jì)分析使用單因素方差分析（ANOVA）和SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀計(jì)分與療效評(píng)定結(jié)果

以確定的最佳攻毒劑量對(duì)除空白組以外的各組進(jìn)行攻毒。攻毒后每天觀察臨床癥狀并記錄臨床癥狀分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，空白組的臨床癥狀評(píng)分為零，模型對(duì)照組最高，精油預(yù)防組、精油治療組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組的癥狀評(píng)分均低于模型對(duì)照組，且隨著藥物的使用整體呈下降趨勢(shì)（圖1）。各攻毒組在感染IBV后第5天發(fā)病率均達(dá)到較高水平，除預(yù)防組外，其它各組發(fā)病率均超過(guò)50%，預(yù)防組A、B和C的保護(hù)率分別為75.00%、85.00%和70.00%。19日齡（停藥后第2天），除模型對(duì)照組外，各攻毒組發(fā)病率均明顯降低。對(duì)比各給藥組的有效率，結(jié)果表明治療組A、B、C的有效率分別為92.31%、78.57%、77.78%，陽(yáng)性藥物組A、B、C的有效率分別為84.62%，84.62%，66.67%（表2）。

2.2 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)19和22日齡（停藥后第2天和第5天）各組的氣管和腎進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。結(jié)果表明停藥后第5天模型對(duì)照組A、B和C的大量氣管黏膜上皮細(xì)胞變性壞死，伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。其中，模型對(duì)照組A和模型對(duì)照組C纖毛減少，伴上皮細(xì)胞再生，模型對(duì)照組B纖毛消失，伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，空白組和其它所有試驗(yàn)組氣管均無(wú)明顯病變（圖2）。模型對(duì)照組A和C的腎間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，模型對(duì)照組B腎間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，空白組和其它所有試驗(yàn)組腎均無(wú)明顯病變（圖3）。

2.3 病毒載量檢測(cè)結(jié)果

對(duì)19日齡和22日齡（停藥后第2天和第5天）各組的氣管和腎組織的病毒載量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的氣管和腎組織均未檢測(cè)到病毒，模型對(duì)照組氣管和腎組織mRNA表達(dá)量顯著升高（Plt;0.01，圖4）。19日齡（停藥后第2天），各模

型對(duì)照組氣管和腎組織病毒載量顯著高于其余各試驗(yàn)組（P＜0.05），預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組的氣管組織病毒載量均差異不顯著（P＞0.05），預(yù)防組（A、C）、治療組（A、C）和陽(yáng)性藥物組（A、C）腎組織病毒載量差異不顯著（P＞0.05），預(yù)防組B腎組織病毒載量顯著低于治療組B（P＜0.05）。22日齡（停藥后第5天），各模型對(duì)照組氣管組織病毒載量均顯著高于其余各試驗(yàn)組（P＜0.05），其余各組氣管組織病毒載量差異不顯著（P＞0.05），預(yù)防組A、治療組A和陽(yáng)性藥物組A腎組織病毒載量顯著低于模型對(duì)照組A（P＜0.05），模型對(duì)照組B與治療組B差異不顯著（P＞0.05），預(yù)防組B腎組織病毒載量顯著低于模型對(duì)照組B（P＜0.05），其余各組腎組織病毒載量差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 免疫器官指數(shù)測(cè)定結(jié)果

對(duì)19日齡和22日齡（停藥后第2天和第5天）各組的胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)進(jìn)行測(cè)定。胸腺指數(shù)結(jié)果顯示，空白組和模型對(duì)照組均顯著低于其他各組（P＜0.05），22日齡預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；脾臟指數(shù)結(jié)果顯示，空白組顯著低于其他各組（P＜0.05），模型對(duì)照組、預(yù)防組、治療組和陽(yáng)性藥物組之間幾乎無(wú)顯著差異（P＞0.05）；法氏囊指數(shù)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組顯著低于其余各組（P＜0.05），空白組、預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05，圖5）。綜合以上結(jié)果，預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)均顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05），該植物精油能夠刺激免疫器官生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能，提高機(jī)體抗IBV感染的能力。

2.5 特異性抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)攻毒前、給藥前和停藥后不同時(shí)相的血清特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在感染IBV前（8日齡）存在母源抗體，但空白組的母源抗體在試驗(yàn)期間逐漸降低。感染IBV后，除了空白組的母源抗體一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其它各組的抗體整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，尤其19日齡（停藥后第2天）和22日齡（停藥后第5天）上升非常明顯，但預(yù)防組（A、C）、治療組（A、C）、陽(yáng)性藥物組（A、C）抗體比模型對(duì)照組（A、C）上升幅度大（P＞0.05，圖6）。由此可知，該植物精油能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，在機(jī)體抗體水平達(dá)到峰值后，仍能夠維持機(jī)體抗體水平一段時(shí)間。

2.6 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

對(duì)攻毒前、給藥前和停藥后不同時(shí)相各組雛雞血清進(jìn)行IL-4、IFN-γ和IL-6檢測(cè)。結(jié)果顯示，預(yù)防組的IL-4與IFN-γ含量在攻毒前顯著高于其它各試驗(yàn)組（P＜0.05），22日齡（停藥第5天）預(yù)防組、治療組、陽(yáng)性藥物組差異不顯著（P＞0.05，圖7、圖8）。預(yù)防組IL-6含量在攻毒前顯著低于各試驗(yàn)組（P＜0.05），17日齡至22日齡（給藥第5天至停藥第5天）顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05），與空白組差異不顯著（P＞0.05）；治療組自17日齡至19日齡（給藥第5天至停藥第2天）與預(yù)防組差異不顯著（P＞0.05），在17日齡（給藥第5天）顯著低于各試驗(yàn)組（P＜0.05，圖9）。綜上，使用該植物精油后，雛雞血清的IL-4和IFN-γ含量更高，IL-6含量更低，說(shuō)明該植物精油可通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。

3 討 論

我國(guó)是世界主要養(yǎng)禽大國(guó)，養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展非常重要。IBV基因組非常容易變異，血清型復(fù)雜且各血清型之間的交叉保護(hù)有限，給IB防控帶來(lái)巨大困難和挑戰(zhàn)性。因此，開發(fā)有效的抗病毒治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前關(guān)于應(yīng)用植物精油防治IB的報(bào)道非常有限，本研究首次表明山蒼子與肉桂醛混合精油對(duì)IB具有良好的防治作用，為開發(fā)抗IBV感染藥物奠定了基礎(chǔ)。

臨床癥狀計(jì)分與療效是應(yīng)用藥物對(duì)IB進(jìn)行治療后常觀察的指標(biāo)。何怡寧等［12］應(yīng)用桔百顆粒對(duì)雛雞感染雞IB進(jìn)行防治效果觀察，預(yù)防組的保護(hù)率為50.00%，治療組的治愈率為66.67%。林春發(fā)等［13］應(yīng)用高、中、低劑量板芩桔甘合劑對(duì)雛雞感染雞IB進(jìn)行治療，有效率分別為90.0%、95.0%、80.0%。在本研究中，精油預(yù)防組、精油治療組的癥狀評(píng)分均低于模型對(duì)照組且呈下降趨勢(shì)，預(yù)防組A、B和C的保護(hù)率分別為75.00%、85.00%和70.00%。給藥后第7天，治療組A、B、C的有效率分別為92.31%、78.57%、77.78%，陽(yáng)性藥物組A、B、C的有效率分別為84.62%、84.62%、66.67%。結(jié)果表明該植物精油對(duì)IB的治療和預(yù)防效果均比較明顯；且該植物精油混合物不僅對(duì)IBV單感染治療有效果，對(duì)IBV共感染同樣有良好的治療作用；與陽(yáng)性藥物組比較，該植物精油的治療作用較好些。

為了更加科學(xué)全面評(píng)估精油對(duì)IBV感染雛雞的防治效果，本研究將臨床癥狀、病理組織學(xué)變化和病毒載量綜合分析，發(fā)現(xiàn)該植物精油預(yù)防組和治療組的臨床癥狀和病理組織學(xué)變化均不明顯，模型對(duì)照組均出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和不同程度的病理組織學(xué)變化。同樣地，精油預(yù)防組和治療組氣管和腎組織的病毒載量明顯低于模型對(duì)照組，表明精油對(duì)IBV有很好的抑制作用。有研究表明精油的抑制病毒活性可能是破壞病毒囊膜或干擾參與宿主細(xì)胞附著的病毒包膜蛋白［15］。本研究中精油主要成分為山蒼子油與肉桂醛，其中肉桂醛可通過(guò)多種方式抑制病毒，即可以直接抑制病毒吸附和復(fù)制增殖，減少病毒的感染率，也可以阻斷病毒生物合成過(guò)程，導(dǎo)致病毒死亡［16-17］。山蒼子精油味辛性溫，能溫中散寒、行氣止痛、解毒消腫、燥濕健脾，具有很好的藥用功效和臨床治療作用［18］。

免疫器官指數(shù)的高低在一定程度上能反映機(jī)體免疫水平的強(qiáng)弱，是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)的常用指標(biāo)。研究表明，脾臟、胸腺和法氏囊免疫器官指數(shù)可用于評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)［19-20］。免疫器官指數(shù)越大，機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫功能越好［21］。為進(jìn)一步了解精油發(fā)揮作用機(jī)制，本研究對(duì)脾、胸腺和法氏囊三個(gè)免疫器官指數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)防組和治療組的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)顯著高于模型對(duì)照組，而各組的脾臟指數(shù)均無(wú)顯著差異，說(shuō)明該精油能夠促進(jìn)胸腺和法氏囊生長(zhǎng)發(fā)育，從而提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。朱曉磊等［22］也報(bào)道了類似的結(jié)果，他們通過(guò)在基礎(chǔ)日糧中添加不同水平的植物精油，發(fā)現(xiàn)精油對(duì)麻花雞胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)的提升有顯著作用，而脾臟指數(shù)無(wú)顯著差異。胸腺和法氏囊指數(shù)提高的原因可能是精油進(jìn)入動(dòng)物體后，在腸道內(nèi)降解為動(dòng)物體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨血液循環(huán)進(jìn)入淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)中樞免疫器官胸腺和法氏囊的發(fā)育［23］。

抗體水平是體液免疫的重要指標(biāo)，而體液免疫在抗感染中發(fā)揮著重要的作用。體液反應(yīng)被認(rèn)為是預(yù)防IBV的免疫反應(yīng)的重要組成部分，高抗體水平與預(yù)防IBV感染有關(guān)［24］。最近的研究證明，精油可以改善雞的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防組和治療組的特異性抗體顯著高于模型對(duì)照組，且預(yù)防組和治療組雛雞抗體水平達(dá)到峰值后，仍能夠維持機(jī)體抗體水平一段時(shí)間，表明精油可以有效促進(jìn)雞的抗體生成，與先前其他團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果一致［7-8］。此外，張曉燕等［26］通過(guò)在飼糧中添加植物精油能夠顯著提高機(jī)體抗體水平并能夠維持一段時(shí)間，本研究與他們的結(jié)果也一致。

在IBV感染的病程發(fā)展中，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗病毒方面發(fā)揮重要作用。IFN-γ屬于Th1型細(xì)胞因子，IL-4屬于Th2型細(xì)胞因子，IL-6是重要炎癥反應(yīng)密切相關(guān)因子。IFN-γ、IL-4和IL-6作為重要的細(xì)胞因子，檢測(cè)其含量在細(xì)胞免疫中的診斷意義已經(jīng)被廣泛證實(shí)［14，27-29］。本研究中預(yù)防組和治療組IL-4和IFN-γ含量顯著高于模型對(duì)照組，IL-6含量顯著低于模型對(duì)照組，說(shuō)明該植物精油可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用，從而提高機(jī)體抗IBV感染的能力。劉嬌等［30］通過(guò)在飼糧中添加植物精油，有效降低了動(dòng)物機(jī)體促炎因子的含量，緩解了機(jī)體的炎癥反應(yīng)，本研究與其一致。綜合特異性抗體結(jié)果，表明該植物精油不但可促進(jìn)體液免疫，還可以改善細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

長(zhǎng)期以來(lái)，養(yǎng)禽場(chǎng)中多種基因型IBV共流行，且不同階段存在不同的優(yōu)勢(shì)基因型毒株。目前在國(guó)內(nèi)廣泛流行的優(yōu)勢(shì)基因型主要為L(zhǎng)X4型，而Taiwan型毒株呈現(xiàn)越來(lái)越廣泛的趨勢(shì)，因此本研究選用了分別屬于這兩種基因型的毒株GX-QZ20181028和GX-NN20200723作為攻毒株。此外，目前臨床中經(jīng)常存在混合感染，LX4型和Taiwan型基因型毒株的重組也越來(lái)越多，故同時(shí)設(shè)立IBV單感染和共感染組。研究表明，植物精油對(duì)IBV單感染和共感染均有較好的預(yù)防和治療效果，盡管對(duì)這兩個(gè)毒株的防治效果稍有差別。研究表明精油對(duì)病毒的抑制可能是通過(guò)破壞囊膜，至于該植物精油對(duì)這兩種病毒防治效果的差別是否由于病毒囊膜的S1蛋白存在差異導(dǎo)致，值得進(jìn)一步研究。精油種類較多，多種血清型IBV共感染在田間很常見，將來(lái)仍需將更多不同配方的精油應(yīng)用于更多血清型IBV的研究，以便找出對(duì)所有血清型IBV效果最好的配方和探索一種可能有效對(duì)抗所有血清型IBV毒株的替代方法。此外，研究發(fā)現(xiàn)在肉雞上使用香芹酚、肉桂醛和辣椒油樹脂的特定組合可以改善動(dòng)物生產(chǎn)性能響應(yīng)變量，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，并改善腸道完整性［31］，未來(lái)也需要關(guān)注精油對(duì)動(dòng)物腸道的影響。

4 結(jié) 論

植物精油（舒檸500）對(duì)IBV單感染及共感染的雛雞均有較好的預(yù)防和治療作用，其作用主要通過(guò)抑制病毒復(fù)制、促進(jìn)免疫器官發(fā)育和抗體生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究為IB的防治提供新思路，也為其他動(dòng)物冠狀病毒的有效防治提供參考。

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（編輯 范子娟）