【關(guān)鍵詞】肺腺癌；MINK1；細(xì)胞增殖；遷移運(yùn)動(dòng)；DNA損傷修復(fù)

【中圖分類號(hào)】R735.7 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-03-13

肺癌是目前全世界發(fā)病率及致死率均高居腫瘤譜前列的惡性腫瘤，肺癌包括小細(xì)胞肺癌（約占15%）及非小細(xì)胞肺癌（約占85%），其中肺腺癌與肺鱗癌是非小細(xì)胞肺癌的主要亞型[1]。由于肺癌具有高度異質(zhì)性，其發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制尚不完全清楚；且因缺乏早期診斷指標(biāo)，其確診時(shí)往往在中晚期且伴隨轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致5年生存率仍然較低[2]。近年來(lái)雖然治療手段有所進(jìn)步，但手術(shù)切除后聯(lián)合化療治療仍是主要策略[3-6]。順鉑是一種鉑類廣譜抗癌藥物，臨床上廣泛應(yīng)用于肺癌、卵巢癌等多種實(shí)體腫瘤，且均有一定作用[7-8]。順鉑與多種DNA損傷誘導(dǎo)化療藥物作用機(jī)理類似，細(xì)胞內(nèi)可通過(guò)直接與DNA結(jié)合誘導(dǎo)DNA損傷導(dǎo)致增殖抑制及細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抗腫瘤作用[9]。但臨床實(shí)踐中隨著順鉑用藥時(shí)間推移，癌細(xì)胞易對(duì)治療產(chǎn)生耐藥而復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致患者生存率低的原因之一[10]。因此，鑒定新的潛在耐藥關(guān)鍵基因并闡明其在腫瘤耐藥復(fù)發(fā)中的關(guān)鍵分子機(jī)制，對(duì)尋找新的藥物靶點(diǎn)及提高治療敏感性具有重要意義。

Misshapen/NIK-related kinase（MINK1）是Ste20激酶家族成員之一，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示MINK1廣泛參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，作為經(jīng)典MAPK信號(hào)通路上游激酶，MINK1 可調(diào)節(jié)小G 蛋白（small G protein，Ras）、氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，c-Jun）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidyl-inositol 3-kinase，PI3K）及Wnt/β -catenin 等信號(hào)通路[13-14]；同時(shí)MINK1作為MST1/2同源物，其激酶活性亦能直接磷酸化修飾LAT1/2，從而影響Hippo 信號(hào)通路活性，最終控制細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞衰老、血小板等生理病理過(guò)程[15]。有報(bào)道顯示MINK1 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，如MINK1 高表達(dá)可促乳腺癌轉(zhuǎn)移[16]。但目前關(guān)于MINK1在肺癌中的作用及機(jī)制仍不明確。

本研究中利用肺腺癌A549 和PC-9 細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)細(xì)胞系，并檢測(cè)敲減其表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞增殖與遷移運(yùn)動(dòng)的影響，以及其對(duì)于化療藥物順鉑的響應(yīng)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549、PC-9和人胚腎293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。pLKO.1-Puro-shRNA質(zhì)粒由本課題組保存。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000 和Opti-MEDTM 培養(yǎng)基均購(gòu)于ThermoScientific公司；胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自百賽生物；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司；RNA提取試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑和TB Green? Premix Ex Taq? RT-PCR 試劑均購(gòu)買于TaKaRa公司；引物由擎科生物科技有限公司合成；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑、蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）和聚偏二氟乙烯膜（0.45 μm）均購(gòu)于鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購(gòu)于雅酶生物醫(yī)藥科技公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)于Dojindo Laboratories Japan；基質(zhì)膠（matrigel）和Transwell小室（24孔板，0.8 μm）購(gòu)自corning公司。MINK1 抗體購(gòu)于abcam 公司;γH2AX 抗體購(gòu)于CST 公司；GAPDH抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗Pro?teintech公司；順鉑購(gòu)買于sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549、PC-9細(xì)胞和293T細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10% FBS 和1% 雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基和DMEM 高糖培養(yǎng)基。

1.2.2 構(gòu)建 pLKO.1-Puro-shMINK1 載體及慢病毒包裝 MINK1 基因的shRNA靶向序列通過(guò)在線（www.sigmaaldrich.cn）設(shè)計(jì)，1#：GCTACTGAAGTTTCCCTTCAT；2#：GCGGATTAAGTTCCTGGTCAT；由擎科公司合成shRNA 引物序列。質(zhì)粒測(cè)序確認(rèn)后命名為shMINK1-1#和shMINK1-2#，對(duì)照質(zhì)粒為pLKO.1-Puro，命名為shCtrl。病毒包裝使用3 質(zhì)粒PMD2G和PSPAXL系統(tǒng)。

1.2.3 穩(wěn)定敲減MINK1 細(xì)胞系構(gòu)建 各組病毒分別感染A549 和PC-9 細(xì)胞，使用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲減表達(dá)細(xì)胞。

1.2.4 qRT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞MINK1 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平 qRT-PCR 參照文獻(xiàn)進(jìn)行操作[17]。qRT-PCR 引物序列為：MINK1上游引物為5’-GCTGAGGTCAAGCTAGTGGAT-3’，下游引物為5’-CCAATGAAAGTGTTCCGTCTGC-3’；內(nèi)參基因GAPDH 上游引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物5’-GGCTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 參照文獻(xiàn)進(jìn)行操作[17]。一抗稀釋比例為Anti-MINK1（1∶500），Anti-GAPDH（1∶5 000）。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期與凋亡 通過(guò)PI染色法分析細(xì)胞周期，Annexin-VFITC 標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.7 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) CCK-8 檢測(cè)參照說(shuō)明書進(jìn)行。各組細(xì)胞濃度為30000個(gè)/mL，每組設(shè)立0～96 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加100 μL 細(xì)胞懸液。分別在各時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8檢測(cè)試劑，450 nm處檢測(cè)吸光度（absorbance，A）值。順鉑聯(lián)合處理癌細(xì)胞，設(shè)置不同濃度順鉑A549細(xì)胞（0、1、2、4、6 μmol/L）及PC-9 細(xì)胞（0.0、0.1、0.2、0.4、0.6 μmol/L）處理3 d，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)A值。

1.2.8 劃痕實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)進(jìn)行操作[18]。待各組細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到95%左右時(shí)，在培養(yǎng)板上劃出細(xì)線并標(biāo)志出要觀察的位置。在0 h及24 h時(shí)分別拍照觀察劃痕愈合情況

1.2.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)進(jìn)行操作[18]。將細(xì)胞接種于含Matrigel小室的上層進(jìn)行細(xì)胞的侵襲（1×10⁵個(gè)/孔）實(shí)驗(yàn)。在培育24 h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色及拍照分析。

1.2.10 免疫熒光檢測(cè) 對(duì)照組和穩(wěn)定敲減組細(xì)胞鋪板后，利用順鉑處理A549細(xì)胞（1 μmol/L）及PC-9細(xì)胞（0.1 μmol/L），24 h 后4%多聚甲醛固定細(xì)胞。隨后進(jìn)行一抗及二抗染色，DAPI進(jìn)行核染色，共聚焦顯微鏡采圖（Leica SP8）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 8.0軟件分析作圖。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1 穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)A549和PC-9細(xì)胞構(gòu)建及敲減效率檢測(cè)

慢病毒感染A549和PC-9細(xì)胞后利用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR和Western blot進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示與shCtrl組相比，shMINK1-1#（A549：0.26±0.06，P=0.000；PC-9：0.31±0.05，P=0.000）和shMINK1-2#（A549：0.19±0.05，P=0.000；PC-9：0.24±0.06，P=0.000）組細(xì)胞mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖1A和B）。這表明，MINK1在肺癌A549和PC-9細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定敲減，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)A549和PC-9細(xì)胞構(gòu)建及對(duì)細(xì)胞增殖的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響。檢測(cè)結(jié)果表明，與shCtrl組相比，敲減MINK1 表達(dá)后G1 期（A549-shMINK1-1#：72.86±5.72，P=0.023；A549-shMINK1-2#：68.24±3.97，P=0.049；PC-9-shMINK1-1#：63.71±4.64，P=0.048；PC-9-shMINK1-2#：68.93±4.95，P=0.015）細(xì)胞均顯著增加，而S期（A549-shMINK1-1#：24.82±4.96，P=0.031；A549-shMINK1-2#：30.36±5.15，P=0.021；PC-9-shMINK1-1#：34.16±3.63，P=0.034；PC-9-shMINK1-2#：27.52±3.1，P=0.016）與G2/M期細(xì)胞減少（A549-shMINK1-1#：2.47±1.09，P=0.049；A549-shMINK1-2#：1.54±0.98，P=0.016；PC-9-shMINK1-1#：2.26±0.51，P=0.044；PC-9-shMINK1-2#：3.68±0.75，P=0.043）（圖2A），這表明敲減MINK1表達(dá)影響肺腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程。進(jìn)一步通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)后肺腺癌細(xì)胞增殖能力。如圖2B所示，細(xì)胞培養(yǎng)96 h后，A549和PC-9細(xì)胞中敲減MINK1表達(dá)組與shCtrl（A549：2.18±0.22；PC-9：1.87±0.25）相比，shMINK1-1#（A549：1.07±0.13，P=0.001；PC-9：1.14±0.12，P=0.010）和shMINK1-2#（A549：0.89±0.16，P=0.001；PC-9：0.92±0.14，P=0.004）組的生長(zhǎng)速度明顯降低。同時(shí)，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)步一步證明肺腺癌細(xì)胞中敲減MINK1 表達(dá)抑制細(xì)胞增殖（A549-shCtrl：98.52±10.93；A549-shMINK1-1#： 38.66±5.31，P=0.001；A549-shMINK1-2#：34.29±6.28，P=0.000；PC-9-shCtrl：87.34±13.41；PC-9-shMINK1-1#：26.73±4.26，P=0.001；PC-9-shMINK1-2#：30.17±4.92，P=0.009）（圖2C）。這些實(shí)驗(yàn)表明肺腺癌A549和PC-9細(xì)胞中MINK1表達(dá)對(duì)維持癌細(xì)胞增殖具有重要作用。

2.3 肺腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)增強(qiáng)順鉑治療敏感性

肺腺癌細(xì)胞中敲減MINK1表達(dá)阻滯細(xì)胞中周期進(jìn)程并抑制細(xì)胞增殖，隨后通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化情況。結(jié)果顯示，與shCtrl相比，穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)組細(xì)胞凋亡比率上升（A549-shCtrl：2.56±1.22；A549-shMINK1-1#：7.41±2.30，P=0.032；A549-shMINK1-2#：8.25±2.43，P=0.022；PC-9-shCtrl：3.17±1.42；PC-9-shMINK1-1#：8.69±2.34，P=0.025；PC-9-shMINK1-2#：6.97±1.85，P=0.046）（圖3A）。已有研究表明，癌細(xì)胞凋亡抑制與化療藥物耐藥密切相關(guān)。隨后通過(guò)聯(lián)合順鉑處理shCtrl組及穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)組檢測(cè)細(xì)胞增殖變化情況。采用較低濃度劑量順鉑聯(lián)合處理分析MINK1 敲減細(xì)胞增殖變化情況。如圖3B 所示，當(dāng)shMINK1-1#和shMINK1-2#組的A549和PC-9細(xì)胞接受濃度梯度的順鉑處理時(shí)，沉默MINK1 表達(dá)的shMINK1-1#和shMINK1-2#組的細(xì)胞存活率明顯降低（A549-shCtrl：0.68±0.07；A549-shMINK1-1#：0.42±0.06，P=0.008；A549-shMINK1-2#：0.51±0.07，P=0.001；PC-9-shCtrl：0.76±0.06；PC-9-shMINK1-1#：0.43±0.08，P=0.003；PC-9-shMINK1-2#：0.49±0.05，P=0.005）。化療藥物順鉑殺傷癌細(xì)胞由于其與DNA結(jié)合而誘導(dǎo)DNA損傷從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步分析MINK1敲減細(xì)胞聯(lián)合順鉑處理后DNA損傷變化情況，通過(guò)免疫熒光染色DNA損傷標(biāo)志物γH2AX變化情況。如圖3C 所示，較低濃度順鉑處理24 h 后shMINK1-1# 和shMINK1-2#組細(xì)胞中γH2AX應(yīng)該信號(hào)顯著增強(qiáng)，表明敲減MINK1表達(dá)癌細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷敏感。這些研究結(jié)果表明，在肺腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)可能通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷增強(qiáng)其對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑對(duì)癌細(xì)胞殺傷。

2.4 肺腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲

最后利用劃痕和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)對(duì)于A549和PC-9細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在24 h后shMINK1-1#和shMINK1-2#組A549和PC-9細(xì)胞中的遷移區(qū)域明顯小于shCtrl組（圖4A和B）。另外，對(duì)shMINK1-1#和shMINK1-2#穿過(guò)小室的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與shCtrl組相比，shMINK1-1#和shMINK1-2#組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少（A549-shMINK1-1#：0.28±0.04，P=0.000；A549-shMINK1-2#：0.29±0.07，P=0.000；PC-9-shMINK1-1#：0.25±0.08，P=0.000；PC-9-shMINK1-2#：0.32±0.06，P=0.000）（圖4C和4D）。結(jié)果表明下調(diào)MINK1的表達(dá)可以顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

3討論

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中常見的屬非小細(xì)胞肺癌，主要包含肺腺癌和肺鱗癌兩種亞型[19]。隨著傳統(tǒng)放化療及分子靶向治療和免疫治療技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，目前非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后和生存有了明顯改善；但仍有部分患者對(duì)治療藥物不敏感，且大部分患者在治療后易出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致治療失敗而復(fù)發(fā)[8，20]。因此，進(jìn)一步尋找篩選非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵基因及鑒定化療治療的相關(guān)標(biāo)志物，為耐藥機(jī)制的研究及開發(fā)提供分子靶點(diǎn)，對(duì)于患者風(fēng)險(xiǎn)分層及耐藥進(jìn)展監(jiān)測(cè)具有重要意義，可望指導(dǎo)耐藥易感患者的后續(xù)治療方案改善。

促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase" ki?nases，MAPKKKKs，MAP4Ks）絲氨酸/蘇氨酸激酶家族包含7個(gè)成員，分別為MAP4K1-7，其蛋白結(jié)構(gòu)保守，均由N端的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化激酶結(jié)構(gòu)域，C端與微絲骨架調(diào)控密切相關(guān)的Citron 同源結(jié)構(gòu)域（C-terminal citron-homology domain）及中間可變連接區(qū)組成[11，21-22]。其中MAP4K4、MAP4K6（MINK1）與MAP4K7（TNIK）3個(gè)蛋白成員序列相似性高，可執(zhí)行相似功能。如在調(diào)控神經(jīng)元中應(yīng)急誘導(dǎo)的JNK通路活性過(guò)程中MAP4K4、MINK1與TNIK具有相似作用[13，23]。同時(shí)，MAP4K4、MINK1及TNIK與Hippo通路關(guān)鍵激酶MST1/2具有相似功能，可直接磷酸化修飾LATS1/2，在控制細(xì)胞感受胞外基質(zhì)機(jī)械應(yīng)力傳導(dǎo)及DNA 損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用[23-24]。但報(bào)道顯示MAP4K4、MINK1與TNIK生理及病理?xiàng)l件下亦可通過(guò)各自獨(dú)立下游通路執(zhí)行不同功能，如MINK1不僅對(duì)于輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）分化及功能具有關(guān)鍵作用[25-26]，且MINK1 可通過(guò)mTOR 通路促乳腺癌發(fā)生[16]；而MAP4K4 則通過(guò)調(diào)節(jié)EB2與IQSEC1控制黏著斑動(dòng)態(tài)更新影響細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)[27]；另外，肺鱗癌中TNIK 通過(guò)Merlin 控制FAK通路活性從而促腫瘤發(fā)生[28]。但迄今為止，關(guān)于MINK1在肺癌等其他惡性腫瘤中的具體作用機(jī)制仍未見報(bào)道。前期研究在肺腺癌細(xì)胞中通過(guò)對(duì)MAP4K4及TNIK進(jìn)行敲減分別構(gòu)建穩(wěn)定敲減表達(dá)細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲減MAP4K4表達(dá)誘導(dǎo)A549細(xì)胞成簇生長(zhǎng)[29]，而穩(wěn)定敲減TNIK表達(dá)未檢測(cè)到癌細(xì)胞成簇生長(zhǎng)表型，但檢測(cè)到黏著斑FAK信號(hào)通路顯著變化[30]。本研究利用A549及PC-9 2個(gè)肺腺癌細(xì)胞建立穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)細(xì)胞系，并對(duì)其進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定敲減MINK1表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力，且影響DNA損傷修復(fù)而增強(qiáng)化療藥物順鉑殺傷效用。通過(guò)觀察穩(wěn)定敲減MAP4K4、MINK1 及TNIK 表達(dá)A549 細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)敲減3個(gè)基因表達(dá)表型差異明顯，表明在惡性腫瘤中MAP4K4、MINK1及TNIK可能具有不同功能，但潛在的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。