【關(guān)鍵詞】miR-370-3p；Sestrin2；脂多糖；肺泡上皮細(xì)胞；壞死性凋亡

【中圖分類(lèi)號(hào)】R563 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-07-27

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一種威脅生命的臨床疾病，其特征是彌漫性肺泡損傷、肺水腫和不受控制的炎癥[1]。新冠肺炎導(dǎo)致的ARDS 死亡人數(shù)前所未有，這突出表明ARDS的治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[2]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)ALI/ARDS新的治療靶點(diǎn)。肺泡-毛細(xì)血管屏障的破壞是ALI病理生理學(xué)的一個(gè)重要方面，其導(dǎo)致彌漫性肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cells，AECs）損傷[3]。隨后，受損的AECs釋放損傷相關(guān)的分子模式來(lái)激活肺泡巨噬細(xì)胞，放大炎癥反應(yīng)，并加劇ALI/ARDS[3]。因此，闡明AECs 損傷的分子機(jī)制可能為ALI的治療提供潛在策略。在ALI中已報(bào)道了幾種形式的細(xì)胞死亡，如凋亡、焦亡、鐵死亡、壞死和程序性壞死[4]。最近1項(xiàng)研究表明，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI小鼠中，程序性壞死是AECs死亡的主要原因[5]。然而，在ALI過(guò)程中引發(fā)AECs程序性壞死的機(jī)制尚不清楚。微小核糖核酸（MicroRNAs，miRNAs）是小的非編碼核糖核酸分子，被認(rèn)為是基因表達(dá)的內(nèi)源性生理調(diào)節(jié)因子[6]。鑒于單個(gè)miRNA可能會(huì)改變復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、炎癥免疫反應(yīng)和細(xì)胞間相互作用，因此它們的異常表達(dá)可能與ARDS 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。miR-370-3p作為一種重要的miRNA，它可能會(huì)改變復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、凋亡和入侵[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠肺中miR370-3p過(guò)表達(dá)，并被提議作為膿毒癥狀態(tài)的生物標(biāo)志物，其作用機(jī)制可能與細(xì)胞線粒體功能障礙相關(guān)[8]。此外，miR-370-3p還與LPS誘導(dǎo)的兒童肺炎肺損傷有關(guān)[9]。值得注意的是，線粒體功能障礙與AECs的程序性壞死密切相關(guān)[10]。因此，在目前的研究中，旨在通過(guò)使用ALI 動(dòng)物模型來(lái)鑒定miR-370-3p 是否參與ALI的程序性壞死，并試圖了解miR-370-3p與線粒體功能之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

本研究中使用的成年雄性C57BL/6J 小鼠（6 周齡，22～24 g）購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)在濕度為50%～60%、溫度為24～26 ℃且光照/黑暗周期為12 h的受控環(huán)境中。

將小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和LPS組，每組6只。LPS組小鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg，美國(guó)Sigma公司）進(jìn)行麻醉，通過(guò)氣管內(nèi)注射LPS（5 mg/kg，溶解在生理鹽水中，來(lái)自大腸桿菌O111：B4，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）來(lái)誘導(dǎo)ALI[11]。對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)注射相同劑量的生理鹽水。此外，為了考察miR-370-3p 抑制對(duì)LPS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠肺的病理?yè)p傷影響，將小鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)PS+anti-NC組和LPS+miR-370-3p抑制劑（anti-miR-370-3p）組，每組12 只。LPS+anti-miR-370-3p組小鼠尾靜脈注射anti-miR-370-3p（2 mg/kg，上海捷瑞生物工程有限公司），和LPS+anti-NC組小鼠給予相同量的anti-NC。2 d后，小鼠氣管內(nèi)注射LPS（5 mg/kg），12 h后處死小鼠。

1.2 組織病理學(xué)分析

小鼠右上肺固定在4% 多聚甲醛中，然后包埋在石蠟中。將肺組織切成3 μm切片，蘇木精-伊紅（Hamp;E）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。肺損傷由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的研究者進(jìn)行測(cè)量，按照損傷嚴(yán)重程度（有無(wú)出血、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、透明膜、肺泡內(nèi)碎片和中隔增厚）進(jìn)行盲法評(píng)分，評(píng)分等級(jí)為0～4 級(jí)[12]：0 分表示沒(méi)有受傷；l 分lt;25% 損傷；2 分25%～50%損傷；3分50%～75%損傷和4分gt;75%損傷。將2個(gè)分?jǐn)?shù)平均，得到最終的炎癥分?jǐn)?shù)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

小鼠AECs系MLE12購(gòu)自美國(guó)ATCC，并在37 ℃下在含有2%新生小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中培養(yǎng)。用LPS 處理（5 μg/mL）刺激不同時(shí)間（0 h、6 h、12 h、24 h）誘導(dǎo)AECs損傷。為了抑制miR-370-3p，用miR-370-3p抑制劑（10 nmol/L）處理MLE12細(xì)胞 24 h。

為了考察si-SESN2轉(zhuǎn)染對(duì)MLE12細(xì)胞中SESN2蛋白表達(dá)的影響，將MLE12細(xì)胞分為：Con組、si-NC組和si-SESN2組。si-NC 組和si-SESN2 組分別用對(duì)照siRNA（si-NC）或SESN2 siRNA（si-SESN2；均購(gòu)自上海GenePharma有限公司）轉(zhuǎn)染MLE12細(xì)胞24 h。

為了探討miR-370-3p/SESN2通路在LPS誘導(dǎo)線粒體損傷中的作用，將MLE12 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（Con+anti-NC）、Con+anti-miR-370-3p 組、LPS+anti-NC 組、LPS+antimiR-370-3p組、LPS+si-SESN2+anti-miR-370-3p組。在LPS刺激前，各組用Lipofectamine 2000 TM試劑（美國(guó)Invitrogen公司）將anti-NC、anti-miR-370-3p或si-SESN2轉(zhuǎn)染MLE12細(xì)胞24 h，然后LPS+anti-NC 組、LPS+anti-miR-370-3p 組、LPS+si-SESN2+anti-miR-370-3p組加入LPS處理（5 μg/mL）處理24 h，而Con+anti-NC組、Con+anti-miR-370-3p組加入等量培養(yǎng)基處理 24 h。

1.4 免疫熒光染色

將肺組織切片脫蠟，用0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液透化，加熱以回收抗原。在37 ℃下用3% H2O2封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶10 min 后，用5% 牛血清白蛋白（BSA，美國(guó)Biofroxx 公司）封閉切片1 h，然后在4 ℃下與小鼠抗MLKL單克隆抗體（1∶100，美國(guó)Proteintech 公司）和兔抗表面活性劑蛋白C（SPC）多克隆抗體（1∶100，美國(guó)ABclonal公司）在PBS中孵育過(guò)夜。用PBS洗滌切片3次，并與綠色熒光FITC山羊抗兔IgG（1∶400）在PBS中孵育2 h，細(xì)胞核用4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，北京Solarbio公司）染色，觀察載玻片，并用熒光顯微鏡（日本Nikon公司）捕捉圖像。

1.5 定量實(shí)時(shí)PCR分析

使用RNeasy Mini試劑盒（美國(guó)QIAGEN公司）從右肺組織或細(xì)胞中提取總RNA樣品。應(yīng)用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）合成cDNA。使用TB Green PCR MasterMix（日本Takara 公司）在CFX96 Touch 實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）上檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。使用標(biāo)準(zhǔn)的2△△CT方法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)，以U6作為內(nèi)標(biāo)。本研究中使用的引物序列如下：miR-370-3p（F）：5’-CAGGCAGGCAGTATCACTCA-3’；miR-370-3p（RT）：5’-AGCTCATATGGGTCCGACAG-3’，U6（F）：5’-TTCCAGCCTTCCTTCTTG-3’，U6（R）：5’-GGAGCCAGAGCAGTAATC-3’。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析從肺組織或MLE12細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)表達(dá)。將左上肺勻漿并在含有蛋白酶抑制劑苯基甲烷磺酰氟的RIPA緩沖液（北京Solarbio公司）中溶解。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）測(cè)量蛋白濃度。將5倍樣品緩沖液與蛋白質(zhì)樣品（1：4）混合，通過(guò)10%SDS-PAGE 凝膠分離。轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（美國(guó)Millipore公司）后，室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后與針對(duì)絲氨酸蘇氨酸激酶3（Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3，RIPK3）（1∶2 000，英國(guó)Abcam 公司）、混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（Mixed Lineage KinaseDomain-Like，MLKL）（1∶2 000，美國(guó)abclonal 公司）、SESN2（1∶1 500，英國(guó)Abcam 公司）、肺表面活性蛋白C（surfactantprotein C，SPC）（1∶2 000，美國(guó)Protentech公司）、α微管蛋白（α-Tubulin）（1∶10 000，美國(guó)Santa Cruz公司）一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。在室溫下與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體（1：5 000，英國(guó)Abcam公司）孵育1 h后，通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher公司）觀察條帶。

1.7 Hoechst 33342和PI染色

將MLE12細(xì)胞（1×105細(xì)胞/孔）鋪在6孔培養(yǎng)板的蓋玻片上，并進(jìn)行指定的處理。將細(xì)胞與Hoechst 33342（1 μg/mL）和PI（5 μg/mL）（上海Beyotime公司）在37 ℃下孵育15 min。使用Eclipse Ni-U 熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）捕捉熒光圖像。

1.8 線粒體形態(tài)學(xué)

Mito-Tracker免疫染色觀察線粒體形態(tài)。將24孔板中的MLE12 細(xì)胞在室溫下用4% 多聚甲醛中固定15 min，用PBS 洗滌3 次，用100 nmol/L Mito-Tracker 紅CMXRos（上海Beyotime公司）孵育30 min。在熒光顯微鏡下獲取圖像。

1.9 線粒體膜電位的測(cè)量

使用JC-1分析試劑盒（上海Beyotime公司）測(cè)定線粒體膜電位變化。收獲在48孔板中培養(yǎng)的MLE12細(xì)胞（1×104細(xì)胞/孔）。用PBS洗滌細(xì)胞，然后重懸于100 μL DMEM/F12培養(yǎng)基中，并與JC-1工作溶液（培養(yǎng)基與JC-1工作溶液的比例為1∶1）一起在37 ℃黑暗中孵育20 min。使用熒光顯微鏡獲得圖像。用紅-綠熒光比值評(píng)價(jià)線粒體膜電位的變化。將紅/綠免疫信號(hào)轉(zhuǎn)換成平均灰度強(qiáng)度，然后通過(guò)Image J軟件分析以確定免疫熒光。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

采用Targetscan 搜索miR-370-3p 的下游基因，并預(yù)測(cè)了miR-370-3p和SESN2結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)將含有miR-370-3p結(jié)合位點(diǎn)的SESN2-WT或MUT片段插入到pmirGLO載體（美國(guó)Promega公司）中，構(gòu)建SESN2-野生型（WT）或SESN2-突變體（MUT）載體。使用Lipofectamine 2000試劑將SESN2-WT、SESN2-MUT、載體和miR-370-3p質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到MLE12中。24 h 后，通過(guò)Nano-Glo 雙熒光素酶報(bào)告方法（美國(guó)Promega公司）測(cè)定熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，并采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）形式表達(dá)。2 組之間的統(tǒng)計(jì)比較采用t 檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，隨后通過(guò)Bonferroni校正進(jìn)行組間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)肺和AECs中miR-370-3p表達(dá)上調(diào)

為了確定miR-370-3p在ALI期間是否發(fā)生變化，本課題組首先通過(guò)氣管內(nèi)注射LPS建立了一個(gè)廣泛使用的ALI小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加、肺泡隔增厚、出血和透明膜形成（圖1A）。與對(duì)照組相比，LPS組ALI小鼠肺組織中miR-370-3p表達(dá)上調(diào)（t=15.840，Plt;0.001）（圖1B）。

此外，檢測(cè)了LPS刺激下AECs中miR-370-3p表達(dá)。與體內(nèi)結(jié)果一致，與對(duì)照組相比，LPS組AECs中miR-370-3p表達(dá)顯著上調(diào)（t=18.020，Plt;0.001）（圖1C）。

2.2 miR-370-3p的抑制減輕了LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺的病理?yè)p傷和壞死性凋亡

為了進(jìn)一步闡明抑制miR-370-3p對(duì)ALI的減輕作用，在LPS給藥（2.5 mg/kg，i.t.）前1 d，C57BL/6J小鼠尾靜脈注射miR-370-3p 抑制劑（2 mg/kg）。與LPS+anti-NC 組相比，LPS+anti-miR-370-3p組肺組織中miR-370-3p表達(dá)顯著降低（t=22.430，Plt;0.001），并且肺部炎癥評(píng)分顯著降低（t=3.320，P=0.026），表現(xiàn)在肺中浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞、肺泡萎陷和肺泡壁厚度減少（圖2A～C）。

壞死性凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，是ALI中AECs死亡的主要方式。與LPS+anti-NC 組相比，LPS+anti-miR-370-3p 組肺組織中RIPK3、MLKL 蛋白水平顯著減少（t=8.460、t=9.520，均Plt;0.001），而SPC 蛋白水平顯著增加（t=3.950，P=0.012）（圖2D）。為了進(jìn)一步闡明miR-370-3p的抑制是否主要減輕ALI小鼠AECs的壞死性凋亡，使用免疫熒光檢測(cè)SPC 和MLKL 的共定位。結(jié)果顯示，在LPS+antimiR-370-3p組中，SPC和MLKL蛋白在ALI小鼠的肺組織中共表達(dá)減少（圖2E）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明miR-370-3p的抑制減輕了LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠中AECs的壞死性凋亡。

2.3 miR-370-3p的抑制減輕體外LPS刺激下AECs的壞死性凋亡

在MLE12 細(xì)胞中LPS 處理后，觀察到RIPK3、MLKL 以時(shí)間依賴性表達(dá)上調(diào)（F=135.260、F=150.840，均Plt;0.001）（圖3A）。為了進(jìn)一步研究LPS誘導(dǎo)的AECs死亡的性質(zhì)，使用Hoechst 33342/PI染色來(lái)闡明細(xì)胞膜的完整性。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)PI攝?。ㄙ|(zhì)膜完整性的喪失）（F=93.820，Plt;0.001）（圖3B）。結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)AECs壞死性凋亡。

為了進(jìn)一步闡明抑制miR-370-3p是否會(huì)減輕AECs和ALI的壞死性凋亡，本課題組評(píng)估了在LPS刺激下miR-370-3p 抑制劑對(duì)MLE12 細(xì)胞的影響。用miR-370-3p 抑制劑（10 nmol/L）預(yù)處理24 h后，MLE12細(xì)胞接受LPS（5 μg/mL）處理24 h。結(jié)果顯示，與Con+anti-NC組相比，LPS+anti-NC組MLE12 細(xì)胞中RIPK3、MLKL 蛋白表達(dá)顯著增加（Plt;0.001），并且PI 陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著增加（Plt;0.001）。與LPS+anti-NC 組相比，LPS+anti-miR-370-3p 組中RIPK3、MLKL蛋白表達(dá)顯著降低（P=0.005、Plt;0.001），并且PI陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著降低（P=0.004）（圖4A～B）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，在體外LPS刺激下，miR-370-3p的抑制減輕了AECs的壞死性凋亡。

2.4 抑制miR-370-3p減輕線粒體斷裂和線粒體膜電位降低

CMXRos 染色的免疫熒光染色顯示Con+anti-NC 組和Con+anti-miR-370-3p 組MLE12 細(xì)胞中存在完整的線粒體網(wǎng)絡(luò)，而在LPS+anti-NC組和LPS+anti-miR-370-3p組MLE12細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了顯著的片段化。與LPS+anti-NC組相比，LPS+anti-miR-370-3p 組線粒體片段化顯著增加（P=0.018）（圖5A）。進(jìn)行JC-1分析以評(píng)估細(xì)胞中的δψm。如圖5B所示，與Con+anti-NC組相比，LPS+anti-NC組MLE12細(xì)胞顯示出更大的綠色熒光和更低的紅色熒光強(qiáng)度（Plt;0.001），表明δψm被耗散。相比之下，LPS+anti-miR-370-3p組中綠色和紅色熒光強(qiáng)度分別降低和增加（P=0.022），表明抑制miR-370-3p部分逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的δψm耗散。

2.5 Sestrin2（SESN2）是miR-370-3p的直接下游mRNA靶標(biāo)根據(jù)4 種不同的miRNA 靶預(yù)測(cè)工具miRanda、Tar?getScan、RNAhybrid 和PITA 的結(jié)果，SESN2是AECs中miR-370-3p 的重疊靶。圖6A 顯示了使用TargetScan 匹配miR-370-3p的種子序列的SESN2的3’UTR中的片段。熒光素酶報(bào)道基因測(cè)定顯示miR-370-3p 對(duì)SESN2-WT 報(bào)道基因的熒光素酶活性具有抑制作用（P=0.017），而當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變時(shí)，熒光素酶活性保持不受影響（圖6B）。在MLE12細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，觀察到SESN2表達(dá)下調(diào)。此外，在用不同濃度的miR-370-3p抑制劑轉(zhuǎn)染的MLE12細(xì)胞中，觀察到SESN2表達(dá)以濃度依賴性上調(diào)（圖6C）。

為了研究miR-370-3p 是否通過(guò)調(diào)節(jié)SESN2 的表達(dá)在LPS誘導(dǎo)的AECs線粒體功能障礙中起作用，本課題組敲低了MLE12細(xì)胞中SESN2蛋白表達(dá)（圖7），并設(shè)置了挽救實(shí)驗(yàn)，包括LPS+si-SESN2+anti-miR-370-3p組。結(jié)果顯示，與LPS+anti-miR-370-3p 組相比，LPS+si-SESN2+anti-miR-370-3p 組線粒體片段化和線粒體膜電位均顯著降低（P=0.015、P=0.011）（圖5）。

3討論

目前，ALI仍然是臨床上主要的呼吸系統(tǒng)疾病之一，治療效果有限，病死率高。線粒體動(dòng)力學(xué)參與了ALI的發(fā)展。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的線粒體是高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)相反的融合和分裂途徑維持線粒體生物能功能和體內(nèi)平衡[13]。近年來(lái)，線粒體動(dòng)力學(xué)在ALI中的作用備受關(guān)注[14]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，線粒體融合受到抑制導(dǎo)致ALI中的線粒體斷裂[15]。目前，對(duì)ALI線粒體動(dòng)力學(xué)的研究主要集中在肺泡巨噬細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，在LPS 誘導(dǎo)的Sprague-Daw ley大鼠和RAW264.7細(xì)胞的ALI肺組織中，MFN2和OPA1的表達(dá)下調(diào)，DRP1上調(diào)，導(dǎo)致線粒體動(dòng)態(tài)失衡[16]。在LPS應(yīng)激的NR8383細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)線粒體的形態(tài)損傷，上調(diào)線粒體融合蛋白的表達(dá)，下調(diào)分裂蛋白的表達(dá)，從而改善ALI[15]。在這里發(fā)現(xiàn)miR-370-3p 上調(diào)與LPS 刺激下AECs 的線粒體功能障礙密切相關(guān)。

本研究表明，miR-370-3p上調(diào)是ALI的重要內(nèi)源性致病機(jī)制。miR-370-3p位于DLK1-DIO3結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該結(jié)構(gòu)域已被鑒定為人類(lèi)14號(hào)染色體上的癌癥相關(guān)基因組區(qū)域[17]。幾項(xiàng)研究報(bào)道，miR-370-3p與各種類(lèi)型的癌癥的致瘤性有關(guān)[18-19]。值得注意的是，最近研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥腦病中miR370-3p的上調(diào)是膿毒癥分子（LPS和TNF-α）激活的結(jié)果，這種激活通過(guò)抑制線粒體融合過(guò)程，導(dǎo)致線粒體斷裂并參與器官損傷[20]。因此，本研究探討了miR-370-3p是否參與了ALI的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激下，肺組織和AECs中miR-370-3p表達(dá)上調(diào)。為了探索miR-370-3p在ALI病理過(guò)程中的作用，體內(nèi)使用了miR-370-3p 抑制劑敲低肺組織中miR-370-3p 表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)miR-370-3p 的抑制減輕了ALI小鼠的病理?yè)p傷和炎癥反應(yīng)，并上調(diào)了SPC蛋白的表達(dá)。AECs是肺中的結(jié)構(gòu)細(xì)胞，AECs的損傷影響氣體交換，這是ALI患者發(fā)生難治性低氧血癥的關(guān)鍵原因。各種損傷因素刺激AECs，破壞肺泡屏障的完整性，然后激活巨噬細(xì)胞，釋放炎癥因子，加重ALI[4]。SPC是AECs的特異性標(biāo)志物之一，其降低可增加肺泡表面張力，加重AECs 損傷[5]。因此，這些研究表明miR-370-3p抑制可能保護(hù)肺組織內(nèi)皮細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)，在體外和體內(nèi)，miR-370-3p上調(diào)引起的AECs損傷激活了壞死性凋亡。壞死性凋亡被認(rèn)為是ALI過(guò)程的驅(qū)動(dòng)力[21]。最近的1項(xiàng)研究表明，在LPS誘導(dǎo)的ALI中，壞死性凋亡是AECs的主要死亡方式，但ALI期間AECs壞死性凋亡的分子機(jī)制尚未完全闡明[5]。本研究的發(fā)現(xiàn)表明抑制miR-370-3p 減少了RIPK3 和MLKL 的水平，證明miR-370-3p缺乏減輕了ALI小鼠的壞死性凋亡。為了進(jìn)一步闡明AECs是否是參與壞死性凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞，課題組檢測(cè)了SPC和MLKL的共定位表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)抑制miR-370-3p減少了二者在ALI小鼠肺組織中共定位表達(dá)。與體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)一致，在體外AECs損傷前給予miR-370-3p抑制劑減輕了LPS刺激下AECs的壞死性凋亡。

線粒體是AECs的重要細(xì)胞器，不僅因?yàn)槠洚a(chǎn)生ATP的功能，還因?yàn)槠湓贏ECs暴露于環(huán)境壓力或損傷時(shí)傳遞細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的作用[10]。持續(xù)的線粒體功能障礙可導(dǎo)致氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的AECs損傷，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡增加、增殖減少、生物功能受損[13]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，線粒體功能障礙是壞死性凋亡的主要機(jī)制之一[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-370-3p減輕了LPS誘導(dǎo)的線粒體斷裂，和增加了線粒體膜電位。此外，miR-370-3p 負(fù)調(diào)控SESN2 表達(dá)。SESN2是Sestrins蛋白家族的一員，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧、氧化應(yīng)激和DNA損傷等許多病理生理過(guò)程中起主要作用[24]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞ROS積累上調(diào)SESN2，激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，促進(jìn)片段化線粒體中的選擇性自噬[24]。此外，SESN2 還介導(dǎo)AMPK-PGC1α激活，以促進(jìn)線粒體生物合成，從而減少氧葡萄糖耗竭導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[25]。因此，SESN2作為一種高度保守的多功能蛋白，在線粒體相關(guān)的損傷中具有保護(hù)作用。本研究中，敲低SESN2逆轉(zhuǎn)了miR-370-3p敲低對(duì)LPS誘導(dǎo)的線粒體功能障礙的保護(hù)作用。同時(shí)，miR-370-3p 與SESN2有調(diào)節(jié)關(guān)系，表明它們?cè)贚PS刺激下AECs的壞死性凋亡中起重要作用。

總之，本研究表明miR-370-3p/SESN2 軸通過(guò)介導(dǎo)線粒體斷裂和損害線粒體功能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的ALI期間AECs壞死性凋亡。這些發(fā)現(xiàn)為未來(lái)研究miR-370-3p、線粒體動(dòng)力學(xué)和ALI中AECs 丟失之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。然而，這項(xiàng)研究并不是全面的，需要進(jìn)一步研究以揭示miR-370-3p的深層調(diào)控機(jī)制，如miR-370-3p的其他靶基因作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)。