【關(guān)鍵詞】普蘆卡必利；慢傳輸型便秘；5-羥色胺；5-羥色胺3受體；5-羥色胺4受體

【中圖分類號】R926 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-01-22

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC），是指結(jié)腸的運動功能障礙，腸內(nèi)容物傳輸緩慢所引起的便秘，主要癥狀為排便次數(shù)少，糞便干硬，常伴排便費力、腹脹[1]。隨著生活方式的改變，STC已成為影響患者身心健康的重要因素之一。國內(nèi)外研究顯示，慢性便秘的患病率越來越高，且隨著年齡增長而增加，65歲以上人群尤為明顯，女性患病的頻率是男性的十倍[2-3]。

STC的發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前認為可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)病變、Cajal 間質(zhì)細胞（interstitial cells ofCajal，ICC）分布與功能異常、激素神經(jīng)遞質(zhì)包括5-HT異常等有關(guān)[4-5]。5-HT 是腸道中重要的神經(jīng)遞質(zhì)和旁分泌信號分子，與多種腸胃道疾病的發(fā)病機制相關(guān)，5-HT受體主要有7大類型，其中5-HT3R、5-HT4R與胃腸運動功能最為密切，是胃腸功能障礙治療的主要靶點[6-8]。相關(guān)研究表明5-HT在胃腸道內(nèi)的生理功能調(diào)節(jié)中起重要作用，5-HT 和相關(guān)受體參與了腸道運動，腸道分泌和內(nèi)臟敏感性的調(diào)節(jié)[9-10]。

普蘆卡必利（力洛）是二氫苯并呋喃甲酰胺衍生物的代表藥物，是首個選擇性、高親和性5-HT4受體激動劑。本學(xué)科相關(guān)經(jīng)典著作及診療規(guī)范均已把（5-HT4 受體激動劑）本藥納入STC 的一線用藥。目前，普蘆卡必利僅批準為用于治療成年女性患者的慢性便秘癥狀，由于疾病的慢性、長期反復(fù)性，患者往往需要長期服藥，雖然本藥的服用方法簡便（每日1次，每次2 mg，連續(xù)服用4 周），但長期服藥對疾病進展、受體表達水平的影響尚無明確的證據(jù)；臨床上聯(lián)合用藥、重復(fù)用藥等情況多有發(fā)生，仍存在較大爭議，亟待通過基礎(chǔ)研究加以求證。

本課題擬通過選用成年雌性SD大鼠，隨機分為正常組，模型組，普蘆卡必利（力洛）組，分組干預(yù)2個月，通過對大鼠一般情況、首次白便排出時間、糞便含水率以及5-HT、5-HT3R、5-HT4R等變化進行觀察和測量，為臨床規(guī)范化應(yīng)用5-HT4受體激動劑（普蘆卡必利等同類藥物）提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：30只健康SD 大鼠（雌性，SPF 級），體重（200±20） g，6～7周，飼養(yǎng)于SPF實驗室1周。大鼠由江西中洪博元生物技術(shù)有限公司提供（動物使用許可證號：SYXK（贛）2020-0001）。本研究所涉及的動物實驗均經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理和使用委員會批準（倫理審批編號：20220155）。

實驗試劑：復(fù)方地芬諾酯片（河南鼎昌藥業(yè)，貨號：H41023169），琥珀酸普蘆卡必利片（國藥豪森，貨號：H20183482），AB-APS 染色試劑盒（solarbio，貨號：G1285），ELISA檢測試劑盒（酶聯(lián)生物，貨號：ml003125），目的蛋白一抗（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：FNab09928），山羊抗大鼠二抗（碧云天，貨號：A0192）

1.2 方法

1.2.1 分組和造模 隨機將大鼠分為空白組（10只）及造模組（20 只），造模組選擇復(fù)方地芬諾酯進行造模，使用15 mg/（kg·d）復(fù)方地芬諾酯進行灌胃，正常組以等體積生理鹽水灌胃處理，每日1次，連續(xù)14 d。造模后第1天開始藥物干預(yù)，用藥劑量參照人與動物體表面積換算，劑量為0.2 mg（/ kg·d），正常組和模型組給予同量生理鹽水，每日1次，共給藥60 d。末次給藥后處死大鼠，取結(jié)腸組織、大鼠全血進行后續(xù)實驗。

1.2.2 首次白便排出時間記錄 大鼠給藥處理30 min后，給予硫酸鋇懸液（1∶1）2 mL灌胃。正式實驗之前，需排除第一粒白便，隨后，觀察并記錄每只大鼠排出首粒白便所耗的時長。記錄時刻分別為：第1、7、14、21、30、40、50、60天。

1.2.3 大鼠糞便水分含量測定 收集每組大鼠在不同時刻排除的糞便做好標記，稱量并記錄其濕量。隨后，將糞便進行烘干，再稱量和記錄其干重。通過公式計算并統(tǒng)計每組大鼠糞便中含水量差異。糞便含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.4 大鼠結(jié)腸含水量測定 取不同大鼠的結(jié)腸組織進行標記，稱重并記錄濕重。隨后，將不同分組的結(jié)腸組織于60 ℃烘干箱處理6 h后稱量并記錄其干重。通過公式計算結(jié)腸組織的含水率。結(jié)腸含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.5 HE病理染色 取大鼠結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定24～48 h，脫水并包埋于石蠟中，隨后在4 μm 處連續(xù)切片。采用蘇木精-伊紅染色試劑盒（Solarbio，G1120）對石蠟切片進行染色。所有圖像均使用顯微鏡（CX43，OLYMPUS）獲取。

1.2.6 結(jié)腸黏液分泌觀察 取結(jié)腸組織約1 cm（距盲腸4 cm 處），4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，阿利新藍-過碘酸-雪夫染色（periodic acid schiff and alcian bluestaining，AB-PAS），于光鏡下觀察結(jié)腸黏液分泌情況。

1.2.7 ELISA法檢測血清5-HT含量 取大鼠全血，室溫自然凝固10～20 min，隨后離心 20 min左右（2 000～3 000 r/min）；仔細收集上清液，加入顯色劑A、B和終止液，加入配好的標準品和樣本，封膜，輕輕振蕩混勻，37 °C溫育；棄去液體，甩干，加洗滌液，靜置后棄去，拍干；先后加入底物液，需振蕩混勻后避光顯色；加終止液終止反應(yīng)，15 min內(nèi)、450 nm波長依序測量各孔的吸光度（absorbance，A）值。

1.2.8 IHC 法檢測結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R 表達 大鼠結(jié)腸組織切片，烤片、脫蠟、水化后，用檸檬酸緩沖液進行抗原修復(fù)。經(jīng)5% BSA抗原封閉后，用5-HT3R、5-HT4R抗體（1∶100）進行一抗孵育，4 ℃過夜后，進行辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶100）孵育，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染反藍，脫水透明后，封片，在顯微鏡下（CX43，OLYMPUS）進行觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，首先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，檢驗符合正態(tài)分布且方差齊，則2組間比較為非配對t檢驗，多組間的比較應(yīng)采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較，采用SNK-q 檢驗的方法。檢驗水準α=0.05，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 普蘆卡必利對STC模型大鼠的首粒白便排除時間，糞便含水量，以及結(jié)腸含水量的影響

首粒白便排除時間結(jié)果表明，3組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=275.720，Plt;0.05）。模型組大鼠首粒白便排除時間顯著長于對照組的，提示造模成功。與模型組相比，力洛組大鼠首粒白便排出時間顯著減少（Plt;0.05）且隨時間的增加排便時間與模型組間差異越來越大。隨著治療時間加長力洛組排便時間顯著減少，與空白組相比，第50天和60天無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.81、P=0.72）。結(jié)果表示力洛治療之后可以改善大鼠大便排出時間；糞便含水量的結(jié)果顯示，3組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.440，Plt;0.05）。與空白組相比，模型組的含量顯著降低（Plt;0.05），而力洛組含水量逐漸升高，最后接近于空白組；相較于模型組，力洛組糞便含水量顯著升高（Plt;0.05），且隨著時間的推移效果更為明顯。

結(jié)腸含水量結(jié)果顯示，3 組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=263.400，Plt;0.05）。與空白組相比，模型組含水量顯著降低（Plt;0.05），力洛組含水量降低程度遠小于模型組，更接近于空白組；與模型組相比，力洛組的含水量顯著升高（Plt;0.05）。這些結(jié)果表示力洛治療可以改善大鼠的病理狀態(tài)，改善疾病狀態(tài)，見圖1。

2.2 普蘆卡必利對結(jié)腸組織形態(tài)以及結(jié)腸黏液分泌的影響

HE染色結(jié)果可見，空白組大鼠結(jié)腸黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層結(jié)構(gòu)較完整，未見明顯病理改變；模型組大鼠結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，腸絨毛排列紊亂，杯狀細胞明顯減少，見少量炎性細胞浸潤；力洛組大鼠結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯組織病理損傷，提示長期給藥干預(yù)未引發(fā)結(jié)腸組織病理學(xué)改變。

AB-PAS染色結(jié)果可見，結(jié)腸中的中性黏液呈紫紅色，酸性黏液呈藍色。與空白組相比，模型組中的中性黏液明顯較少，因此顏色淺于空白組；與模型組相比，力洛組顏色較深，表明經(jīng)過普蘆卡必利的長期治療不會影響結(jié)腸黏液成分以及水平，見圖2。

2.3 普蘆卡必利對血清5-HT含量的影響

5-HT含量檢測結(jié)果表明，3組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.590，Plt;0.05）。與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸5-HT表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，力洛組的表達水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。而與空白組相比，5-HT表達水平并無明顯變化（P=0.510），見圖3。

2.4 結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R表達變化

5-HT3R、5-HT4R蛋白表達結(jié)果顯示，3組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=105.900，Plt;0.05）。與空白對照組相比，大鼠模型組結(jié)腸組織中5-HT3R表達被明顯抑制（Plt;0.05），力洛組表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.75）。與模型組相比，經(jīng)普蘆卡必利治療后（力洛組），結(jié)腸組織中5-HT3R表達水平顯著升高（Plt;0.05）；同樣，與空白對照組相比，模型組結(jié)腸組織中5-HT4R表達被抑制（Plt;0.05），力洛組無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.17）。與模型組相比，經(jīng)普蘆卡必利治療后（力洛組），結(jié)腸組織中5-HT4R表達顯著顯著升高（Plt;0.05），見圖4。

3討論

目前治療STC的藥物眾多，主要是針對其結(jié)腸動力異常，包括選擇性2型氯通道激活劑—魯比前列酮、鳥苷酸環(huán)化酶激動劑—利那洛肽以及新型促動力劑—普蘆卡必利[11]。其中西沙必利和替加色羅等早期原型雖然有效，但最終因心血管不良事件而被撤回，部分原因是受體非選擇性[12]。普蘆卡必利為二氫苯并呋喃甲酰胺衍生物的代表藥物，是一種高選擇性、高親和力的5-HT4受體激動劑。研究證明其能促進胃、小腸和結(jié)腸平滑肌運動，可增加動物模型結(jié)腸的蠕動反射和集團運動，與非靶器官的相互作用極小[13-14]。但長期服此藥對疾病進展、受體表達水平的影響尚無明確的證據(jù)，本課題通過選用成年雌性SD大鼠，隨機分為正常組、模型組、普蘆卡必利（力洛）組，分組干預(yù)2個月，通過對大鼠一般情況、首次白便排出時間、糞便含水率、5-HT、5-HT3R、5-HT4R的評價分析，以充分評估普蘆卡必利的遠期療效、穩(wěn)定性、受體表達水平的影響，為臨床規(guī)范化應(yīng)用5-HT4受體激動劑普蘆卡必利等同類藥物提供理論支撐。

胃腸道傳輸功能檢測包括首粒大便排出時間、糞便含水量、結(jié)腸含水量等。在本研究中，長期服用普蘆卡必利可以極大改善大鼠排便時間、結(jié)腸含水量、糞便含水量等問題；同樣結(jié)腸病理組織染色以及結(jié)腸黏液染色結(jié)果表明，長期服用普蘆卡必利不會引起結(jié)腸組織病理學(xué)以及結(jié)腸黏液成分、水平的改變。這些結(jié)果表明，長期服用普蘆卡必利可以改善大鼠的病理狀態(tài)。

為了探討長期服用普蘆卡必利對5-HT受體表達的影響，本實驗進行了進一步對腸道動力活動密切相關(guān)的5-HT 及5-HT3R/5-HT4R 的變化進行了研究。5-HT是5-HT信號通路的核心，它既是神經(jīng)遞質(zhì)，又是胃腸激素，絕大部分5-HT都存在于胃腸道內(nèi)，其主要功能包括促進胃腸道的運動、血管舒張及胰液的分泌等[14]。其中普蘆卡必利通過與胃腸道中存在的5-HT4受體相互作用來刺激腸道蠕動，導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元釋放乙酰膽堿，乙酰膽堿反過來刺激結(jié)腸縱向肌肉層的收縮和環(huán)形肌肉層的松弛，從而導(dǎo)致管腔內(nèi)容物的推進[15-16]。本研究中，STC模型大鼠5-HT、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達水平均下降，這與以往的研究一致[17-18]，而長期服用普蘆卡后，5-HT、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達水平升高，且水平接近于空白組。

綜合而言，本研究結(jié)果表明，隨著普蘆卡必利用藥時間的延長，不僅能夠改善大鼠的排便時間、糞便含水量、結(jié)腸含水量，腸道組織病理狀態(tài)以及腸道結(jié)腸黏液分泌情況，而且能夠提高5-HT受體表達水平。這為普蘆卡必利等5-HT4受體激動劑的長期治療效果提供了理論支持。