【摘 要】目的：通過CRISPR Screen正向基因篩選技術，篩選出他莫昔芬耐藥靶點基因免疫球蛋白結合蛋白1（immunoglobulinbinding protein 1，IGBP1）。驗證IGBP1在臨床乳腺癌患者腫瘤組織中是否高表達，并探討IGBP1對雌激素受體陽性（ER+）乳腺癌細胞增殖、細胞周期和耐藥性等表型的影響，為診斷和治療提供潛在靶點。方法：應用公共數(shù)據(jù)庫分析IGBP1在乳腺癌患者腫瘤組織及配對癌旁組織中的表達是否有所不同。Kaplan-Meier Plotter用于預測IGBP1對乳腺癌患者總體生存率（the overallsurvival，OS）是否有所影響。應用慢病毒感染ER+乳腺癌細胞，再進行功能實驗驗證IGBP1過表達及敲低對ER+乳腺癌細胞增殖、細胞周期和耐藥性的影響。最后用公共數(shù)據(jù)庫鑒定出可能與IGBP1正、負相關的基因。結果：公共數(shù)據(jù)庫的結果表明，IGBP1在乳腺癌組織中高表達。生存分析表明，IGBP1高表達的患者的OS較差。細胞功能實驗顯示，過表達IGBP1的細胞增殖、細胞周期明顯快于對照組細胞，耐藥性增強；而敲低IGBP1的結果相反。與IGBP1正相關的基因里有已知的癌基因如NOP53。結論：IGBP1在ER+乳腺癌中高表達，IGBP1的過表達和敲低均影響ER+乳腺癌細胞系的增殖、細胞周期和耐藥性，提示IGBP1在ER+乳腺癌中可能能夠改善其耐藥，表明IGBP1可能作為ER+乳腺癌的潛在治療靶點之一。

【關鍵詞】免疫球蛋白結合蛋白1；乳腺癌；雌激素受體陽性；他莫昔芬耐藥

【中圖分類號】R737.9 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-08-31

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)對中國女性的調查，乳腺癌在女性癌癥新增病例中排名第二[1]。根據(jù)2023圣加侖共識，在臨床治療中將癌癥主要分為4種分子亞型，即Luminal A型、LuminalB型、HER-2過表達型和TNBC型[2]。不同亞型的癌癥在危險因素、發(fā)病率、治療敏感性和預后方面存在顯著差異[3，8]。其中，Luminal A型和Luminal B型乳腺癌可以從內分泌治療中受益更多，因為它們的雌激素受體是陽性的[9]，HER-2 過表達型對靶向治療更敏感[10-11]，而TNBC 型缺乏明確的靶點[12-13]。目前，內分泌治療是ER+乳腺癌的主要藥物治療方法。

臨床實踐中常見的內分泌治療藥物包括激素受體拮抗劑、激素受體降解劑和芳香化酶抑制劑[14]。激素受體拮抗劑如他莫昔芬在ER+乳腺癌患者內分泌治療中的應用大大改善了患者的預后。然而，約40% 接受他莫昔芬治療的患者會產(chǎn)生獲得性耐藥[15-16]。獲得性耐藥的出現(xiàn)對臨床患者的預后構成了巨大威脅。他莫昔芬耐藥性仍然是ER+乳腺癌的臨床挑戰(zhàn)。近年來，ER的變化被認為是他莫昔芬耐藥性的重要機制[14]，但是調節(jié)ER途徑的確切機制尚未完全明確。

免疫球蛋白結合蛋白1（immunoglobulin bindingprotein 1，IGBP1）參與抗原與特定B細胞受體的結合，主要是通過特異性結合蛋白磷酸酶2A（proteinphosphatase 2A，PP2A），并調節(jié)PP2A 的催化活性[17]。據(jù)文獻報道，IGBP1通過PP2A途徑激活細胞周期并抑制細胞凋亡[18]。IGBP1的高表達與食管鱗狀細胞癌[19]和肺腺癌等疾病的預后不良有關[20-22]。來源于該基因的LncRNA IGBP1-AS1 的過表達在體內外對乳腺癌細胞的侵襲和增殖具有抑制作用[23]。這表明IGBP1在癌細胞中可能起癌癥啟動子的作用。通過這項研究，本課題組表明靶向IGBP1可以改善ER+乳腺癌的耐藥性，表明IGBP1可能是ER+乳腺癌的潛在治療靶點之一。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人ER+乳腺癌細胞（MCF-7和T47D）和三陰性乳腺癌細胞（BT-549和MDA-MB-231）在培養(yǎng)箱中以5% CO2和37 ℃維持在補充有丙酮酸鹽的高葡萄糖DMEM（Gibco，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）、10% 胎牛血清（FBS）（ExCell Bio）和1% 青霉素/鏈霉素（Thermo Fisher Scientific，Walterham，MA，US）中。

1.2 RNA分離、逆轉錄反應和定量實時PCR

使用總RNA 提取試劑盒（Tiangen，Beijing，China）從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，然后用4×RT混合物（MedChemEx?press，Shanghai，China）進行逆轉錄。定量RT-PCR在10 μLPCR 混合物中使用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（MedChemEx?press）在Bio-Rad CFX96 實時PCR 系統(tǒng)（Bio-Rad Laborato?ries，Inc，Hercules，CA，USA）上進行。熱循環(huán)條件包括在95 ℃下進行2 min的初始循環(huán)，然后在95 ℃、58 ℃和72 ℃下分別進行39個循環(huán)30 s、30 s和20 s。每組進行3次獨立的實驗。將相對基因表達以GAPDH標化，并使用2?ΔΔCt方法進行評估。

1.3 蛋白質印跡分析

使用了以下抗體：抗IGBP1（IGBP1 多克隆抗體）（Pro?teintech，14952-1-AP）、抗GAPDH（Proteinteech，60004-1-Ig）、抗CCND1（Proteintetech，60186-1-Ig），抗P21（Protein?tench，10355-1-AP）和抗ER（Proteinteght，21244-1-AP）。用預冷PBS（4 ℃）洗滌2次后，在冰上獲取細胞。使用含有蛋白酶抑制劑（Beyotime，Shanghai，China）和磷酸酶抑制劑（Beyotime，Shanghai，China）的RIPA 裂解緩沖液（Beyotime，Shanghai，China）制備蛋白質裂解液，并使用BCA檢測試劑盒（Beyotome，Shanghai，China）測定蛋白質濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS–PAGE）（Bio-Rad Laboratories，Inc.）分離每組提取的蛋白質（20 μg/10 μL/泳道）。在室溫下用快速阻斷緩沖液（New Cell amp; MolecularBiotech，Suzhou，China）阻斷10 min 后，將膜與特異性一抗（稀釋度1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜。隨后，用含吐溫-20的Tris緩沖鹽水（TBST）洗滌3次后，在室溫下將膜用二抗（稀釋率1∶1 000）處理60 min。使用增強的化學發(fā)光底物（Bio-Rad Laboratories，Inc.）通過化學發(fā)光觀察蛋白質條帶，并使用化學成像系統(tǒng)檢測免疫反應條帶。GAPDH被用作對照。

1.4 慢病毒感染過表達和雜合敲除質粒及shRNA的構建

IGBP1的正向引物為5′-GGACGAAGTAGAGTGGC-3′，反向引物為5′-AGGTCGGTGGAAGCA-3′。根據(jù)制造商的指南，按照標準方案，使用Lipofectamine 3000（Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA）進行質粒DNA轉染。由于是雜合敲除，其與敲減組在后面的功能表型和蛋白質水平驗證中顯示出相似的結果。

1.5 患者和樣本

從重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院接受治療的乳腺癌患者身上獲得配對的乳腺臨床人體標本，包括癌組織和癌旁組織。這些患者通過病理活檢被診斷為浸潤性乳腺癌，并在同一醫(yī)院接受了手術。根據(jù)重慶醫(yī)科大學臨床診斷病理中心進行的免疫組織化學結果，確定患者的ER 和孕激素受體（PR）狀態(tài)。研究方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學倫理委員會審查和批準，所有參與的患者均提供了參與研究的知情同意書。

1.6 IHC分析

收集的人體組織最初使用4%甲醛緩沖液固定。隨后，將包埋的組織切成4 μm厚的切片。然后將這些組織切片在60 ℃下熱孵育2 h 以促進脫蠟，然后在115 ℃下高壓滅菌3 min 并在檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中修復抗原。使用0.3%的H2O2溶液淬滅內源性過氧化物酶活性15 min。接下來，用正常山羊血清阻斷溶液處理切片，使其非特異性結合45 min，然后在4 ℃下以1∶100的稀釋度與特異性一抗一起孵育過夜。隨后，將切片在室溫下暴露于山羊抗兔二抗30 min。使用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺可視化蛋白質表達，并用Leica顯微鏡（Leica，Germany）捕獲圖像。

1.7 細胞增殖和藥物敏感性試驗

將細胞鋪在96孔板上進行增殖試驗，每孔約有3 000個細胞懸浮在100 μL中。使用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）試劑（Beyotime，Shanghai，China）評估細胞存活率。在2 h的孵育期后，在450 nm處測量細胞的吸光度。在藥物敏感性實驗中，每孔放置5 000個細胞并孵育24 h。隨后，用不同濃度（0、4、8、12、16、20 μmol/L）的4-羥基他莫昔芬（4-OHT）處理細胞72 h。使用與上述相同的方法測定細胞存活率。

1.8 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷染色

根據(jù)制造商的方案，使用BeyoClickTM EdU 細胞增殖試劑盒（C0075S，Beyotime，Shanghai，China）評估癌癥乳腺細胞的增殖。最初，將2×105 個細胞鋪在12 孔板上，孵育24 h。隨后，將細胞在37 ℃下用EdU工作溶液（10 μmol/L）在黑暗中孵育2 h。之后，用PBS洗滌細胞3次，然后用4%多聚甲醛固定15 min。固定后，用0.1%的Triton X-100使細胞通透15 min，并用PBS洗滌3次。接下來，用DAPI（C0075S，Beyo?time，Shanghai，China）染色5 min。使用熒光顯微鏡（Leica，Germany）捕獲圖像，其中在孵育時進行DNA復制的細胞顯示紅色熒光，而所有細胞核顯示藍色熒光（DAPI），將所得的兩張圖進行疊合顯示紅色熒光所占的比例，即增殖細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例（Merge）。

1.9 細胞周期測定和流式細胞術分析

吸取培養(yǎng)上清液后，用不含鈣和鎂離子的PBS洗滌細胞1次。2～5 min后停止胰酶消化。然后將樣品轉移到離心管中，以1 000 r/min的速度離心5 min。該過程重復1～2次，包括洗滌和離心步驟。用洗滌液將細胞濃度調節(jié)至1×106/mL。隨后，將樣品轉移到BD FACS Verse 流式細胞儀中進行檢測。使用FlowJo軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析。

1.10 集落形成試驗

將ER+乳腺癌細胞（MCF-7 和T47D）接種到6 孔板中。孵育2周后，用4%多聚甲醛固定細胞15 min。隨后，在室溫下用結晶紫染色20 min后觀察。

1.11 生物信息學數(shù)據(jù)分析

選擇TCGA數(shù)據(jù)庫中的ESR1及其下游，以探討它們在乳腺癌中與IGBP1的正負相關。對于基因集功能富集分析，本研究使用KEGG rest API 獲得最新的KEGG 通路基因注釋，作為背景將基因映射到背景集。CPTAC數(shù)據(jù)庫包含基因組測序數(shù)據(jù)和蛋白質組數(shù)據(jù)。本研究使用CPTAC 分析IGBP1在腫瘤和鄰近組織中的豐度差異，并將P 值臨界值設置為0.05。Kaplan-Meier Plotter 是一個常用的生存分析網(wǎng)站。進入網(wǎng)站癌癥板塊，檢索IGBP1并設置參數(shù)，將其分為高表達組和低表達組，檢查其表達水平對患者OS的影響，以P 值和HR表示。

1.12 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)結果均表示為均數(shù)±標準差（x±s），并使用GraphPad Prism 9（San Diego，CA，USA）進行統(tǒng)計分析和制圖。使用單因素方差分析進行多組比較，2組之間的比較使用Student’s t 檢驗進行。所有實驗均獨立重復3次。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 IGBP1在癌癥中的表達明顯上調，其高表達提示患者預后較差

免費網(wǎng)站CPTAC整理了不同腫瘤樣本中每個可檢索基因編碼蛋白的表達值，可以計算出IGBP1在乳腺癌及其相應正常組織中的表達水平。如圖1A所示，可以看出IGBP1在乳腺癌中的表達高于正常組織。通過免費網(wǎng)站上的Kaplan-Meier Plotter生存分析，發(fā)現(xiàn)IGBP1的高表達表明患者的預后較差（圖1B，Plt;0.05）。接下來，使用CPTAC 數(shù)據(jù)庫分析IGBP1 在癌癥四種亞型中的表達：Luminal A 型、Luminal B型、HER-2過表達型和TNBC型。結果顯示，其在前兩種類型的乳腺癌中的表達顯著高于正常組織和TNBC型（圖1C）。在上述不同亞型的乳腺癌細胞系中，對所選蛋白質表達水平的驗證也表明，IGBP1在ER+乳腺癌細胞中表達增加，但在雌激素受體陰性（ER-）乳腺癌細胞中表達減少（圖1D，E，Plt;0.001）。上述結果表明，IGBP1的表達隨ER狀態(tài)的不同而不同，在ER+乳腺癌中IGBP1表達增加，而編碼ER-α蛋白的基因為ESR1，表明IGBP1 與ESR1 的表達呈正相關，提示IGBP1可能影響ER+乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。同時，IHC染色結果的比較也證實了CPTAC中獲得的結果。IGBP1在乳腺癌組織中的表達明顯高于配對癌旁組織。圖1F顯示了選定的典型IHC染色圖像。

2.2 IGBP1的過表達促進ER+乳腺癌細胞的增殖

為了分析IGBP1在ER+乳腺癌中的作用，本研究通過包裝慢病毒構建了IGBP1過表達和雜合敲除質粒，并感染了兩種ER+乳腺癌細胞系細胞（MCF-7 和T47D）。本研究使用WB 驗證了IGBP1 的過表達和雜合敲除效率（圖2A，Plt;0.05）。通過分析PRISM基因依賴性CRISPR Screen數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)IGBP1可能促進細胞增殖（圖2B）。接下來，使用CCK-8 方法檢測體外細胞增殖能力，結果如圖2C 和D 所示。IGBP1過表達后，ER+乳腺癌細胞的增殖能力顯著提高（圖2C），而IGBP1的敲低明顯降低了ER+乳腺癌細胞的增殖能力（圖2D）。通過EdU實驗檢測IGBP1對ER+乳腺癌細胞增殖的影響。結果顯示，當IGBP1被雜合敲除時，細胞增殖明顯減慢（圖2E）。流式細胞術檢測過表達和敲低IGBP1的細胞表明，IGBP1過表達加速了細胞周期，而敲除IGBP1導致細胞周期積聚在S期（圖2F），表明DNA復制過程受阻。結果表明，IGBP1的過表達可影響體外培養(yǎng)的ER+乳腺癌細胞的增殖和細胞周期。

2.3 敲低IGBP1增加ER+乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性

他莫昔芬的CRISPR篩選表明，IGBP1可能介導他莫昔芬耐藥性（圖3A）。對GEO數(shù)據(jù)集的進一步分析顯示，他莫昔芬耐藥后IGBP1表達上調。他莫昔芬耐藥MCF-7（MCF-7-TAMR）細胞中IGBP1的表達明顯高于親本細胞（圖3B）。蛋白質印跡分析顯示，MCF-7-TAMR細胞中IGBP1的表達上調（圖3C）。然后本課題組檢查了IGBP1在他莫昔芬敏感性中的作用。本研究制備了過表達和敲低IGBP1的MCF-7和T47D細胞，并用不同劑量的4-OHT對其處理72 h后進行CCK-8檢測，以檢測細胞存活率并顯示對4-OHT的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，在用4-OHT 處理的MCF-7 細胞中，過表達IGBP1 增加了細胞對4-OHT 的耐藥性及半數(shù)抑制濃度（IC50）（圖3D）。相反，降低T47D細胞中IGBP1的表達降低了它們對4-OHT的耐藥性及IC50（圖3E）。集落形成試驗還表明，當細胞用2 μmol/L 4-OHT處理時，IGBP1過表達的MCF-7細胞的存活率更高（圖3F）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，證明低IGBP1表達會增加ER+乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性。

2.4 IGBP1相關基因的生物學功能分析

自從IGBP1在癌癥中的功能得到證實以來，本課題組在不同的數(shù)據(jù)庫中研究了與癌癥相關的途徑和分子功能。首先，本課題組在TCGA數(shù)據(jù)庫中探索了與IGBP1呈正相關和負相關的基因（圖4A）。對于基因集功能富集分析，使用KEGG rest API獲得最新的KEGG通路基因注釋，作為背景將基因映射到背景集。最小基因集大小設置為5，最大基因集大小設為5 000。P 值小于0.01且FDR小于0.25被認為具有統(tǒng)計學意義。在陽性富集的GO圖中，與氧化磷酸化、早期雌激素反應和脂肪酸代謝相關的基因以及與凋亡、p53信號通路和DNA修復相關的基因顯著富集（圖4B）。在陰性富集中，與G2/M 檢查點、有絲分裂紡錘體、干擾素α/γ 和MTORC1信號通路相關的基因富集，表明與IGBP1呈負相關（圖4B）。同時，基因集功能富集分析顯示ER相關途徑顯著正富集（圖4C）

本研究在TCGA 數(shù)據(jù)庫中選擇了ESR1 及其下游CCND1，發(fā)現(xiàn)它們與IGBP1呈正相關（圖4D）。為了驗證上述結論，在蛋白質水平驗證了IGBP1過表達和雜合敲除對ER和細胞周期相關分子的影響，這與上述公共數(shù)據(jù)庫中獲得的結果一致。IGBP1過表達后，ER和CCND1的表達上調，而p21 的表達下調（圖4E）。在IGBP1 雜合敲除后，ER 和CCND1的表達下調，而p21的表達上調（圖4F）。這些結果表明，IGBP1通過ER信號通路介導其促癌作用。

3 討 論

乳腺癌仍然是全世界女性發(fā)病率和死亡率較高的疾病之一，這突出表明迫切需要深入了解其發(fā)展和新的治療方法。癌癥的進展，甚至因他莫昔芬耐藥性而死亡，已成為威脅ER+乳腺癌患者生存率的主要問題[24]。在他莫昔芬治療期間導致他莫昔芬耐藥性的確切機制尚不清楚。近年來，大量證據(jù)表明，ER的改變被認為是他莫昔芬耐藥性的重要機制[14]。

本研究首次檢測了IGBP1 在癌癥中的表達水平及其在內分泌治療中的作用。IGBP1參與抗原與特定B 細胞受體的結合，主要是通過特異性結合PP2A 并參與調節(jié)PP2A 的催化活性[17]。文獻報道IGBP1通過PP2A途徑激活細胞周期并抑制凋亡[18]。先前的研究表明，IGBP1的高表達與各種疾病的預后不良有關，包括食管鱗狀細胞癌[19]、肺腺癌[20-22]、狼瘡腎炎[25]和胼胝體發(fā)育不全等[26-29]。LncRNAIGBP1-AS1 可通過下調IGBP1 降低乳腺癌的增殖和侵襲能力[23]，提示IGBP1可促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)IGBP1在乳腺癌組織和細胞中的蛋白表達升高，其過表達促進了ER+乳腺癌細胞的增殖。

此外，本研究還探討了IGBP1對最常見的內分泌療法他莫昔芬耐藥性的影響。本課題組觀察到，在ER+乳腺癌中，IGBP1的過表達顯著增加了他莫昔芬的耐藥性，而IGBP1敲低顯著降低了ER+乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性。這表明IGBP1可能是干預ER+乳腺癌他莫昔芬耐藥性的潛在靶點。在敲低或雜合敲除IGBP1后，ER+乳腺癌對他莫昔芬的耐藥性可能有一定的改善，這表明IGBP1可能是ER+乳腺癌的潛在治療靶點。本研究還發(fā)現(xiàn)IGBP1表達與ER表達相關，IGBP1的表達與ESR1表達呈正相關。這將是未來調查的重點。例如，對AI的耐藥性通常源于ESR1基因突變。本課題組將進一步深入探索相關通路分子。

總之，來自公共數(shù)據(jù)庫、臨床乳腺癌患者的腫瘤標本和體外細胞學實驗的數(shù)據(jù)表明，IGBP1在乳腺癌中高度表達，且在ER+ 乳腺癌中表達更高。IGBP1的過表達和敲低影響ER+乳腺癌細胞系的增殖、細胞周期和他莫昔芬耐藥性，表明IGBP1可能改善ER+乳腺癌治療中的耐藥性問題。這意味著IGBP1 可能作為ER+乳腺癌的潛在治療靶點。此外，本課題組發(fā)現(xiàn)IGBP1可能通過ER信號通路介導上述致癌作用。未來，IGBP1在ER信號通路上的具體激活機制可能會被探索。

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（責任編輯：周一青）