【摘 要】 目的：探究苗藥聯(lián)合撳針對原發(fā)性失眠模型大鼠血清IL-1、TNF-α含量的影響。方法：采用對氯苯丙氨酸誘導構(gòu)建原發(fā)性失眠大鼠模型，分為空白組、模型組、苗藥組、撳針組、苗藥聯(lián)合撳針組。通過干預治療后，觀察大鼠一般狀態(tài)、記錄治療前后大鼠體重差值，通過Elisa法檢測血清IL-1、TNF-α水平。結(jié)果：與空白組相比，PI模型大鼠一般狀態(tài)較差，體重增加較少（Plt;0.01），血清IL-1、TNF-α水平明顯增高（Plt;0.01）；與模型組相比，苗藥組、撳針組體重增加較多（Plt;0.05，Plt;0.05），血清IL-1、TNF-α水平下降（Plt;0.05），苗藥聯(lián)合撳針組體重增長趨勢更好（Plt;0.05），血清IL-1、TNF-α水平明顯下降（Plt;0.01），接近于空白組水平。結(jié)論：苗藥驗方內(nèi)服、撳針埋穴、苗藥驗方內(nèi)服聯(lián)合撳針埋穴均能改善睡眠癥狀，且二者聯(lián)合治療效果呈現(xiàn)更好的趨勢。通過影響原發(fā)性失眠模型大鼠血清IL-1、TNF-α的水平可能是對失眠發(fā)揮治療作用的機制之一。

【關(guān)鍵詞】 苗藥；撳針；原發(fā)性失眠；IL-1；TNF-α

【中圖分類號】R29"" 【文獻標志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2024）15-0029-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.15.zgmzmjyyzz202414008

Effect of Combined Press-needle of Miao Medicine on Serum IL-1 and TNF-α Levels

in Rats with Primary Insomnia Model

Abstract：Objective To explore the effects of Miao combined with snappers on serum IL-1 and TNF-α levels in rats with primary insomnia model. Methods A rat model of primary insomnia was constructed using p-chlorophenylalanine induction. The rats were divided into blank group，model group，Miao medicine group，press-needle group and Miao medicine combined press-needle group. After the intervention，the general state of the rats was observed，the difference in body weight before and after the treatment was recorded，and the serum IL-1 and TNF-α levels were detected by Elisa method. ResultsCompared with the blank group，PI model rats had poorer general status，less weight gain （Plt;0.01），and significantly higher serum IL-1 and TNF-α levels （Plt;0.01）; compared with the model group，the Miao medicine group and the press-needle group had more weight gain（Plt;0.05，Plt;0.05），and decreased serum IL-1 and TNF-α levels（Plt;0.05），and the Miao medicine combined with the press-needle group showed a better trend of weight gain（Plt;0.05），and serum IL-1 and TNF-α levels decreased significantly （Plt;0.01），close to the level of the blank group. Conclusion Internal administration of Miao medicinal formula，press-needle burying points，and internal administration of Miao medicinal formula combined with press-needle burying points could improve sleep symptoms，and the combined treatment effect of the two showed a better trend. By affecting the levels of serum IL-1 and TNF-α in rats with primary insomnia model，it may be one of the mechanisms to exert therapeutic effects on insomnia.

Key words：Miao Medicine; Press-needle; Primary Insomnia; IL-1; TNF-α

原發(fā)性失眠（primary insomnia，PI）即患者睡眠條件良好且無軀體因素影響的情況下，每周有3個夜晚以上（連續(xù)1個月以上）難以入睡，夜間易醒，醒后難以再次入睡的一類臨床病癥［1］。據(jù)流行病學顯示，PI的發(fā)病率隨著年齡增長而逐漸增加，其中中青年群體的發(fā)病率為10%～20%，老年患者則達35%～50%［2］，嚴重的失眠會誘發(fā)抑郁癥、頭痛及心臟病等［1］，大大降低患者生活質(zhì)量和增加患者心理負擔。目前，臨床治療的主要藥物為苯二氮

類受體激動劑、褪黑素受體激動劑以及具有催眠效果的抗抑郁藥物，長期使用可能會導致不良反應和對藥物的高度依賴［3］。因此，尋找安全、有效、綠色、方便以及能改善原發(fā)性失眠的方法已成為臨床迫切需要。針刺是中醫(yī)治療失眠的有效手段之一，不良反應小，簡便驗廉，而撳針作為針刺中一項特色療法，以在皮膚內(nèi)久留針持續(xù)刺激穴位，繼而調(diào)理臟腑氣血來治療失眠，較常規(guī)針刺相比，患者接受度高。近年來，民族醫(yī)藥憑借其治療疾病的獨特優(yōu)勢也逐漸成為了一大熱點［4］，苗藥屬于貴州特有的民族醫(yī)藥，資源豐富，藥用價值比較高，苗藥失眠方的發(fā)展是靠苗醫(yī)們的長期臨床實踐總結(jié)得出的臨床經(jīng)驗方，但現(xiàn)對苗醫(yī)藥失眠方的實驗研究較少，缺乏科學的依據(jù)便難以推廣應用?，F(xiàn)失眠的發(fā)病時間通常較長，且患者心理負擔重，撳針基于患者易于接受的特點，聯(lián)合苗醫(yī)長期臨床經(jīng)驗總結(jié)的經(jīng)驗方，內(nèi)外兼治，以期大大提高臨床療效和減輕患者心理負擔。因此苗藥失眠方聯(lián)合撳針對PI模型大鼠血清IL-1、TNF-α含量的影響，既能為民族醫(yī)藥治療原發(fā)性失眠提供新思路和新治法，同時也能為該療法的臨床運用提供實驗基礎。目前的研究表明，PI的發(fā)病離不開神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）網(wǎng)絡，免疫系統(tǒng)內(nèi)免疫細胞產(chǎn)生的各種細胞因子及與激素相似的物質(zhì)可作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，進而調(diào)控睡眠狀態(tài)［5］。參與該調(diào)節(jié)的細胞因子包括TNF-α和IL-1，它們與睡眠調(diào)節(jié)密切相關(guān)，是研究睡眠機制的最重要途徑之一［6］。基于此，本課題以PI模型作為研究對象，采用貴州地區(qū)獨特的苗醫(yī)藥資源和中醫(yī)特有的皮內(nèi)針埋穴療法為刺激方法，探索苗藥聯(lián)合撳針對PI模型大鼠的療效及可能的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 選用30只健康SPF級SD雄性大鼠，180～220 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001，育齡6周。在整個實驗過程中，大鼠得以自由地獲取其所需的食物和水源。室溫20～25 ℃，濕度40%～60%，為期1周，以便適應環(huán)境。

1.2 試劑與藥物 對氯苯丙氨酸（PCPA，阿拉丁，批號：c136727） ，大鼠白細胞介素-1ELISA試劑盒（IL-1，批號：JL18365-48T，上海江萊生物科技有限公司），大鼠腫瘤壞死因子αELISA試劑盒（TNF-α，批號：JL13202-48T，上海江萊生物科技有限公司），一次性無菌撳針（0.25 mm×0.13 mm，批號：20010020號，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.3 主要儀器 TG16W微量高速離心機，AE1204電子分析天平， 瑞士PRECISAXB220A型電子分析，移液器（Finnpipette，20-200 μL），RT-6100酶標儀（Rayto），電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組 與給藥將30只大鼠按隨機數(shù)表法分為空白對照組（6只）、失眠模型組（24只）。模型組建模方法來源于國際上普遍采用的化學因素引起失眠模型的實施方法［7-8］，即“對氯苯丙氨酸（PCPA）腹腔注射法”，失眠模型組剩余大鼠在失眠模型復制成功后，隨機分成模型組（6只），苗藥組（6只），撳針組（6只）和苗藥聯(lián)合撳針組（6只）。

2.2 模型制備制作 PCPA混懸液：取Na2CO3 3.392 g，用電子秤精確稱量，加入320 mL水；另稱取NaHCO31.512 g，加入180 mL水；將二者相混合形成碳酸鹽緩沖液（pH 10.1）備用。對氯苯丙氨酸（PCPA，阿拉?。创笫?50 mg·kg-1（10 mL·kg-1）的劑量，加入碳酸鹽緩沖液，制成混懸液以備使用，混懸浮液在使用前需要超聲處理15 min，將失眠模型組的24只大鼠用配制好的PCPA溶液，于每日8∶00～8∶30以1 mL/100 g的劑量腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射2 d［7-8］。

2.3 模型評價 在注射PCPA28 h以后，觀察大鼠出現(xiàn)的所有體表特征，并根據(jù)積分表評分，最后根據(jù)總積分，失眠造模組與空白組積分存在顯著差異（Plt;0.01），提示造模成功。

大鼠體表特征積分標準［9］：①精神狀態(tài)，活動程度，攻擊性行為；②晝夜活動節(jié)律消失；③體表皮毛無光澤；④皮毛掉落情況；⑤食欲，體重和消瘦程度。根據(jù)上述的5個狀態(tài)進行評分，狀態(tài)差的為高分，狀態(tài)好的為低分，最高分為5分，最低分為1分，共計25分。

2.4 苗藥制備與選穴苗藥驗方制備 參考《苗藥方劑學》組方［10］：嘎佬豆金（山枝茶）20 g，珍訪象（山楂）30 g，靈芝20 g，萵樸翁（夜交藤）20 g；藥液的配置：將上述鮮藥分別浸泡45 min后熬藥取液，第1次大火煮沸后以小火續(xù)煎15 min取液，第2次大火煮沸后以小火續(xù)煎30 min取液，將2次藥液用多層紗布過濾后放入水浴鍋75 ℃濃縮至含生藥0.469 g/mL的湯藥，滅菌包裝后放入4 ℃冰箱冷藏，備用。

選穴參考余曙光《實驗針灸學》選用雙側(cè)神門（前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣）、雙側(cè)三陰交（后肢內(nèi)踝尖直上10 mm）、百會穴（頂骨正中）［11］。

干預方法為①空白組：常規(guī)飼養(yǎng)，除采取抓握刺激10 min外，不做其他處理。②模型組：參照上述模型制備，同空白組相等時間（10 min）和相等強度抓握刺激，之后給予與苗藥等體積等濃度生理鹽水，連續(xù)灌胃6 d。③苗藥組：按照前述方法原劑量經(jīng)煎煮，過濾，濃縮至所需量，給予苗藥灌胃1 mL/100 g，每日灌胃1次，療程共6 d。④撳針組：參考余曙光《實驗針灸學》選用雙側(cè)神門、百會穴、雙側(cè)三陰交［11］。定穴后用剃毛刀剔除其穴及周圍毛，作好記號并消毒皮膚，然后再垂直將針撳于穴內(nèi)，為兼顧大鼠與人之間耐受程度的差異，以及為避免大鼠由于長期固定導致激惹和死亡，故每只大鼠維持120 min的留針時間，確保刺激量充足［12］。因大鼠喜抓頭撓耳和梳理毛發(fā)，而且動作頻繁，活動度較大，易造成撳針脫落，故采用彈性繃帶將針固定，并在留針過程中嚴密觀察是否有針脫落，時刻注意和進行加固，每30 min對針刺部位進行2 min的輕壓刺激。每日1次，每次120 min，每連續(xù)干預3日后休息1日，治療療程共6 d。⑤苗藥聯(lián)合撳針組：操作方法為③與④相結(jié)合，即予苗藥量為1 mL/100 g每日灌胃1次，連續(xù)6 d，在此基礎上聯(lián)用撳針每日1次，每次120 min，連續(xù)干預3日后休息1日，治療療程共6 d。

2.5 檢測指標及方法 一般情況：觀察大鼠實驗前后精神、活動、晝夜節(jié)律、皮毛色澤、飲食、體重變化、排泄等狀態(tài)。 樣本采集與檢測：治療周期結(jié)束后24 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉，從腹主動脈抽取4 mL血液，靜置20 min，離心提取血清（3000 r/min離心10 min）。分離出的血清先在液氮中冷凍，然后儲存在-80 ℃的冰箱中備用。嚴格按照試劑盒的要求，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中的IL-1和TNF-α含量。

2.6 統(tǒng)計學方法 研究選擇的統(tǒng)計軟件是SPSS 22.0，所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示。當方差相等時，采用單程方差分析（LSD），當方差不相等時，采用單程方差分析（Tamhane）。Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 造模前后PCPA模型大鼠的體表特征積分變化及體重差值比較 由表1可知，注射PCPA后28 h的大鼠，精神狀態(tài)差，有明顯的攻擊性行為，且晝夜活動無節(jié)律，整體消瘦和皮毛粗糙枯黃無光澤；與空白組相比，造模組體重均明顯下降，呈顯著差異（Plt;0.01）；造模組間大鼠對比體重變化差值無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。提示造模成功。

3.2 干預后大鼠一般狀態(tài)比較 干預后，空白組大鼠精神充足，毛色光滑，抓取時動作敏捷，無明顯攻擊行為，大小便正常。模型組狀態(tài)無明顯改善，精神狀態(tài)差，皮毛粗糙枯黃無光澤，有較明顯攻擊性行為，余三組大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動、晝夜節(jié)律均優(yōu)于模型組，明顯得到改善。

3.3 治療前后各組大鼠體重差值比較 由表2可知，治療后，各組大鼠體重均較前增加。與空白組比較，模型組體重增長較少，呈顯著差異（Plt;0.01）；與模型組相比苗藥組、撳針組及苗藥聯(lián)合撳針組大鼠體重增長較多，具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），其中苗藥聯(lián)合撳針組體重增長趨勢更好。

3.4 治療后各組大鼠血清中IL-1、TNF-α含量水平的比較 由表3可知，撳針組、苗藥組及苗藥聯(lián)合撳針組對失眠均有療效；與空白組相比，模型組大鼠血清IL-1、TNF-α水平明顯增高，呈顯著差異（Plt;0.01）；與模型組相比，苗藥組、撳針組血清IL-1、TNF-α水平下降，存在統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），苗藥聯(lián)合撳針組血清IL-1、TNF-α含量顯著減少，呈顯著差異（Plt;0.01），接近于空白組水平；苗藥聯(lián)合撳針組雖與苗藥組、撳針組相比，均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05，Pgt;0.05），但血清IL-1、TNF-α含量呈下降趨勢。

3 討論

原發(fā)性失眠患者主要表現(xiàn)為入睡困難、睡眠難以維持、易醒等臨床癥狀［12］，長期失眠會增加抑郁癥、精神疾病、認知或記憶相關(guān)神經(jīng)性疾病患病風險［13］，因此該疾病導致的嚴重后果值得重視。目前臨床以藥物治療為主，雖然能在一定程度上改善患者癥狀，但也會導致藥物成癮等一系列不良反應［13］，給患者、家庭和社會帶來不良影響。而撳針埋穴法作為中醫(yī)特色外治法之一，是淺刺與久留針的結(jié)合［14］，具有副作用小、經(jīng)濟、便利等優(yōu)勢，有研究［9］表明，撳針淺刺皮內(nèi)和皮下，能對人體產(chǎn)生穩(wěn)定且持續(xù)的刺激，既可調(diào)節(jié)經(jīng)絡氣血又能調(diào)和營衛(wèi)以助眠。實驗基于中醫(yī)基礎理論，以調(diào)節(jié)經(jīng)絡氣血、調(diào)和營衛(wèi)為原則［9］，選取經(jīng)驗效穴心經(jīng)原穴神門、脾經(jīng)三陰交、督脈百會穴［15］，以期提高失眠患者睡眠質(zhì)量，減輕患者經(jīng)濟壓力和心理負擔。苗藥是貴州特有的民族醫(yī)藥，本苗藥失眠方是苗醫(yī)們的長期臨床實踐總結(jié)得出，并記錄于苗藥方劑學的臨床經(jīng)驗方。方中采用嘎佬豆金（山梔茶）、珍訪象（山楂）、靈芝、萵樸翁（夜交藤），有動物研究［16］顯示，山梔茶具有鎮(zhèn)靜、降壓、抗抑郁等藥理作用。四藥相伍，能起到鎮(zhèn)靜安神，調(diào)理臟腑的作用［7］。苗藥聯(lián)合撳針對失眠進行治療，既是民族醫(yī)藥與傳統(tǒng)中醫(yī)理論創(chuàng)新結(jié)合，也是臨床治療思路的創(chuàng)新開拓，本實驗為能更好地研究苗藥驗方聯(lián)合撳針埋穴治療失眠的相關(guān)機制，闡述苗藥驗方聯(lián)合撳針埋穴療效的科學性，從PCPA造模大鼠血清細胞因子IL-1、TNF-α的含量變化著手。

研究［17］發(fā)現(xiàn)，PCPA造模法是公認用于失眠動物造模的實驗研究方法，本實驗大鼠采用PCPA造模后，模型組大鼠體表特征積分明顯高于空白組大鼠，且相較于空白組，PI模型組的細胞因子IL-1和TNF-α含量均呈現(xiàn)明顯增高，差異具有顯著性（Plt;0.01）。而現(xiàn)代研究［18］認為細胞因子（IL-1、TNF-α）是免疫系統(tǒng)中與失眠有關(guān)的標志物之一［18］，通過調(diào)節(jié)IL-1、TNF-α水平，實現(xiàn)對睡眠的雙向調(diào)節(jié)。以上結(jié)果也提示注射PCPA后可能使體內(nèi)的IL-1與TNF-α水平的大量分泌，阻礙NREM睡眠，且模型組睡眠剝奪，與研究結(jié)果顯示相一致，同時還可能產(chǎn)生神經(jīng)毒性的相關(guān)分子［19-20］，而經(jīng)苗藥驗方、撳針埋穴各自單獨干預后，外周血清細胞因子IL-1、TNF-α水平均降低，具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），提示苗藥驗方、撳針埋穴可有效調(diào)節(jié)外周血清細胞因子IL-1、TNF-α水平，改善PI模型大鼠睡眠狀態(tài)，因此通過調(diào)節(jié)IL-1、TNF-α含量可有效改善睡眠。將二者聯(lián)用干預后，外周血清細胞因子IL-1、TNF-α水平顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.01），且接近正常組，與單獨治療組相比無統(tǒng)計學意義，提示能較單獨治療更好改善PI模型大鼠睡眠狀態(tài)的趨勢。

綜上所述，本研究初步證實苗藥驗方、撳針埋穴及二者聯(lián)合對PI模型大鼠具有一定調(diào)節(jié)作用，且二者聯(lián)合治療效果呈現(xiàn)更好的趨勢。其作用的發(fā)揮可能是通過調(diào)節(jié)外周血清細胞因子IL-1、TNF-α水平表達，從而達到改善睡眠的目的。本研究也還存在一些不足之處，苗藥聯(lián)合撳針組相較于苗藥組、撳針組在體質(zhì)量以及細胞因子IL-1、TNF-α水平表達改善方面無統(tǒng)計學意義，二者聯(lián)合組只呈現(xiàn)了更好的趨勢，不能說明二者聯(lián)合更優(yōu)于單獨使用的，可能需要更大樣本的研究；療效或許與免疫炎癥紊亂有關(guān)，且對于苗藥聯(lián)合撳針與免疫炎癥反應之間的關(guān)聯(lián)，仍需進行更深入的研究。接下來研究當中會加入其余相關(guān)炎癥因子的研究，同時加入更多影響IL-1、TNF-α表達的因素，進一步證實苗藥聯(lián)合撳針對IL-1、TNF-α的影響。

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