【摘 要】 目的：建立仙桃草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：對(duì)仙桃草藥材粉末進(jìn)行顯微鑒別，采用薄層色譜法（TLC）對(duì)藥材進(jìn)行定性鑒別，以原兒茶酸作為質(zhì)量標(biāo)志物建立高效液相色譜（HPLC）測(cè)定方法，根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》方法檢查其水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量。 結(jié)果：藥材顯微結(jié)構(gòu)明顯，與現(xiàn)有描述一致。薄層色譜法鑒別斑點(diǎn)清晰且分離度好。高效液相色譜法定量方法線性關(guān)系較好，重復(fù)性良好，回收率符合要求。依據(jù)《中國(guó)藥典》相關(guān)方法及原則，確定原兒茶酸（C7H6O4）為仙桃草藥材的主要成分且不得少于0.02％，仙桃草藥材水分含量不得超過12.0％，總灰分不得超過15.0％，酸不溶性灰分不得過5.0％，浸出物限度為不得低于26.0％。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，完善了仙桃草藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，為藥材的質(zhì)量控制及藥典的修訂提供了參考。

【關(guān)鍵詞】 仙桃草；原兒茶酸；薄層色譜鑒別；高效液相色譜；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

【中圖分類號(hào)】R284.1"" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A""" 【文章編號(hào)】1007-8517（2024）15-0046-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.15.zgmzmjyyzz202414011

Study on the Quality Standard of Xiantao Herbal Medicine

Abstract：Objective To establish the quality standard of Xiantao herbal medicine.Methods The powder of Cynodon grandiflorum herbs was identified microscopically and qualitatively by thin-layer chromatography （TLC），and a high-performance liquid chromatography （HPLC） method was established for the determination of protocatechuic acid as a quality marker，and the contents of moisture，total ash，acid-insoluble ash，and leachate were examined according to the methods of 2020 edition of the Chinese Pharmacopoeia.Results The microstructure of the herb was evident and consistent with the existing description.The identification spots were clear and well separated by thin-layer chromatography.The quantitative method of HPLC showed good linearity and reproducibility，and the recovery was in accordance with the requirements.According to the relevant methods and principles of the Chinese Pharmacopoeia，it was determined that protocatechuic acid （C7H6O4） was the main constituent of Cynanchum officinale and should not be less than 0.02%，the moisture content of Cynanchum officinale should not be more than 12.0%，the total ash should not be more than 15.0%，acid-insoluble ash should not be more than 5.0%，and the limit of leachate should not be less than 26.0%.Conclusion The method is simple and accurate，which improves the quality testing method of Cynodon grandiflorum herbs and provides a reference for the quality control of herbs and the revision of pharmacopoeia.

Key-words：Purslane Speedwell Herb; Cynanchum Officinale; Protocatechuic Acid; Thin-layer Chromatographic Identification; High Performance Liquid Chromatography; Quality Standard

仙桃草，又稱接骨草，為玄參科植物蚊母草Veronica peregrina L.帶蟲癭的干燥全草，全草入藥具有活血止血、消腫止痛的功效，對(duì)于各種出血癥以及瘀血腫痛具有良好的治療效果［1-2］。仙桃草中主要含綠原酸、黃酮類及鞣質(zhì)等成分，如原兒茶酸、金圣草素、木犀草素、香草酸等［3］，其中含有機(jī)酸類成分和黃酮類種類較多，尤以有機(jī)酸類中的原兒茶酸，黃酮類中的木犀草苷、木犀草素等為主要成分［4-6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，仙桃草具有促進(jìn)骨折愈合［7］、治療骨缺損［8-9］的作用。仙桃草曾被收載在《中國(guó)藥典》 （1977年版）一部中，后因種種原因未被收錄，導(dǎo)致目前尚無(wú)統(tǒng)一的國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。部分省份的標(biāo)準(zhǔn)雖然存在仙桃草的質(zhì)量要求規(guī)范，但尚存在一些問題，如目前沒有能夠代表藥材優(yōu)劣的化學(xué)成分作為檢查項(xiàng)，不符合現(xiàn)代藥物質(zhì)量的要求等。本實(shí)驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》2020年版［10］四部通則對(duì)仙桃草的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)行顯微鑒別、薄層鑒別，建立HPLC含量測(cè)定方法，以期為藥材的質(zhì)量控制及藥典的修訂提供參考，使仙桃草在臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)中有更廣泛的應(yīng)用，更好地控制仙桃草臨床用藥的安全性、有效性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 電子天平（華熙昕瑞分析儀器有限公司）；紫外分析儀（上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司）；顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社）；Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Agilent C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。

甲醇、乙醇為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。對(duì)照品：原兒茶酸（批號(hào)：110809-201906，純度≥98.0%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所。

1.2 藥材 收集來(lái)自安徽、河南等產(chǎn)地的仙桃草藥材共10批，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張加余教授鑒定為玄參科植物蚊母草Veronica peregrina L.帶蟲癭的干燥全草。樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 "顯微鑒別

2.1.1 切片的制備 將各批次仙桃草藥材粉末置于潔凈的載玻片上，加10%水合氯醛透化裝片，進(jìn)行顯微觀察。

2.1.2 切片觀察結(jié)果 藥材粉末為灰棕色。葉上下表皮細(xì)胞垂周壁稍彎曲或波狀彎曲。非腺毛由1-4細(xì)胞組成。腺毛有兩種，一種腺柄為單細(xì)胞，腺頭多為2細(xì)胞；另一種頭部單細(xì)胞，圓形，腺柄多由3細(xì)胞組成。木纖維淡黃色，成束，長(zhǎng)梭形，直徑約6 μm，壁較薄，胞腔較大。導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管，亦有環(huán)紋導(dǎo)管，直徑2～7 μm。顯微特征圖如圖1所示。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 樣品溶液的制備 稱定仙桃草藥材粉末約1 g，加入乙醇20 mL，加熱回流2 h，冷卻，過濾，取續(xù)濾液濃縮至1 mL，作為樣品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取原兒茶酸對(duì)照品適量，加乙醇制成約1 mg·mL-1的原兒茶酸對(duì)照品溶液。

2.2.3 薄層色譜 用毛細(xì)管吸取樣品溶液和對(duì)照品溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（8∶8∶1）為展開劑，展開，取出后晾干，置紫外燈（254 nm）下觀察。結(jié)果顯示，供試品色譜斑點(diǎn)在與對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置上出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)，且Rf值適中。如圖2所示。

2.3 檢查 參照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則水分測(cè)定法（烘干法，通則0832）、灰分測(cè)定法（通則2302）、浸出物測(cè)定法（熱浸法，通則2201）對(duì)10批仙桃草藥材分別進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物測(cè)定。結(jié)果見表2。

綜合測(cè)定結(jié)果，建議將仙桃草藥材中水分不得過12.0%，總灰分不得過15.0%，酸不溶性灰分不得過5.0%，浸出物不得低于26.0%作為檢查的最大限度。

2.4 原兒茶酸含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸對(duì)照品適量，加甲醇制成40 μg·mL-1的原兒茶酸對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取仙桃草藥材粉末1.0 g，置50 mL圓底燒瓶中，精密加入25 mL水，稱定重量。加熱回流2 h后，冷卻，再次稱量，補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件 流動(dòng)相為乙腈-0.15％磷酸溶液（10∶90），柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)以原兒茶酸峰計(jì)不低于5000。色譜圖如圖3所示。

2.4.4 專屬性試驗(yàn) 取空白溶劑、原兒茶酸對(duì)照品溶液、仙桃草樣品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下所述的色譜條件進(jìn)樣，原兒茶酸色譜峰處無(wú)其他物質(zhì)干擾，表明方法專屬性良好。

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密吸取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（2.01 mg·mL-1）適量，用水稀釋成濃度分別為5.02 μg·mL-1、10.05 μg·mL-1、 20.10 μg·mL-1、40.20 μg·mL-1、80.40 μg·mL-1、201.00 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以色譜峰峰面積對(duì)原兒茶酸濃度進(jìn)行線性回歸，求出回歸方程：y=0.594x-0.8245，相關(guān)系數(shù)r2=0.9999。原兒茶酸在濃度為5.02～201.00" μg·mL-1的范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（40.20 μg·mL-1），重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，原兒茶酸峰面積的RSD為0.26%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 耐用性試驗(yàn) 按“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液配制方法和“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備系列對(duì)照品溶液和兩份供試品溶液。改變色譜條件，分別在檢測(cè)波長(zhǎng)變化±2 nm、柱溫變化±5 ℃、流速變化±0.2 mL·min-1、酸性添加劑比例變化0.05%以及有機(jī)相比例變化±1.5%時(shí)進(jìn)行測(cè)定，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計(jì)算原兒茶酸含量并求其RSD。結(jié)果見表3。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取仙桃草樣品（批號(hào)：20201203），按“2.4.2”項(xiàng)下所述制備方法平行制備6份樣品溶液。進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中原兒茶酸的含量及RSD值。結(jié)果，仙桃草中原兒茶酸含量的RSD為2.79%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.9 日間精密度 平行配制6份樣品溶液，在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一個(gè)分析人員連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，連續(xù)測(cè)定3 d的日間精密度為0.07%，表明方法日間精密度良好。

2.4.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按上述方法制備樣品溶液，室溫放置。分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時(shí)進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計(jì)算原兒茶酸峰面積的RSD值。結(jié)果，RSD為0.35%（n=6），說(shuō)明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.11 回收率試驗(yàn) 取仙桃草（批號(hào)20201203，原兒茶酸含量為0.0687%）粉末約500 mg，精密稱定。平行取6份，置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液適量（約相當(dāng)于樣品中仙桃草含量的100%），精密加入25 mL水，加熱回流2 h后，冷卻，再稱定重量，補(bǔ)足失去水分。取上清液，濾過，續(xù)濾液進(jìn)樣分析。計(jì)算回收率，結(jié)果原兒茶酸的平均回收率為97.47%，RSD為2.08%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.12 樣品含量測(cè)定 按“2.4.2”項(xiàng)下所述制備方法制備樣品溶液（n=3），進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算10批仙桃草樣品中原兒茶酸的含量，見表4。由表中結(jié)果可知，不同產(chǎn)地、批次的仙桃草藥材中原兒茶酸含量有一定差異，綜合考慮暫定仙桃草藥材按干燥品計(jì)算，含原兒茶酸（C7H6O4）不得少于0.02%。

3 討論

3.1 薄層鑒別條件的篩選 對(duì)于仙桃草藥材的薄層鑒別，本研究分別對(duì)不同展開劑（甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸8∶8∶1、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸8∶8∶0.5、甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸8∶2∶1）、不同硅膠板（青島海洋預(yù)制薄層板、煙臺(tái)江友預(yù)制薄層板）、不同點(diǎn)樣量（1 μL、3 μL、5 μL）、展開溫度（30 ℃、5 ℃和室溫下）及飽和狀態(tài)（展開前飽和30 min和展開前不飽和）進(jìn)行了考察。根據(jù)斑點(diǎn)清晰程度、是否拖尾、是否存在斑點(diǎn)疊加現(xiàn)象等綜合考慮，最終決定以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（8∶8∶1）作為展開劑，選用青島海洋預(yù)制硅膠GF254薄層板，點(diǎn)樣3 μL，展開前飽和30 min，不限定展開溫度進(jìn)行展開分離效果最好，且斑點(diǎn)清晰，Rf值適中。

3.2 提取條件的選擇 本研究考察了不同提取方法（超聲、回流提?。?、提取溶劑（甲醇、50%甲醇、50%乙醇、20%乙醇、10%乙醇、水）、提取時(shí)間（1 h、2 h），結(jié)果顯示回流提取法的提取效率明顯高于超聲提取法；采用水為提取溶劑時(shí)，樣品中原兒茶酸的含量最高；回流提取120 min提取效率最高。最終決定加25 mL水，加熱回流2 h為最佳提取方法。

3.3 色譜條件的選擇 本研究考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)（260 nm、265 nm、293 nm）、流動(dòng)相比例（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.15%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液），柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）、流速（0.8 mL·min-1、1.0mL·min-1、1.2 mL·min-1），根據(jù)特征峰的峰形、峰面積、分離度等確定了最佳色譜條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.15％磷酸溶液（10∶90）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。

4 結(jié)論

仙桃草在一些省份的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雖有收錄，但還不太完善，本研究對(duì)仙桃草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善和提高，增加了顯微鑒定、薄層鑒別、水分檢查項(xiàng)、灰分檢查項(xiàng)、浸出物檢查項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)等。薄層色譜鑒別斑點(diǎn)清晰且分離度較好，能夠有效鑒別藥材真?zhèn)?；初步確定了藥材水分、灰分、浸出物等各限量標(biāo)準(zhǔn)，暫定水分含量不得超過12.0%，總灰分不得超過15.0%，酸不溶性灰分不得超過5.0%，浸出物限度為不得低于26.0%；對(duì)仙桃草藥材中原兒茶酸進(jìn)行定量分析，確定了原兒茶酸在5～200 μg·mL-1范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好，方法學(xué)驗(yàn)證的RSD值均符合要求。研究所建立的方法能夠較全面地反映仙桃草的質(zhì)量情況，為仙桃草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了一定依據(jù)。

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