摘 要：本試驗(yàn)對(duì)《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》（GB/T 19777—2013）附錄B中高效液相色譜法測(cè)定山西老陳醋中川芎嗪的方法進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)樣品處理過(guò)程中的溶液體系pH值、三氯甲烷用量、離心條件進(jìn)行研究。最終確定使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)pH值至11.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、于6 000 r·min-1下離心5 min的處理?xiàng)l件下測(cè)定效果最好，加標(biāo)回收率為90.9%～93.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%～1.19%，均可以滿足山西老陳醋中川芎嗪的測(cè)定需求。

關(guān)鍵詞：山西老陳醋；川芎嗪；高效液相色譜法

Optimization of High Performance Liquid Chromatography for Determination of Ligustrazine in Shanxi Aged Vinegar

XU Zhifang， ZHAO Yiru

（China Spectrum Testing Technology （Shanxi） Co.， Ltd.， Linfen 043000， China）

Abstract： This experiment optimized the method for determining ligustrazine in Shanxi aged vinegar by high-performance liquid chromatography in appendix B of GB/T 19777—2013. The pH value of the solution system， the amount of trichloromethane， and the centrifugation conditions during the sample processing were studied through single factor experiments and orthogonal experiments. Finally， it was determined to use sodium hydroxide solution （200 g·L-1） to adjust the pH to 11.0， extract twice with 5 mL of chloroform， and centrifuge at 6 000 r·min-1 for 5 min. The best results were obtained under the treatment conditions， with a standard recovery rate ranging from 90.9% to 93.8% and a relative standard deviation of 0.47% to 1.19%， all of which can meet the requirements for the determination of ligustrazine in Shanxi aged vinegar.

Keywords： Shanxi aged vinegar; ligustrazine; high-performance liquid chromatography

山西老陳醋是以高粱為主要原料，配以小米、豌豆、糯米、大米、小麥麩皮和苦蕎麥等優(yōu)質(zhì)淀粉質(zhì)糧食作物以及谷糠、稻殼等輔料經(jīng)液化、糖化、酒精化和醋化多道工藝生產(chǎn)而成的具有獨(dú)特風(fēng)味的餐桌美味[1]。川芎嗪是山西老陳醋中的一種有益成分，具有改善人體心腦血管和微循環(huán)等功能，其主要來(lái)源于美拉德反應(yīng)，含量與發(fā)酵水平、生產(chǎn)過(guò)程和陳放時(shí)間等因素有關(guān)[2]。研究表明，川芎嗪最早出現(xiàn)在醋酸發(fā)酵過(guò)程中，但該階段的產(chǎn)生量很少，加熱煎煮和密封陳放過(guò)程都能顯著增加川芎嗪的含量，且隨著陳放時(shí)間的延長(zhǎng)，川芎嗪含量會(huì)持續(xù)增加，是山西老陳醋的特征指標(biāo)之一[3-4]?！兜乩順?biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》（GB/T 19777—2013）附錄B[5]中規(guī)定了山西老陳醋中川芎嗪的檢測(cè)方法，但筆者在日常檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該方法測(cè)定山西老陳醋的加標(biāo)回收率較低（65%左右），基于此，本文對(duì)GB/T 19777—2013附錄B中高效液相色譜法測(cè)定山西老陳醋中川芎嗪的方法進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋樣：山西老陳醋（川芎嗪本底值19.25 mg·L-1）；鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110817-201608，含量以83.4%計(jì)，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?；三氯甲烷（?yōu)級(jí)純，山東金嶺化工股份有限公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC2030-D高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器），日本島津公司；AUW120D電子天平（精度0.01 mg），梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；HC-3016R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；WH-861旋渦混合器，華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3E pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理方法

使用單標(biāo)線移液管準(zhǔn)確移取待測(cè)醋樣10.00 mL于50 mL的離心管中，用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)pH值，加入一定量的三氯甲烷，渦旋混合2 min，使三氯甲烷與樣品充分混勻，置于高速冷凍離心機(jī)中離心一定時(shí)間，轉(zhuǎn)移三氯甲烷層；重復(fù)加入三氯甲烷提取，合并2次三氯甲烷層。然后加入4.5 mL鹽酸溶液（0.2 mol·L-1）萃取，重復(fù)1次，合并水相，用一級(jí)水定容至10.00 mL，過(guò)0.45 μm濾膜待測(cè)。

1.3.2 方法條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）準(zhǔn)確移取4份待測(cè)醋樣，分別使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)pH值至8.5、9.0、10.0和11.0，加入5 mL三氯甲烷，于4 000 r·min下離心5 min，其他操作同1.3.1中，篩選適宜的溶液體系pH值。

（2）準(zhǔn)確移取4份待測(cè)醋樣，使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)至最適宜pH值，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、加入10 mL三氯甲烷萃取1次、加入5 mL三氯甲烷萃取3次以及加入10 mL三氯甲烷萃取2次，于4 000 r·min-1下離心15 min，其他操作同1.3.1中，篩選適宜的三氯甲烷用量及萃取次數(shù)。

（3）準(zhǔn)確移取4份待測(cè)醋樣，使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)至最適宜pH值，一次或多次加入適宜的三氯甲烷，離心條件分別設(shè)置為4 000 r·min-1下離心5 min、4 000 r·min-1下離心15 min、6 000 r·min-1下離心5 min以及8 000 r·min-1下離心5 min，其他操作同1.3.1中，篩選最佳的離心條件。

1.3.3 方法條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以品牌山西老陳醋（川芎嗪本底值19.25 mg·L-1）為加標(biāo)樣品，每份樣品加入300 μL濃度為1.0 mg·mL-1的川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照3因素3水平正交試驗(yàn)表（見(jiàn)表1）中的方法條件進(jìn)行處理，每個(gè)水平樣品平行測(cè)定6次，計(jì)算6次平均測(cè)定結(jié)果的加標(biāo)回收率。

1.4 液相色譜測(cè)定條件

色譜柱：GL Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：20 ℃；流動(dòng)相：磷酸二氫銨（0.2 mmol·L-1）∶甲醇=6∶4；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；DAD檢測(cè)器波長(zhǎng)：λ=279 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 溶液體系pH值篩選

由圖1可知，使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)醋樣pH值至8.5，加入5 mL三氯甲烷，于4 000 r·min-1下離心15 min條件下，發(fā)現(xiàn)三氯甲烷與醋樣無(wú)明顯分層，故無(wú)法轉(zhuǎn)移三氯甲烷層。使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)醋樣pH值至9.0時(shí)，其他操作同上，發(fā)現(xiàn)三氯甲烷與醋樣有分層，但有機(jī)層的體積約為0.5 mL。使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)醋樣pH值＞10.0時(shí)，其他操作同上，發(fā)現(xiàn)三氯甲烷與醋樣明顯分層，有機(jī)層體積約3.0 mL，由此確定溶液體系的最佳pH值為10.0～11.0，正交試驗(yàn)中溶液體系pH值的3個(gè)水平選9.0、10.0、11.0。

2.1.2 三氯甲烷用量的確定

使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)醋樣pH值至10.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、加入10 mL三氯甲烷萃取1次、加入5 mL三氯甲烷萃取3次、加入10 mL三氯甲烷萃取2次，4份醋樣均在4 000 r·min-1下離心15 min。經(jīng)測(cè)試并計(jì)算得，山西老陳醋（本底值19.25 mg·L-1）中川芎嗪含量分別為16.14 mg·L-1、16.23 mg·L-1、16.24 mg·L-1、

15.51 mg·L-1，由于三氯甲烷為有毒有害試劑，綜合考慮用量及回收率得出三氯甲烷最適宜用量為用5 mL三氯甲烷萃取2次，正交試驗(yàn)中三氯甲烷用量的3個(gè)水平為加入5 mL萃取2次、加入10 mL萃取1次、加入5 mL萃取3次。

2.1.3 離心條件的確定

使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)醋樣pH值至10.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次，分別在離心條件為4 000 r·min-1下離心5 min、4 000 r·min-1下離心15 min、6 000 r·min-1下離心5 min、8 000 r·min-1的條件下離心5 min，發(fā)現(xiàn)三氯甲烷與醋樣均明顯分層，有機(jī)層體積分別為0.5 mL、3.0 mL、3.5 mL和3.0 mL，且8 000 r·min-1下離心5 min出現(xiàn)乳化。將處理過(guò)的4份醋樣分別上機(jī)測(cè)定，計(jì)算得山西老陳醋（本底值19.25 mg·L-1）中川芎嗪含量分別為14.04 mg·L-1、16.24 mg·L-1、16.43 mg·L-1和15.88 mg·L-1，綜合考慮萃取后分層狀態(tài)及回收率得出最佳離心條件為6 000 r·min-1下離心5 min，正交試驗(yàn)中離心條件的3個(gè)水平為4 000 r·min-1下離心15 min、6 000 r·min-1下離心5 min、8 000 r·min-1下離心5 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2中正交試驗(yàn)的結(jié)果可知，溶液體系pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響最大，其次為三氯甲烷用量，離心條件的影響較小。由k值得，正交試驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A3B1C2，即使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)pH值至11.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、于6 000 r·min-1下離心5 min的處理?xiàng)l件下加標(biāo)回收效果最優(yōu)。

2.3 優(yōu)化方法的準(zhǔn)確度與精密度測(cè)試

選擇不同品牌、不同度數(shù)的3種山西老陳醋樣品，分別加入200 μL濃度為1.0 mg·mL-1的川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用2.2中正交試驗(yàn)篩選出的條件處理醋樣，在1.4液相色譜條件下進(jìn)行6次平行測(cè)定，計(jì)算6次平均測(cè)定結(jié)果的加標(biāo)回收率及精密度（以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）。由表3可知，使用優(yōu)化的方法條件進(jìn)行醋樣前處理，加標(biāo)回收率為90.9%～93.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.47%～1.19%，準(zhǔn)確度與精密度均可以滿足山西老陳醋中川芎嗪測(cè)定的需求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)針對(duì)GB/T 19777—2013附錄B中高效液相色譜法測(cè)定山西老陳醋中川芎嗪方法回收率較差的問(wèn)題，使用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，并使用優(yōu)化后的方法條件對(duì)3種不同品牌、不同度數(shù)的山西老陳醋樣品進(jìn)行加標(biāo)回收與精密度驗(yàn)證，得出使用氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）調(diào)節(jié)醋液pH值至11.0，分別加入5 mL三氯甲烷萃取2次、6 000 r·min-1下離心5 min，加標(biāo)回收率為90.9%～93.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%～1.19%。優(yōu)化后的方法可將日常檢驗(yàn)中川芎嗪的加標(biāo)回收率由65%提升至90%以上，大大提高了山西老陳醋中川芎嗪測(cè)定的準(zhǔn)確度，可以滿足食醋企業(yè)和食品檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)山西老陳醋中川芎嗪的檢測(cè)需求。

參考文獻(xiàn)

[1]胡紅娟.山西老陳醋釀造技藝[J].食品工程，2015（3）：18-20.

[2]朱麗，樊垚，曾泳艇，等.山西老陳醋中川芎嗪測(cè)定及特征分析研究[J].食品科技，2014，39（12）：294-298.

[3]王瑞，彭曉光，黃登宇.食醋中川芎嗪成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2015，40（6）：137-140.

[4]鞏麗青，韓順林，趙芳，等.山西老陳醋釀造過(guò)程中川芎嗪的分析測(cè)定[J].中國(guó)調(diào)味品，2018，43（8）：135-138.

[5]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋：GB/T 19777—2013[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.