摘""要：探究綠農(nóng)林?31復(fù)合微生物菌劑活性及其對(duì)海南大葉種茶茶餅病發(fā)生和茶葉內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為合理應(yīng)用微生物制劑綠色防控茶餅病提供理論依據(jù)。通過(guò)測(cè)試室內(nèi)抗菌譜、激光共聚焦顯微鏡觀察形態(tài)、測(cè)試病原真菌孢子萌發(fā)抑制率評(píng)價(jià)綠農(nóng)林?31復(fù)合微生物菌劑（LNL31）活性，開(kāi)展田間隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)測(cè)試LNL31不同稀釋倍數(shù)對(duì)海南大葉種茶茶餅病的防效，以及對(duì)海南大葉種茶茶樹(shù)芽長(zhǎng)、芽密度、鮮重和葉綠素的影響；采用16S"rDNA測(cè)序技術(shù)，探究施用微生物菌劑條件下茶樹(shù)葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果表明：LNL31稀釋液對(duì)壞損外擔(dān)菌ER01、膠孢炭疽菌CG02、尖孢鐮刀菌FOC4、柑橘黃單胞桿菌XC01、大腸桿菌DH5α"5種病原菌的抑制作用明顯，對(duì)ER01、CG02和FOC4的孢子萌發(fā)抑制率達(dá)89.04%～93.00%。田間施用LNL31"500倍稀釋液處理的防病促生作用最顯著，與化學(xué)藥劑吡唑醚菌酯處理相當(dāng)，LNL31"1000倍稀釋液次之。施藥后14"d，LNL31"500倍液、1000倍液對(duì)茶餅病的防效分別達(dá)91.98%和89.17%。LNL31對(duì)芽長(zhǎng)、芽密度、鮮重和葉綠素的促生作用分別達(dá)23.14%～36.17%、32.10%～51.38%、27.66%～40.00%和28.88%～36.14%。噴施不同濃度的LNL31后，茶樹(shù)葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落的豐富度和均勻度均增加，主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果表明，噴施LNL31對(duì)葉內(nèi)細(xì)菌群落有顯著影響；在目分類(lèi)水平上，根瘤菌目（Rhizobiales）和鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）是較占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌目；在屬分類(lèi)水平上，甲基桿菌屬（Methylobacterium）是最優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生細(xì)菌屬，其次是1174_901_12、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和根瘤菌屬（Rhizobium）；線性判別分析（LEfSe）結(jié)果顯示，噴施LNL31的處理中具有9～14個(gè)指示菌群，而對(duì)照指示細(xì)菌屬只有7個(gè)；物種豐度聚類(lèi)分析表明，噴施LNL31的處理中獨(dú)有優(yōu)勢(shì)屬拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia）與伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）的豐度相似，根瘤菌屬與1174_901_12的豐度相似。相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析表明，芽孢桿菌屬（Bacillus）與真桿菌屬（Eubacterium）和副擬桿菌屬（Parabacteroides）呈正相關(guān)，與甲基桿菌屬、拜葉林克氏菌屬和藤黃色桿菌屬（Luteibacter）呈負(fù)相關(guān)；Bugbase菌群功能預(yù)測(cè)表明，LNL31處理的好氧菌、生物膜形成、革蘭氏陰性菌、耐受壓力、可移動(dòng)元件、兼性厭氧菌豐度增幅達(dá)到3.24%～14.78%，潛在致病菌下降5.70%。該研究結(jié)果表明，LNL31表現(xiàn)出良好的防病促生作用，能顯著改變茶葉內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能特性，使少數(shù)抗病相關(guān)物種優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，為茶餅病的生物防治提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：綠農(nóng)林?31復(fù)合微生物菌劑；茶餅病；內(nèi)生細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)中圖分類(lèi)號(hào)：S31""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Evaluation"of"the"Performance"of"Lvnonglin?31"Compound"Bacterial"Agent"and"Its"Effect"on"the"Occurrence"of"Blister"Blight"and"Endophytic"Bacterial"Community"in"Leaves"of"Camellia"sinensis"var."assamica"in"Field

Zhou"You1，"Li"Xiaoxia2，"Liu"Jian3，"DENG"Tao4，"Huang"Junsheng1，"Yang"Laying1，"FU"hongwen5，"Wang"Jun1*

1."Institute"of"Environment"and"Plant"Protection，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"National"Fertilizer"Microbial"Germplasm"Resource"Bank"（Hainan），"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Institute"of"Scientific"and"Technical"Information，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Heze"Customs，"people’s"Republic"of"China，"Heze，"Shandong"274000，"China;"4."Institute"of"Microbiology，"Jiangxi"Academy"of"Sciences，"Nanchang，"Jiangxi"330096，"China;"5."Hainan"Baolvchun"Agricultural"Development"Co.，"Ltd.，"Haikou，"Hainan"571100，"China

Abstract："The"purpose"of"this"study"is"to"explore"the"relationship"between"the"activity"of"Lvnonglin?31"compound"microbial"agent"（LNL31），"the"occurrence"of"blister"blight"and"the"structure"of"endophytic"bacterial"communities"in"tea，"and"to"provide"a"theoretical"basis"for"the"rational"application"of"microbial"agents"for"green"control"of"blister"blight"in"Camellia"sinensis"var."assamica."The"activity"of"LNL31"was"evaluated"through"indoor"antibacterial"spectrum"testing，"laser"confocal"microscope"morphology"observation，"pathogenic"fungus"spore"germination"inhibition"rate"test，"and"transparent"circle"detection"enzyme"activity"methods."Field"randomized"block"trials"were"carried"out"to"test"the"disease"prevention"and"growth"promotion"effects"of"LNL31"with"different"dilution"ratios."Then"the"tea"tree"bud"length，"bud"density，"fresh"weight"and"chlorophyll"were"respectively"measured."Using"16S"rDNA"sequencing"technology，"the"differences"in"the"occurrence"of"the"blister"blight"in"C."sinensis"var."assamica"and"the"community"structure"of"endophytic"bacteria"in"leaves"under"LNL31"were"investigated."The"diluted"LNL31"had"obvious"inhibitory"effect"on"five"pathogens，"such"as"Exobasidium"vexans"EV01，"Colletotrichum"gloeosporioides"CG02，"Fusarium"oxysporum"FOC4，"Xanthomonas"axonopodis"pv."citri"XC01"and"Escherichia"coli"DH5α，"which"caused"the"hyphae"to"break，"expand"and"digest."The"inhibition"rate"of"LNL31"on"spore"germination"of"pathogenic"fungi"EV01，"CG02"and"FOC4"reached"89.04%-93.00%."In"field"randomized"block"trials，"the"application"of"500-fold"dilution"of"LNL31"had"the"most"significant"disease"prevention"and"growth"promotion"effect，"which"was"similar"to"the"treatment"of"the"pyraclostrobin，"followed"by"1000-fold"dilution"of"LNL31."The"averages"of"bud"length，"germination"density，"hundred"bud"weight"and"chlorophyll"of"the"plants"in"the"treatment"of"LNL31"increased"by"23.14%-36.17%，"32.10%-51.38%，"27.66%-40.00%"and"28.88%-36.14%，"respectively，"in"comparison"with"the"control."After"spraying"different"concentrations"of"LNL31，"the"richness"and"uniformity"of"endophytic"bacterial"communities"increased，"and"the"results"of"principal"coordinate"analysis"（PCoA）"showed"that"there"was"a"significant"impact"on"bacterial"communities"in"leaves."At"the"taxonomic"level，"Rhizobiales"and"Sphingomonadales"were"the"dominant"bacterial"orders;"Methylobacterium"was"the"dominant"bacterial"genus，"followed"by"1174_901_12，"Sphingomonas"and"Rhizobium."Linear"discriminant"analysis"（LEfSe）"showed"that"there"were"9-14"indicator"bacterial"groups"in"the"treatment"sprayed"with"LNL31，"compared"with"only"7"indicator"bacterial"genera"in"the"control."Cluster"analysis"of"species"abundance"showed"that"the"unique"dominant"genus"Baierinkia"and"Burkholderia"in"the"treatment"of"LNL31"were"similar"in"abundance，"while"Rhizobium"and"1174_901_1"were"similar"in"abundance."Correlation"network"analysis"Bacillus"is"positively"correlated"with"Eubacterium"and"Parabacteroide，"and"negatively"correlated"with"Methylobacterium，"Beijerinckia"and"Luteibacter."Bugbas’s"functional"prediction"showed"that"the"abundance"of"aerobic"bacteria，"biofilm"forming，"gram-negative"bacteria，"stress-tolerant"bacteria，"movable"elements，"and"facultative"anaerobic"bacteria"treated"by"the"composite"microbial"agent"increased"by"3.24%-14.78%，"and"potential"pathogenic"bacteria"dropped"by"5.70%."LNL31"showed"a"good"effect"of"preventing"diseases"and"promoting"growth，"and"significantly"changed"the"community"structure"and"functional"characteristics"of"endophytic"bacteria"in"tea，"enabling"a"few"disease-resistant"related"species"to"grow"in"an"advantageous"way，"which"provided"a"basis"for"biological"control"of"blister"blight"of"tea.

Keywords："Lvnonglin?"31"compound"microbial"agent;"blister"blight"of"tea;"endophytic"bacterial;"community"structure

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.12.016

茶樹(shù)是海南重要的經(jīng)濟(jì)作物。海南省五指山是海南大葉種茶（Camellia"sinensis"var."assamica）核心產(chǎn)區(qū)，該地區(qū)高濕的氣候有利于茶樹(shù)生長(zhǎng)，但也有利于病蟲(chóng)害的滋生蔓延[1]。由壞損外擔(dān)菌（Exobasidium"vexans"Massee）引起的茶餅病是危害茶樹(shù)最嚴(yán)重的病害之一[2]，主要為害嫩葉和嫩梢，潛育期較短，對(duì)茶葉產(chǎn)量的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他病害，導(dǎo)致茶葉嚴(yán)重減產(chǎn)和品質(zhì)下降[3-4]。茶餅病屬于低溫高濕型病害，在海南一般是春茶期發(fā)生嚴(yán)重。當(dāng)前生產(chǎn)中絕大多數(shù)茶樹(shù)栽培品種對(duì)茶餅病均表現(xiàn)為易感，在氣候適宜發(fā)病的茶區(qū)病害發(fā)生嚴(yán)重[2]。目前化學(xué)藥劑防治茶餅病雖然直接有效[4-5]，但易導(dǎo)致茶葉農(nóng)藥殘留大，易產(chǎn)生抗性，影響品質(zhì)和食品安全。為保障茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，研究和推廣病蟲(chóng)害綠色防控技術(shù)為大勢(shì)所趨。生物防治具有安全環(huán)保的優(yōu)勢(shì)，如芽孢桿菌（Bacillus"spp.）、假單胞菌（Pseudomonas"fluorescens）、蒼白桿菌（Ochrobactrum"anthropi）和黃單胞菌（Xanthomonas"sp.）等生防菌能降低茶餅病的發(fā)病率[2，"6-7]，其中芽孢桿菌的抗逆性好、貨架期長(zhǎng)，具有廣闊的應(yīng)用前景[8-9]，其防病機(jī)制主要為定殖到植株后通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌拮抗物質(zhì)、降解病原菌和提升植物抗病性等方式共同作用，具體表現(xiàn)為抑制病原菌孢子萌發(fā)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹變形、原生質(zhì)解體或收縮[10-13]。

內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是反映植物抗病、感病的重要指標(biāo)。研究生防菌制劑對(duì)發(fā)病植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響和病害防治至關(guān)重要。崔明秦等[14]認(rèn)為植物內(nèi)生微生物與植物長(zhǎng)期共存，二者協(xié)同進(jìn)化，互惠互利，發(fā)現(xiàn)炭疽菌侵染油茶后病葉片中甲基桿菌屬（Methylobacterium，"1.91%）相對(duì)豐度最高，健康葉片中海洋桿菌屬（Pontibacter，"1.41%）相對(duì)豐度最高。RAHMA等[15]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌LmB1、LmA6菌株是控制水稻白葉枯病和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛在生物制劑，對(duì)病害抑制和促生作用分別為35.82%和69.56%。UWAREMWE等[16]發(fā)現(xiàn)抑制枸杞根腐病的解淀粉芽孢桿菌HSB1和FZB42對(duì)枸杞根際固有菌群的豐度及其功能產(chǎn)生了積極影響。YADAV等[17]研究發(fā)現(xiàn)與丙環(huán)唑和對(duì)照相比，枯草芽孢桿菌W9噴霧處理番茄斑點(diǎn)病后葉片內(nèi)生伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、根瘤菌目（Rhizobiales）和假單胞菌目（Pseudomonadales）等相對(duì)豐度較高，分泌、應(yīng)激、趨化和礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的代謝途徑得到增強(qiáng)，發(fā)病率降低。FENG等[18]發(fā)現(xiàn)施用芽孢桿菌ME9防治木薯細(xì)菌性枯萎病使木薯內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性提高，在優(yōu)勢(shì)菌群的葡萄糖代謝途徑中，厚壁菌門(mén)與其他門(mén)呈顯著正相關(guān)，而變形菌門(mén)呈顯著負(fù)相關(guān)。

由于茶餅病病原菌壞損外擔(dān)菌難以離體培養(yǎng)，限制了其防控技術(shù)等方面的研究[2]。芽孢桿菌具有穩(wěn)定、廣譜的防病促生功能[19-24]，但目前微生物活菌制劑在田間防治茶餅病方面極少報(bào)道。綠農(nóng)林?31復(fù)合微生物菌劑是本團(tuán)隊(duì)研發(fā)的正式登記產(chǎn)品，由生防菌解淀粉芽孢桿菌（B."amyloliquefaciens）HW05專(zhuān)利菌株（ZL2018 10578016.9）、巨大芽孢桿菌（B."megaterium）BM03和載體復(fù)配制備，但其田間應(yīng)用穩(wěn)定性和防病促生作用尚不明確。本研究以茶餅病為防控對(duì)象，以茶園常用的化學(xué)殺菌劑吡唑醚菌酯為對(duì)照，探討綠農(nóng)林?31復(fù)合微生物菌劑活性及其對(duì)茶餅病的防病促生功效和內(nèi)生細(xì)菌群落的影響，為茶餅病的綠色防控提供有效藥劑和技術(shù)支撐。

1""材料與方法

1.1""材料

茶樹(shù)品種：海南大葉種茶（C."sinensis"var."assamica）。

指示病原菌：茶餅病病原菌壞損外擔(dān)菌EV01，茶樹(shù)炭疽病病原菌膠孢炭疽菌（Colletotrichum"gloeosporioides）CG02、香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium"oxysporum）FOC4（攜帶GFP）、柑橘潰瘍病病原菌柑橘黃單胞桿菌（Xanthomonas"axonopodis"pv.citri）XC01和大腸桿菌（Escherichia"coli）DH5α，均由國(guó)家肥料微生物種質(zhì)資源庫(kù)（海南）提供。

供試生防菌：解淀粉芽孢桿菌HW05專(zhuān)利菌株、巨大芽孢桿菌BM03，均由國(guó)家肥料微生物種質(zhì)資源庫(kù)（海南）提供。

供試綠農(nóng)林?31復(fù)合微生物菌劑（以下簡(jiǎn)稱(chēng)LNL31）：登記證號(hào)為微生物肥（2019）準(zhǔn)字（7526）號(hào)，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所研制，海南寶綠春農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)。制備方法：將新鮮的HW05和BM03菌株分別轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基，在37"℃，180"r/min條件下培養(yǎng)24"h獲得種子液，以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接入裝有LB培養(yǎng)基的GUJS-100L"A型機(jī)械攪拌不銹鋼發(fā)酵罐中，于37"℃，通氣量30"L/min，壓力為0.3"Mpa，180"r/min培養(yǎng)48"h獲得發(fā)酵液，取發(fā)酵液經(jīng)LPG-10離心噴霧干燥機(jī)噴霧干燥后獲得HW05和BM03純菌粉，參照農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)GB"20287—2006與聚乙烯醇和可溶性玉米粉復(fù)配獲得LNL31（粉劑，芽孢率≥95%，有效活菌數(shù)≥100億個(gè)/g，其中HW05≥82億個(gè)/g，BM03≥18億個(gè)/g）。

供試化學(xué)藥劑：25%吡唑醚菌酯乳油[巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司]。

1.2""方法

1.2.1""LNL31抗菌譜測(cè)試""取0.1"g"LNL31用無(wú)菌水稀釋1000倍，混勻。將直徑為6"mm的指示病原菌膠孢炭疽菌CG02、尖孢鐮刀菌FOC4菌餅接種到LB平板中央，距離平板中心0.8"cm處接5"μL"LNL31"1000倍稀釋液，以?xún)H接種病原菌為對(duì)照，于28"℃培養(yǎng)，72"h后測(cè)量抑菌帶寬度，觀察對(duì)病原菌的拮抗效果；取新鮮的地毯草黃單胞桿菌XC01、大腸桿菌DH5α菌液（106個(gè)/mL）涂布于LB平板，距離平板中心0.8"cm處接5"μL"LNL31"1000倍稀釋液，平板中心接入等量清水作為對(duì)照，于28"℃培養(yǎng)，48"h后測(cè)量抑菌圈直徑，觀察LNL31對(duì)病原菌的拮抗效果。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2""LNL31對(duì)病原真菌EV02、CG02、FOC4孢子萌發(fā)的影響""由于壞損外擔(dān)菌EV01難以離體培養(yǎng)，因此從茶樹(shù)葉片的茶餅病病斑上挑取壞損外擔(dān)菌孢子。參照文獻(xiàn)[25-26]的方法，分別制備含有LNL31不同稀釋倍數(shù)[500倍（t1）、1000倍（t2）、2000倍（t3）、4000倍（t4）]和濃度為1×106個(gè)/mL的病原真菌EV01、CG02、FOC4分生孢子的混合液。上述各處理的混合液分別接種到疏水玻片上。以添加無(wú)菌水的分生孢子液接種作為對(duì)照（CK），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)統(tǒng)計(jì)100個(gè)孢子。于28"℃恒溫黑暗條件下保濕培養(yǎng)24"h，在顯微鏡下觀察并計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.2.3""LNL31對(duì)病原真菌EV01和FOC4菌絲和形態(tài)的影響""用移液槍吸取1.2.2中處理24"h的EV01和LNL31的混合液，置于普通光學(xué)顯微鏡觀察并拍照EV01孢子的萌發(fā)情況；利用牙簽挑取1.2.1中抑菌帶周?chē)鶩OC4的菌體組織，固定到載玻片后，置于激光共聚焦顯微鏡（FV1000，"Olympus）觀察暗場(chǎng)和明場(chǎng)下FOC4菌絲和孢子形態(tài)。

1.2.4""LNL31對(duì)茶餅病的田間防治作用""于2023年1月25日在海南省五指山市水滿鄉(xiāng)茶園進(jìn)行試驗(yàn)。大葉種茶樹(shù)齡15"a。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，按照推薦用量稀釋?zhuān)哼吝蛎丫ハ♂?000倍（T1），LNL31稀釋1000倍（T2）、500倍（T3），以清水為對(duì)照（CK）。按照每667"m2噴水量40"kg，各處理均為背負(fù)式噴霧器噴霧。每個(gè)處理重復(fù)3次，面積30"m2，各處理間采用完全隨機(jī)區(qū)組排列。間隔7"d后，按相同方法進(jìn)行第2次噴施。

（1）防治效果測(cè)定。參照文獻(xiàn)[4]的方法，分別于施藥前、第1次施藥后7"d、第2次施用LNL31"7"d后，調(diào)查病情指數(shù)和計(jì)算防效。各處理小區(qū)選取芽下第2片葉，調(diào)查50片葉，分級(jí)記錄。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，葉片無(wú)病斑；1級(jí)，病斑占葉面積25%以下；2級(jí)，零星病斑占葉面積26%～50%；3級(jí)，病斑占葉面積51%～75%；4級(jí)，葉片上病斑密集，占葉面積76%及以上。按以下公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果：病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×4）×100；防治效果="[1–（對(duì)照區(qū)藥前病情指數(shù)×處理區(qū)藥后病情指數(shù)）/（對(duì)照區(qū)藥后病情指數(shù)×處理區(qū)藥前病情指數(shù)）]×100%。

（2）茶樹(shù)主要生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定。田間試驗(yàn)結(jié)束后，參照文獻(xiàn)[27]的方法測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)。

芽長(zhǎng)：在各處理小區(qū)內(nèi)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為隨機(jī)選取的100"cm×100"cm方形區(qū)域，采集該區(qū)域內(nèi)1芽2葉的芽頭，測(cè)定頂芽至第2片葉的長(zhǎng)度。

芽密度：在各處理小區(qū)內(nèi)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為隨機(jī)選取的30"cm×30"cm范圍內(nèi)的健康芽頭，記錄芽頭個(gè)數(shù)。

鮮重：在各處理小區(qū)內(nèi)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)為隨機(jī)選取的100"cm×100"cm方形區(qū)域，采集該區(qū)域內(nèi)所有1芽2葉的芽頭，采摘當(dāng)天立即進(jìn)行稱(chēng)重。

葉綠素相對(duì)含量：在自然光下分別從每株上、下部分選取健康葉片，用葉綠素測(cè)定儀TYS-4N測(cè)定葉片葉綠素相對(duì)含量，即SPAD值。

（3）葉片內(nèi)生細(xì)菌微生物多樣性測(cè)定。田間試驗(yàn)結(jié)束后，參考文獻(xiàn)[14]的方法，略作修改，隨機(jī)采集茶樹(shù)3片嫩葉，表面消毒。提葉片DNA后，基于Illumina"NovaSeq測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序（Paired-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)，對(duì)16S"rDNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。由北京百邁客生物科技有限公司測(cè)序。

1.3""數(shù)據(jù)處理

采用Excel"2016、SAS"9.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。使用北京百邁客生物科技有限公司云平臺(tái)的Usearch、QIIME2、R語(yǔ)言、Python語(yǔ)言、BugBase等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""LNL31的抗菌譜

LNL31稀釋1000倍后對(duì)4種病原菌的拮抗效果顯著，對(duì)膠孢炭疽菌CG02和尖孢鐮刀菌FOC4的抑菌圈分別達(dá)1.22、1.15"cm；對(duì)柑橘黃單胞桿菌XC01和大腸桿菌DH5α的抑菌圈均達(dá)1.5"cm以上（圖1）。

2.2""LNL31對(duì)孢子萌發(fā)的影響

通過(guò)測(cè)定LNL31不同稀釋倍數(shù)對(duì)EV01、FOC4和GC02萌發(fā)率的影響表明，與CK相比，各處理間差異顯著，LNL31稀釋500倍處理的孢子萌發(fā)抑制率最高，其次為1000倍、2000倍和4000倍。500倍、1000倍、2000倍、4000倍處理對(duì)EV01孢子萌發(fā)的抑制率分別為92.01%、74.43%、59.78%和47.06%；對(duì)FOC4孢子萌發(fā)的抑制率分別為93.00%、78.87%、67.26%和54.71%；對(duì)CG02孢子萌發(fā)的抑制率分別為89.04%、73.52%、61.90%和45.90%（表1）。

2.3""LNL31對(duì)病原真菌孢子和菌絲的影響

通過(guò)普通顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CK的EV01孢子正常萌發(fā)（圖2A），而LNL31抑制了壞損外擔(dān)菌EV01的孢子萌發(fā)（圖2B）；通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CK的FOC4菌絲和孢子呈現(xiàn)平

滑和飽滿形態(tài)（圖2C，圖2D），而加入LNL31后引起FOC4菌絲扭曲、消解和斷裂，F(xiàn)OC4的孢子數(shù)量也急劇減少，細(xì)胞破裂（圖2E，圖2F）。

2.4""LNL31對(duì)茶餅病的防治效果

與CK相比，LNL31稀釋500倍處理（T3）與化學(xué)藥劑吡唑醚菌酯（T1）的防治效果相當(dāng)，噴施LNL31的茶樹(shù)葉片茶餅病病斑顯著減少（圖3），同時(shí)LNL31稀釋1000倍（T2）和500倍（T3）對(duì)茶餅病防效無(wú)顯著性差異，分別在第1次、2次藥后7"d調(diào)查，各處理均未發(fā)現(xiàn)藥害，說(shuō)明菌劑施用方法對(duì)茶樹(shù)安全。

第1次藥后7"d，LNL31"500倍液處理（T3）的防效達(dá)到86.11%，LNL31"1000倍液處理（T2）的防效為82.05%。第2次藥后7"d，防效較優(yōu)的處理仍為T(mén)3和T1，防效分別達(dá)91.98%和94.63%，茶餅病病斑生長(zhǎng)緩慢；其次為T(mén)2，防效為89.17%（表2）。

2.5""LNL31對(duì)茶樹(shù)的促生作用

由表3可知，噴施不同稀釋倍數(shù)的LNL31對(duì)茶樹(shù)植株的促生效果有一定差異，與CK相比，LNL31"500倍液處理的促生效果最為顯著，芽長(zhǎng)、芽密度、鮮重和SPAD均顯著提高，分別提高了36.17%、51.38%、40.00%和36.14%；LNL31稀釋1000倍噴施處理次之，上述指標(biāo)分別提高了23.14%、32.10%、27.66%和28.88%。

2.6""LNL31對(duì)茶葉內(nèi)生細(xì)菌群落的影響

2.6.1""多樣性指數(shù)""與CK比較，T1、T2和T3處理的物種豐度指標(biāo)Ace指數(shù)分別提高了13.20%、20.93%、107.68%，Chao1指數(shù)分別提高了13.09%、20.94%、107.74%；與CK比較，T3處理的多樣性指標(biāo)Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異，T1和T2處理的Simpson指數(shù)分別降低了2.40%、0.62%，Shannon指數(shù)降低了17.93%、7.86%，而T3處理的Shannon指數(shù)則提高了4.68%（表4）。

在OTU水平對(duì)不同處理葉片細(xì)菌群落進(jìn)行PCoA分析（圖4），其中PC1的貢獻(xiàn)率為28.60%，PC2的貢獻(xiàn)率為25.14%，二者累積貢獻(xiàn)率為53.74%。CK分別與T1、T2和T3處理間能明顯分開(kāi)，說(shuō)明相同處理樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較小，不同處理樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

2.6.2""目和屬水平上菌群結(jié)構(gòu)組成分析""目水平豐度相對(duì)含量（OTU數(shù)相對(duì)豐度前20）排名前5的細(xì)菌目中，根瘤菌目（Rhizobiales）、鞘氨醇單胞菌目（Sphingomonadales）為各處理的共有優(yōu)勢(shì)目，伯克氏目（Burkholderiales）為CK、T2和T3處理的共有優(yōu)勢(shì)目，鞘氨醇桿菌目（Sphingobacteriales）為T(mén)2和T3處理的優(yōu)勢(shì)目，微球菌目（Micrococcales）為T(mén)1和T3處理的優(yōu)勢(shì)目，擬桿菌目（Bacteroidales）和毛螺菌目（Lachnospirales）為CK的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)目，假單胞菌目（Pseudomonadales）和黃單胞菌目（Xanthomonadales）為T(mén)1處理的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)目；丙酸桿菌目（Propionibacteriales）為T(mén)2處理的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)目（圖5A）。

進(jìn)一步對(duì)各分組樣品在屬水平（OTU數(shù)相對(duì)豐度前20）的相對(duì)豐度進(jìn)行分析（圖5B），結(jié)果表明，不同處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，排名前5的細(xì)菌屬中，1174_901_12、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是各處理的共有優(yōu)勢(shì)屬，甲基細(xì)胞菌屬（Methylocella）為CK、T2和T3處理的共有優(yōu)勢(shì)菌屬；unclassified_Bacteria為CK的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)屬（2.51%）；寡氧單孢菌屬（Stenotrophomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為T(mén)1處理的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)屬（分別為13.31%和7.23%），拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia）為T(mén)2處理的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)屬（4.83%），根瘤菌屬（Rhizobium）為T(mén)3處理的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)屬（4.24%）。

2.6.3""差異物種分析""基于效應(yīng)大小線性判別分析（linear"discriminant"analysis"effect"size，"LEfSe）方法，分析了不同處理顯著性差異的標(biāo)志性物種（圖6A）。設(shè)置線性判別分析（linear"discri-minant"analysis，"LDA，"LDA≥4.0），共篩選出39個(gè)biomarkers（圖6B）。T1處理在目水平有黃色單胞菌目和假單胞菌目；科水平有黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、根瘤菌科（Rhizobiaceae）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae）；屬水平有寡氧單孢菌屬、假單胞菌屬、金色單胞菌屬（Aur eimonas）、短小桿菌屬（Curtobacterium）；有9類(lèi)物種顯著高于其他處理。T2處理在目水平有根瘤菌目、鞘脂單胞菌目、伯克氏目、腸桿菌目（Enterobacterales）；科水平有拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、鞘脂單胞菌科（Sphingom onadaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）、丙酸桿菌科（Propionibacteriaceae）、歐文菌科（Erwiniaceae）；屬水平有甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、拜葉林克氏菌屬、泛菌屬（Pantoea）、黏液桿菌屬（Mucilaginibacter），有14類(lèi)物種顯著高于其他處理；T3處理在目水平有鞘氨醇桿菌目、芽單胞菌目（Gemmatimonadales）、微球菌目；科水平有鞘氨醇桿菌科（Sphingobacteriaceae）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）和擬桿菌科（Microbacteriaceae）；屬水平有根瘤菌屬、芽單胞菌屬（Gemmatimonadaceae）、地桿菌屬（Pedobacter）；有9類(lèi)物種顯著高于其他處理。

2.6.4""物種豐度聚類(lèi)熱圖""在物種豐度聚類(lèi)熱圖中，橫向聚類(lèi)表明不同物種在T3與T2處理的枝長(zhǎng)較短，2個(gè)處理間豐度相似；T1與CK的枝長(zhǎng)較短，豐度相似?？v向聚類(lèi)顯示，T1處理的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)屬寡氧單孢菌屬和假單胞菌屬分別與鞘氨醇單胞菌屬和紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）的豐度相似；T2處理的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)屬拜葉林克氏菌屬與伯克霍爾德菌屬的豐度相似；T3處理的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)屬根瘤菌屬與1174_901_1的豐度相似（圖7）。

2.6.5""相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖""基于R語(yǔ)言繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（圖8），結(jié)果表明，芽孢桿菌屬與真桿菌屬、副擬桿菌屬呈正相關(guān)，與甲基桿菌屬、拜葉林克氏菌屬和藤黃色桿菌屬呈負(fù)相關(guān)。

2.6.6""內(nèi)生細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)""基于Bugbase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)葉片內(nèi)生細(xì)菌表型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，共檢測(cè)到9種微生物表型（圖9）。與CK相比，T1處理的好氧菌（aerobic）、生物膜形成（forms"biofilms）、可移動(dòng)元件（contains"mobile"elements）、壓力耐受（stress"tolerant）、潛在致病菌（potentially"pathogenic）、革蘭氏陰性菌（Gram"negative"bacteria）的豐度增幅較大，達(dá)到0.47%～29.01%；T2處理的生物膜形成、壓力耐受、革蘭氏陰性菌、好氧菌、可移動(dòng)元件、兼性厭氧菌（facultative"anaerobic"bacteria）、潛在致病菌的豐度增幅較大，達(dá)到8.61%～24.79%；T3處理的好氧菌、生物膜形成、革蘭氏陰性菌、耐受壓力、可移動(dòng)元件、兼性厭氧菌的豐度增幅達(dá)到3.24%～14.78%，潛在致病菌下降5.70%。

3""討論

目前針對(duì)田間茶餅病防治的藥劑以化學(xué)藥劑吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑等為主[4-5]，防效達(dá)80.80%，生防藥劑為植物源提取物補(bǔ)骨脂乙素的防效達(dá)61.72%[28]，申嗪霉素和多抗霉素的防效達(dá)78.16%和68.17%[4]。而以活菌為有效成分的生物制劑防治茶餅病的報(bào)道較少。芽孢桿菌、放線菌等對(duì)茶餅病菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用[8]，本研究中LNL31對(duì)5種病原菌壞損外擔(dān)菌、膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌、地毯草黃單胞桿菌、大腸桿菌菌絲的抑制作用明顯，對(duì)病原真菌的孢子萌發(fā)抑制率達(dá)89.04%～93.00%，推測(cè)LNL31中的功能菌株具有良好分泌拮抗物質(zhì)能力。

巨大芽孢桿菌L2可濕性粉劑對(duì)茶餅病的田間防效達(dá)49.01%，增產(chǎn)達(dá)19.02%[9]。本研究的田間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LNL31的田間防效達(dá)91.98%，茶樹(shù)葉茶餅病病斑生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明該制劑能有效抑制茶餅病菌絲生長(zhǎng)。生防菌的田間功效取決于定殖能力，影響其定殖的因子包括施用方式、田間圓圈代表物種，圓圈大小代表物種平均豐度大??；線條代表兩物種間相關(guān)，線條粗細(xì)代表相關(guān)性強(qiáng)弱，紅色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)。

環(huán)境因子（如光照、溫濕度、植物表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)和其他微生物等多種因素）[24]。本研究中，LNL31的500倍、1000倍液對(duì)茶樹(shù)芽長(zhǎng)、芽密度、鮮重和葉綠素的促生作用分別為23.14%～36.17%、32.10%～51.38%、27.66%～40.00%和28.88%～"36.14%，由此推斷該菌劑施用于茶樹(shù)葉后，菌劑中的功能菌株芽孢桿菌利用葉部營(yíng)養(yǎng)和濕度等適宜的理化因子，分泌了促生物質(zhì)。

內(nèi)生菌對(duì)植物的生長(zhǎng)和健康至關(guān)重要。鞘氨醇單胞菌屬、根瘤菌屬、摩根氏菌屬（Morganella）和甲基桿菌屬是茶樹(shù)的常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌[29]。CAO等[30]研究發(fā)現(xiàn)茶餅病發(fā)病植株的葉內(nèi)生細(xì)菌豐度和多樣性均低于健康植株。本研究也發(fā)現(xiàn)噴施以解淀粉芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌為功能菌株的LNL31后，茶樹(shù)葉片內(nèi)生細(xì)菌中的芽孢桿菌屬并不是排名前20的優(yōu)勢(shì)屬，內(nèi)生細(xì)菌群落的豐富度和均勻度增加，葉內(nèi)細(xì)菌群落有顯著影響；甲基桿菌屬、1174_901_12、鞘氨醇單胞菌屬和根瘤菌屬等是優(yōu)勢(shì)屬，從而提高了指示菌群數(shù)量，優(yōu)勢(shì)屬拜葉林克氏菌屬與伯克霍爾德菌屬度相似，根瘤菌屬與1174_901_12豐度相似，由此推斷微生物菌劑中的芽孢桿菌菌體主要在茶樹(shù)葉部表面定殖后，分泌拮抗和促生等活性物質(zhì)傳導(dǎo)至葉內(nèi)，抑制茶餅病的發(fā)生，改善葉內(nèi)細(xì)菌群落豐度和多樣性。

Bugbase主要進(jìn)行細(xì)菌的表型預(yù)測(cè)，通過(guò)表型情況預(yù)測(cè)微生物群落生態(tài)功能[14]。YANG等[31]研究發(fā)現(xiàn)施用多粘類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus"polymyxa）KN-03菌株能降低柑橘黃龍病病菌含量，同時(shí)提高移動(dòng)元件、生物膜形成、耐受壓力等類(lèi)群的相對(duì)豐度。本研究通過(guò)Bugbase功能預(yù)測(cè)得知，在噴施微生物菌劑LNL31"500倍液處理的好氧菌、生物膜形成、革蘭氏陰性菌、耐受壓力、可移動(dòng)元件、兼性厭氧菌增幅較大，潛在致病菌下降。需要注意的是在噴施化學(xué)藥劑25%吡唑醚菌酯1000倍液和微生物菌劑LNL31"1000倍液處理的潛在致病菌數(shù)量增加，這些變化對(duì)茶樹(shù)健康的影響尚不清楚，需進(jìn)一步研究。今后應(yīng)進(jìn)一步探索其生防機(jī)理，發(fā)掘具有較強(qiáng)抗茶餅病作用的有益微生物，使其在茶餅病綠色防控領(lǐng)域發(fā)揮更好的作用。

茶餅病一般在高濕、低溫的環(huán)境條件下發(fā)生，29"℃是適宜茶餅病發(fā)生的上限[4]，可酌情減少藥劑用量。本研究的田間試驗(yàn)說(shuō)明施用LNL31的時(shí)機(jī)應(yīng)在茶餅病發(fā)病前或早期，施藥次數(shù)以2～3次為宜，間隔2～3"d。根據(jù)微生物制劑特性和植株發(fā)病特點(diǎn)，應(yīng)均勻噴施，同時(shí)避免在烈日下施用，應(yīng)選擇在傍晚或陰天施用。

本研究發(fā)現(xiàn)LNL31能抑制多種病原菌，田間施用LNL31對(duì)茶餅病防效明顯，同時(shí)對(duì)茶樹(shù)促生作用顯著，因此，LNL31具有良好的應(yīng)用前景，可改善茶葉內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為茶餅病的生物防治提供科學(xué)依據(jù)。而對(duì)茶樹(shù)的防病促生機(jī)制有待深入研究。

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