摘要：為了篩選基因分析中黃纓菊（Xanthopappus subacaulis）穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究以冷、鹽和干旱脅迫下黃纓菊的根、莖和葉為材料，依據(jù)三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選取8個(gè)常用內(nèi)參基因（18S rRNA，GAPDH，PAL，UBQ，TIP，RPS，SAND，TUA）作為候選基因，利用qRT-PCR技術(shù)并結(jié)合geNorm，NormFinder，BestKeeper和RefFinder軟件綜合評(píng)價(jià)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，冷脅迫下黃纓菊根、莖、葉中最佳穩(wěn)定性的內(nèi)參基因分別為SAND，TIP和GAPDH；干旱脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是SAND，TUA和UBQ；鹽脅迫下穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因分別為RPS，RPS和SAND。此外，分別以干旱脅迫處理下黃纓菊根、莖、葉中2個(gè)穩(wěn)定性最佳和1個(gè)穩(wěn)定性最差的基因作為內(nèi)參基因，衡量耐逆基因WRKY表達(dá)量的準(zhǔn)確性，表明不同脅迫下篩選出的黃纓菊不同組織中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性結(jié)果均是可靠的。研究結(jié)果為今后黃纓菊耐逆基因的表達(dá)分析提供了基因資源和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃纓菊；內(nèi)參基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；非生物脅迫；表達(dá)穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：Q344+.13""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）07-2028-11

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.004

引用格式：

余明君， 蘇丹丹， 蘇" 旭，等.非生物脅迫下黃纓菊實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選與驗(yàn)證［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（7）：2028-2038

YU Ming-jun， SU Dan-dan， SU Xu，et al.Screening and Validation of Reference Genes for Xanthopappus subacaulis by Real-time Quantitative PCR under Abiotic Stress［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2028-2038

收稿日期：2023-11-24；修回日期：2024-03-26

基金項(xiàng)目：第二次青藏高原綜合科學(xué)考察研究項(xiàng)目（2019QZKK0502）；青海理工大學(xué)（籌）“昆侖英才”人才引進(jìn)科研項(xiàng)目（2023-QLGKLYCZX-012）資助

作者簡(jiǎn)介：

余明君（2001-），女，漢族，山西朔州人，碩士研究生，主要從事高山植物遺傳多樣性與分子進(jìn)化研究，E-mail：15234934641@139.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：lyp8527970@126.com

Screening and Validation of Reference Genes for Xanthopappus subacaulis

by Real-time Quantitative PCR under Abiotic Stress

YU Ming-jun1，2， SU Dan-dan1，2， SU Xu1，2，3， CHEN Jin-yuan1，2，

LIU Yu-ping1，2*， ZHANG Yu1，2， LIU Tao4， YANG Qian1，2， NIU Fu-ying1

（1. School of Life Sciences， Qinghai Normal University， Xining， Qinghai Province 810008， China; 2. Key Laboratory of

Biodiversity Formation Mechanism and Comprehensive Utilization of the Qinghai-Tibet Plateau in Qinghai Province， Qinghai

Normal University， Xining， Qinghai Province 810008， China; 3. Academy of Plateau Science and Sustainability， Qinghai Normal

University， Xining， Qinghai Province 810016， China; 4. School of Ecology and Environmental Science， Qinghai University of

Science and Technology， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：To screen the steadily expressed reference genes in the gene analysis，we analyzed the reference genes that were stable expression in Xanthopappus subacaulis. We used the root，stem and leaf of Xanthopappus subacaulis as experimental materials under different abiotic stressed，and screened eight candidate internal reference genes based on the full-length transcript sequencing. Meanwhile，we utilized qRT-PCR technology and combined geNorm，NormFinder，BestKeeper，and RefFinder software to comprehensively evaluate the expression stability of candidate reference genes. The results showed that SAND，TIP and GAPDH were the most stable reference genes in root，stem and leaf of X. subacaulis under cold stress，respectively. SAND，TUA and UBQ were the most stable in roots，stems and leaves under drought stress，respectively. RPS，RPS and SAND were the most stable in roots，stems and leaves under salt stress. In addition，we chose two genes with the best stability and one gene with the worst stability in the roots，stems and leaves as internal reference genes under drought treatment to evaluate the accuracy of expression level of the stress-tolerant gene WRKY，the results indicated that the stability of internal reference genes in different tissues of X. subacaulis were reliable under different stresses. The study provides the gene resources and theoretical basis for the expression analysis of stress-tolerant genes of X. subacaulis in the future.

Key words：Xanthopappus subacaulis;Reference gene;qRT-PCR;Abiotic stress;Expression stability

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是一種用來(lái)定量mRNA表達(dá)水平的方法，其將優(yōu)化后的熒光染料加入到qRT-PCR反應(yīng)體系中，與核酸分子結(jié)合發(fā)出熒光信號(hào)，利用熒光信號(hào)強(qiáng)弱監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)過(guò)程［1］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR因具有檢測(cè)速度快、高效、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于植物基因的表達(dá)分析［2-5］。qRT-PCR能夠快速檢測(cè)特定基因的表達(dá)變化，尤其可同時(shí)對(duì)兩個(gè)不同目的基因的產(chǎn)量、反轉(zhuǎn)錄效率等進(jìn)行差異比較，從而獲得目的基因的表達(dá)差異，因而被認(rèn)為是直接檢測(cè)mRNA豐度最有效的方法［6］。同時(shí)，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因的表達(dá)模式時(shí)，通常必須先選擇一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化［7］。內(nèi)參基因（reference genes）即管家基因，是一類能在不同物種的所有細(xì)胞中均能穩(wěn)定表達(dá)的基因，常被用作基因表達(dá)的參照物［1］。然而，內(nèi)參基因的表達(dá)量因物種、組織、細(xì)胞、發(fā)育階段或逆境脅迫的改變而改變，有時(shí)表達(dá)偏差高達(dá)百倍，因而檢測(cè)某一基因的表達(dá)量時(shí)，若盲目將先前報(bào)道的管家基因作為內(nèi)參基因，可能檢測(cè)不到目的基因表達(dá)的微小變化，甚至可能錯(cuò)誤或得到相反的結(jié)論［8］。因此，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)RT-PCR檢測(cè)目的基因的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

黃纓菊（Xanthopappus subacaulis）是青藏高原東部地區(qū)一種特有的多年生草本植物，隸屬于菊科（Asteraceae）、黃纓菊屬（Xanthopappus），通常生長(zhǎng)于海拔2 230～4 150 m的干旱草甸、草原及干燥山坡，主要分布在我國(guó)云南西北部、四川北部與西部、青海西部以及甘肅東南部［9-11］。黃纓菊具有較強(qiáng)的耐寒、耐旱及耐鹽堿等特性，對(duì)維持青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用［12］；同時(shí)，黃纓菊全草入藥，對(duì)吐血、子宮出血、食物中毒及過(guò)敏性紫癜療效顯著，具有較高的藥用價(jià)值［13］。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)黃纓菊的研究主要集中于化學(xué)成分［14］、藥理活性［13］、耐逆生理［12］及群體動(dòng)態(tài)歷史［15-17］等領(lǐng)域，然而對(duì)其耐逆基因表達(dá)的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此，篩選黃纓菊內(nèi)參基因以及耐逆基因的表達(dá)研究十分重要。據(jù)此，本研究基于黃纓菊三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取8個(gè)常用的內(nèi)參基因，包括18S核糖體RNA基因（18S ribosome RNA，18S rRNA）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、苯丙氨酸解氨酶基因（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、多聚泛素酶基因（polyubiquitin，UBQ）、液泡膜內(nèi)在水通道蛋白基因（tissue-preferentially expressed，TIP）、核糖體蛋白基因（ribosomal proteins，RPS）、SAND家族蛋白基因（SAND family protein，SAND）和α微管蛋白基因（α-tubulin，TUA）作為候選內(nèi)參基因，利用qRT-PCR技術(shù)并結(jié)合geNorm，NormFinder，BestKeeper軟件和在線工具RefFinder（https：//www.heartcure.com.au/reffinder/），分別對(duì)非生物脅迫下黃纓菊根、莖和葉中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，旨在為黃纓菊耐逆基因的表達(dá)分析提供理論參考。

1" 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)材料

黃纓菊成熟種子采自青海省共和縣（36°29′25.14″N，100°47′38.64″E，海拔3 202 m），低溫冷藏30 d后，挑選無(wú)蟲(chóng)害、籽粒飽滿的種子，用10%的次氯酸鈉浸泡消毒30 min，蒸餾水沖洗干凈后置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，待長(zhǎng)出兩片子葉后將幼苗種植于營(yíng)養(yǎng)土與蛭石2∶1混勻填充的花盆中，隨后將其置于26℃、相對(duì)濕度為60%的培養(yǎng)箱中培育。根據(jù)項(xiàng)目組前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究均采用生長(zhǎng)60 d長(zhǎng)勢(shì)一致的黃纓菊幼苗進(jìn)行非生物脅迫處理，即4℃培養(yǎng)箱內(nèi)冷脅迫，200 mL的20% PEG-6000高滲溶液澆灌幼苗模擬干旱脅迫，200 mL的200 mmol·L-1 NaCl溶液澆灌幼苗進(jìn)行鹽脅迫；脅迫處理0，3，6，12，24，48 h后，剪取黃纓菊不同組織（根、莖、葉）的樣品，每個(gè)組織分別取3份樣品置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱備用。

1.2" RNA提取及cDNA合成

稱取黃纓菊不同處理組的根、莖和葉各約100 mg，置于研缽中加入液氮將其研磨成粉末后，利用TaKaRa試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）進(jìn)行RNA提取，提取的RNA用NanoDrop One和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度和完整性，A260/A280值在1.8～2.1之間。吸取檢測(cè)合格的1 μg RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit）合成cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3" 候選內(nèi)參基因選擇和引物設(shè)計(jì)

基于黃纓菊的三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挑選8條候選內(nèi)參基因序列（18S rRNA，GAPDH，PAL，UBQ，TIP，RPS，SAND，TUA），根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)黃纓菊的內(nèi)參基因引物，要求退火溫度介于55～61℃之間、引物長(zhǎng)度為18～25 bp、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100～300 bp；同時(shí)，利用Primer-BLAST（http：//ncbi.nlm.nih.gov./tools/primer-BLAST）對(duì)引物序列特異性進(jìn)行分析。引物序列送至北京六合華大基因科技有限公司合成（表1）。

1.4" 引物特異性驗(yàn)證及qRT-PCR反應(yīng)

合成引物利用PCR進(jìn)行特異性分析，PCR反應(yīng)體系為25 μL：2.5 μL緩沖液，2 μL dNTPs（dATP，dCTP，dGTP和dTTP混合物），待測(cè)cDNA樣品2 μL，正反引物各1 μL（10 μmol·L-1），16.25 μL雙蒸水，0.25 μL Taq PCR Master Mix；擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量和引物特異性。

qRT-PCR分析儀器為QuantStudioTM6，熒光試劑采購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司的TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）。冰上配制反應(yīng)體系為20 μL：TB Green 10 μL，ROX 0.4 μL，正反引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，模板cDNA（100 ng·μL-1）2 μL，ddH2O 6.8 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變形30 s，95℃變形5 s，58℃退火34 s，42個(gè)循環(huán)。引物擴(kuò)增效率分析時(shí)，將上述cDNA（100 ng·μL-1）經(jīng)5倍梯度稀釋（5-1，5-2，5-3，5-4，5-5）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。此外，QuantStudioTM6自動(dòng)獲取各內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率（E）和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.5" 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用QuantStudioTM6實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析軟件直接獲取各內(nèi)參基因的Ct值；采用Microsoft Excel 2016將各樣品的Ct值整理，計(jì)算平均Ct值；運(yùn)用geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件和RefFinder在線工具分析各內(nèi)參基因不同脅迫下的穩(wěn)定性。其中，geNorm和NormFinder軟件以2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（△Ct=Ctmax-Ctmin），BestKeeper軟件和RefFinder在線工具以樣品的原始Ct值分析數(shù)據(jù)。geNorm軟件通過(guò)各樣品Ct值計(jì)算8個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值（M）和配對(duì)變異值（Vn/n+1），M值越小，內(nèi)參基因越穩(wěn)定，當(dāng)Vn/n+1lt;0.15時(shí)，最適內(nèi)參基因的組合為n個(gè)［18-19］；NormFinder軟件也是通過(guò)Ct值計(jì)算內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值，表達(dá)穩(wěn)定值越小，內(nèi)參基因越穩(wěn)定［20］；BestKeeper軟件利用Ct值計(jì)算各內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差值（SD）和變異系數(shù)（SV），SD±SV值越小，基因越穩(wěn)定［21］；RefFinder在線工具將geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件得到的內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行綜合排序，計(jì)算幾何平均值，幾何平均值越小，內(nèi)參基因越穩(wěn)定［22］。

1.6" 內(nèi)參基因的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證篩選出的所有內(nèi)參基因的可靠性，本研究利用qRT-PCR技術(shù)并根據(jù)RefFinder綜合分析得到的2個(gè)穩(wěn)定性最佳和1個(gè)穩(wěn)定性最差的內(nèi)參基因，對(duì)干旱脅迫下黃纓菊耐逆基因WRKY的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證。qRT-PCR擴(kuò)增中，WRKY基因所用的引物為：上游引物5′-TCATTCTTCTTCGCTCCTCT-3′，下游引物5′-CTCTTACGGCTCTACTTCCAG-3′。反應(yīng)體系和程序同1.4，利用2-△△Ct法計(jì)算WRKY基因的相對(duì)表達(dá)量。

2" 結(jié)果與分析

2.1" RNA質(zhì)量、內(nèi)參基因特異性驗(yàn)證及擴(kuò)增效率分析

采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，結(jié)果顯示黃纓菊的總RNA濃度為140～400 ng·μL-1，A260/A280值介于1.89～2.12之間；瓊脂糖凝膠電泳表明18S和28S亞基條帶清晰，無(wú)明顯降解，說(shuō)明獲得的RNA純度和質(zhì)量較好，完全能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求（圖1）；qRT-PCR分析結(jié)果顯示，8個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增產(chǎn)物均為單峰，表明內(nèi)參基因引物特異性高，無(wú)引物二聚體（圖2）。此外，每對(duì)內(nèi)參基因引物的相關(guān)系數(shù)（R2）為0.978～0.999，擴(kuò)增效率（E）介于92.643%～102.906%之間（表2），表明引物擴(kuò)增效率良好，符合qRT-PCR分析要求。

2.2" 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析

通過(guò)對(duì)8個(gè)候選內(nèi)參基因qRT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)不同候選內(nèi)參基因樣品的循環(huán)閾值Ct值，本研究繪制了Ct值分布箱線圖，所有候選內(nèi)參基因的Ct值變化范圍為17.164～39.525，說(shuō)明黃纓菊不同內(nèi)參基因的表達(dá)水平存在差異（圖3）。其中，UBQ的Ct值最低，處于17.164～36.987之間；RPS的Ct值最高，介于22.132～39.525之間；各基因的表達(dá)豐度由高到低依次為UBQgt;PALgt;GAPDHgt;TUAgt;18S rRNAgt;TIPgt;SANDgt;RPS（圖3）。

2.3" 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1" geNorm軟件分析" 本研究利用geNorm軟件分析了黃纓菊不同脅迫下內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值（M），結(jié)果顯示冷脅迫處理下黃纓菊根、莖、葉中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因分別是SAND與18S rRNA、SAND與18S rRNA，TIP與GAPDH；干旱脅迫下分別為TIP與18S rRNA，TIP與TUA，UBQ與TIP；鹽脅迫下分別為TUA與RPS，TUA與SAND，SAND與TIP（圖4）。此外，干旱脅迫下黃纓菊根、莖和葉中V2/3均小于0.15，表明TIP與18S rRNA，TIP與TUA，TIP與UBQ三套內(nèi)參基因均分別能夠足以滿足黃纓菊qRT-PCR定量分析結(jié)果的可靠性，因而上述三套內(nèi)參基因分別可以作為干旱脅迫下黃纓菊根、莖和葉的內(nèi)參基因組合（圖5）。冷脅迫和鹽脅迫處理下篩選出的內(nèi)參基因也能夠作為黃纓菊根、莖、葉中的內(nèi)參基因組合。

2.3.2" NormFinder軟件分析" 利用NormFinder軟件，本研究分析了黃纓菊8個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)冷脅迫下根、莖、葉中穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因分別為RPS（0.359）、TIP（0.738）和GAPDH（0.198），干旱脅迫下分別為SAND（0.164）、TUA（0.100）和UBQ（0.279），而鹽脅迫下分別是RPS（0.373）、RPS（0.382）和18S rRNA（0.420）（圖6）。

2.3.3" BestKeeper軟件分析" 本研究利用BestKeeper軟件計(jì)算了內(nèi)參基因Ct值間配對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV），結(jié)果表明冷脅迫下黃纓菊根、莖、葉中穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因分別是TIP（7.88±1.96）、RPS（3.47±0.89）和TUA（4.08±1.04），干旱脅迫下分別為18S rRNA（4.02±1.03）、RPS（3.47±0.89）和SAND（1.92±0.52），鹽脅迫下分別是18S rRNA（5.13±1.32）、RPS（5.18±1.31）和SAND（4.19±1.12）（表3）。

2.3.4" RefFinder分析" 為了獲得更加合理的內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序，本研究采用在線工具RefFinder對(duì)上述三種軟件（geNorm、NormFinder、BestKeeper）得到的結(jié)果進(jìn)行綜合排序，發(fā)現(xiàn)冷脅迫下黃纓菊根、莖、葉中內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名前三的分別為SAND，RPS和18S rRNA，TIP，TUA和SAND，GAPDH，TIP和TUA；干旱脅迫下分別是SAND，18S rRNA和TIP，TUA，TIP和UBQ，UBQ，TIP和SAND；鹽脅迫下分別為RPS，TUA和TIP，RPS，SAND和TUA及SAND，TIP和18S rRNA（圖7）。

2.4" 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的內(nèi)參基因穩(wěn)定性，本研究以干旱脅迫下黃纓菊根中穩(wěn)定性最佳的內(nèi)參基因SAND、18S rRNA和穩(wěn)定性最差的內(nèi)參基因PAL，莖中穩(wěn)定性最優(yōu)的內(nèi)參基因TUA、TIP和穩(wěn)定性最差的內(nèi)參基因SAND，葉中穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因UBQ、TIP和穩(wěn)定性最差的內(nèi)參基因PAL，來(lái)評(píng)估耐旱目的基因WRKY的表達(dá)模式。結(jié)果表明，以根中穩(wěn)定性最佳的SAND和18S rRNA作為內(nèi)參基因時(shí)，干旱脅迫處理0～3 h時(shí)WRKY基因的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的增加而增加，3～12 h時(shí)表達(dá)量呈降低趨勢(shì)，12～48 h時(shí)表達(dá)量則先升高后降低，而以根中穩(wěn)定性較差的PAL為內(nèi)參基因時(shí)，0～3 h時(shí)WRKY基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，3～12 h時(shí)表達(dá)量先升高后降低，12～48 h時(shí)表達(dá)量則緩慢上升（圖8A）；當(dāng)以莖中穩(wěn)定性最優(yōu)的TUA和TIP為內(nèi)參基因時(shí)，干旱脅迫處理0～3 h時(shí)WRKY基因的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，以莖中穩(wěn)定性最差的SAND為內(nèi)參基因時(shí)，WRKY基因的表達(dá)量則呈下降趨勢(shì)（圖8B）；同樣，當(dāng)選取黃纓菊葉中最優(yōu)內(nèi)參基因UBQ和TIP為參照時(shí)，WRKY基因的表達(dá)量變化較為穩(wěn)定，而以最差內(nèi)參基因PAL為參照時(shí)，其表達(dá)量變化較為明顯（圖8C）。因此，不同脅迫下篩選出的黃纓菊不同組織中內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序相對(duì)準(zhǔn)確和可靠。

3" 討論

3.1" 內(nèi)參基因在不同植物器官和處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性有差異

內(nèi)參基因通常是維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)的管家基因，所有細(xì)胞中均能穩(wěn)定表達(dá)［23-25］。然而，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性往往是相對(duì)的，即不同植物組織和不同處理?xiàng)l件下其穩(wěn)定性均有差異。譬如，王浩等［26］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選何首烏（Pleuropterus multiflorus）不同組織中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAPDH基因表達(dá)穩(wěn)定性最佳，SAND基因表達(dá)穩(wěn)定性最差；韓曉雪等［27］通過(guò)對(duì)非生物脅迫下番茄（Solanum lycopersicum）內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)番茄莖中SAND基因的表達(dá)最穩(wěn)定，而根和葉中穩(wěn)定性較差；趙曉冰等［28］利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過(guò)對(duì)華細(xì)辛（Asarum sieboldii）6個(gè)常用內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的研究，結(jié)果表明葉中SAND基因具有最差的表達(dá)穩(wěn)定性，而根中SAND基因的表達(dá)穩(wěn)定性較好。以上研究均表明SAND基因具有明顯的物種和組織特異性［26-28］。本研究結(jié)果顯示，冷脅迫和干旱脅迫下黃纓菊根中SAND基因的表達(dá)穩(wěn)定性最佳，而葉和莖中表達(dá)穩(wěn)定性較差，這進(jìn)一步驗(yàn)證了先前研究結(jié)果的正確性和合理性［26-28］。UBQ基因是一種多效的分子信號(hào)，通過(guò)靶蛋白泛素化修飾參與細(xì)胞內(nèi)各種生物過(guò)程調(diào)控，在不同器官和組織中均能穩(wěn)定表達(dá)［29-30］。例如，Bevitori等［31］研究發(fā)現(xiàn)UBQ5基因是水稻（Oryza sativa）接種稻瘟菌后表達(dá)穩(wěn)定的基因；李蘇濤等［32］通過(guò)評(píng)價(jià)巨菌草（Pennisetum giganteum）內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下根中UBQ基因的表達(dá)最穩(wěn)定；代資舉等［33］通過(guò)分析玉米（Zea mays）粗縮病誘導(dǎo)下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)UBQ基因是玉米粗縮病誘導(dǎo)下表達(dá)最穩(wěn)定的基因。本研究結(jié)果同樣表明，干旱脅迫下黃纓菊根和莖中內(nèi)參基因UBQ的表達(dá)穩(wěn)定性較好，而冷脅迫和鹽脅迫下穩(wěn)定性較差，認(rèn)為內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性因植物組織和處理?xiàng)l件的不同而不同，因此篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因理應(yīng)是分析目的基因表達(dá)模式的前提和基礎(chǔ)。

3.2" 軟件評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合能得到可靠結(jié)果

geNorm、NormFinder和BestKeeper是評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性最常用的三種軟件。其中，geNorm軟件通過(guò)分析比較不同樣本中內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)值M，確定最合適的內(nèi)參基因［18］；NormFinder軟件與geNorm軟件運(yùn)行原理相似，結(jié)合組內(nèi)與組間方差計(jì)算內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值，但NormFinder軟件只能選擇一個(gè)基因?yàn)榉€(wěn)定內(nèi)參基因，不能確定合適的內(nèi)參基因組合［19］；BestKeeper軟件通過(guò)對(duì)每個(gè)內(nèi)參基因所有樣本的Ct值進(jìn)行相關(guān)分析，利用獲得的變異系數(shù)（CV）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）綜合評(píng)判內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，但其僅能分析3～10個(gè)內(nèi)參基因［20］。然而，三種軟件因計(jì)算原則存在差異，故采用它們分別對(duì)同一樣本分析時(shí)可能獲得不同的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)參基因SAND和TUA是geNorm和NormFinder軟件篩選出的冷脅迫根和干旱脅迫莖中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而采用BestKeeper軟件分析其表達(dá)穩(wěn)定性時(shí)排名則為第4和第6；同樣，鹽脅迫下黃纓菊根中18S rRNA基因在BestKeeper軟件中表達(dá)穩(wěn)定性的排名第1，而在geNorm和NormFinder軟件中排名均為第7。因此，geNorm和NormFinder軟件對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)結(jié)果較為接近，而其與BestKeeper軟件獲得的結(jié)果差異明顯，這與徐圓圓等［34-36］的研究結(jié)論基本相似。為了獲得3種軟件對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序結(jié)果的準(zhǔn)確評(píng)判，本研究還利用RefFinder在線工具對(duì)geNorm、NormFinder和BestKeeper的穩(wěn)定性排序進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明冷脅迫和干旱脅迫根中內(nèi)參基因SAND的穩(wěn)定性最佳，冷脅迫莖和鹽脅迫葉中TIP基因最穩(wěn)定。然而，采用分析軟件篩選出的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因并不能完全確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，還需要利用目的基因?qū)ζ淇煽啃赃M(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，旨在獲得更為可靠的研究結(jié)果［37-38］。據(jù)此，本研究選取RefFinder軟件篩選出的干旱脅迫黃纓菊根、莖、葉中穩(wěn)定性最佳的內(nèi)參基因（SAND和18S rRNA、TUA和TIP、UBQ和TIP）以及最差的內(nèi)參基因（PAL、SAND、PAL）為參照，分析黃纓菊耐旱基因WRKY的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)選取穩(wěn)定性最優(yōu)內(nèi)參基因?yàn)閰⒄諘r(shí)，WRKY基因的表達(dá)量變化較為穩(wěn)定，而以最差內(nèi)參基因?yàn)閰⒄諘r(shí)，其表達(dá)量變化較為明顯。因此，在評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性時(shí)須將軟件評(píng)估結(jié)果與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合，旨在確保篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參基因的可靠性。

4" 結(jié)論

非生物脅迫下，黃纓菊篩選出的候選內(nèi)參基因Ct值的變化范圍是17.164～39.525；冷脅迫下黃纓菊根、莖、葉中穩(wěn)定性最優(yōu)的內(nèi)參基因分別是SAND，TIP和GAPDH，干旱脅迫下穩(wěn)定性最佳的內(nèi)參基因分別為SAND，TUA和UBQ，鹽脅迫下穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因依次為RPS，RPS和SAND；內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)以黃纓菊根根、莖、葉中篩選出的穩(wěn)定性最佳的基因?yàn)閰⒄諘r(shí)，耐逆基因WRKY的表達(dá)量變化較為穩(wěn)定，而以穩(wěn)定性最差的基因?yàn)閰⒄諘r(shí)，WRKY基因的表達(dá)量變化上下浮動(dòng)變化較大。因此，不同脅迫下篩選出的黃纓菊不同組織中內(nèi)參基因穩(wěn)定性的排序較為準(zhǔn)確和可靠。

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（責(zé)任編輯" 彭露茜）