關(guān)鍵詞平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑；含量測(cè)定；指紋圖譜；量值傳遞；質(zhì)量控制；高效液相色譜法

“上火”的概念源于中醫(yī)學(xué)對(duì)人體和疾病的認(rèn)識(shí)，其基本病機(jī)為陰陽失衡，火熱上炎于頭面；其臨床表現(xiàn)主要以口舌生瘡、口腔潰瘍、牙齦及咽喉腫痛、眼睛紅腫等頭面部癥狀為主?！吧匣稹钡臐撛跈C(jī)制比較復(fù)雜，與人們飲食習(xí)慣、作息時(shí)間、不良情緒等多種因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，假如“上火”的癥狀一直存在，就有可能引發(fā)心血管疾病[1]、膽管疾病[2]、抑郁癥[3]。

平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑為國(guó)醫(yī)大師張磊應(yīng)用多年的臨床驗(yàn)方，由梔子、菊花、白茅根、山楂、甘草5味中藥組成。方中梔子為君藥，清上中下三焦之火，具有涼血、清熱、生津、利尿通淋的功效[4]；菊花和白茅根相須為用，共為臣藥，其中菊花清上焦之火，具有清肝明目、清熱解毒、消腫的功效[5]，白茅根清下焦之火，具有瀉火除煩、清熱解毒、利尿、涼血的功效[6]；山楂為佐藥，清中焦之火，具有消食健胃、消導(dǎo)下行、行氣散瘀的功效[7]；甘草為使藥，可以調(diào)和諸藥[8]。諸藥合用，可以清上中下三焦之火，用于治療頭昏、心煩、睡眠欠佳和小便黃赤等癥。中藥復(fù)方的質(zhì)量控制是保證患者用藥安全、有效的基礎(chǔ)[9]，但目前尚未見關(guān)于平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑整體質(zhì)量控制的研究?；诖耍狙芯客ㄟ^制備15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑并建立其指紋圖譜，對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)、化學(xué)模式識(shí)別、峰歸屬分析、出膏率測(cè)定、飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞等質(zhì)量控制研究，以期為其臨床合理使用和后續(xù)平火茶的制劑研究提供理論參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括2695-2998型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Waters公司），ME204E型萬分之一分析天平、AB135-S型十萬分之一分析天平（瑞士MettlerToledo公司），KQ-700DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），HH-S6型電子恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），ST-10N-60A型冷凍干燥機(jī)（山東三體儀器有限公司）。

1.2 主要試劑

梔子苷對(duì)照品（批號(hào)220916，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；綠原酸（批號(hào)MUST-18030620，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.39%）、新綠原酸（批號(hào)AFBH2301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、異綠原酸A（批號(hào)AFCE0656，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、木犀草素（批號(hào)AFCE0510，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、甘草苷（批號(hào)AFBI0102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、甘草酸（批號(hào)AFCB0903，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、木犀草苷（批號(hào)AFBI0506，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、山柰酚（批號(hào)MUST-18091810，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.3%）對(duì)照品均購(gòu)自曼斯特（成都）生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；磷酸（色譜純）購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材

平火茶中梔子、菊花、白茅根、山楂、甘草5味飲片均購(gòu)自安徽三義堂中藥飲片有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定教研中心陳隨清教授鑒定均為真品。飲片具體信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

使用隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)表1中不同產(chǎn)地的組方飲片進(jìn)行組合，樣品組合信息見表2。參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[10]，取菊花10g、梔子15g、白茅根30g、山楂15g、甘草6g，一煎加7倍量水，浸泡30min，煎30min，趁熱以150目濾布濾過；二煎加6倍量水，煎20min，趁熱過濾；合并2次濾液，濃縮至500mL，真空冷凍干燥，即得15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。同時(shí)，按上述工藝分別制備缺梔子、缺菊花、缺白茅根、缺甘草、缺山楂的陰性凍干粉和各單味飲片凍干粉。

2.2 平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 供試品溶液的制備

取平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱定質(zhì)量；超聲處理（功率300W，頻率40kHz）40min，放冷，再稱定質(zhì)量；用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.22μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、梔子苷、木犀草素、甘草苷、甘草酸、木犀草苷、山柰酚對(duì)照品各適量，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.4453、0.5292、0.6076、0.2450、0.4214、0.1078、0.1862、0.08085、0.3476mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 單味飲片及陰性樣品溶液的制備

分別取梔子、菊花、白茅根、山楂和甘草飲片凍干粉約0.25g，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備各單味飲片供試品溶液；同法制備各飲片的陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件

色譜柱為VenusilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～16min，5%A→9%A；16～32min，9%A→18%A；32～63min，18%A；63～68min，18%A→28%A；68～84min，28%A→36%A；84～98min，36%A→51%A；98～102min，51%A→36%A）；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm（0～37min、85～102min）、330nm（37～85min）；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為10μL。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。以梔子苷色譜峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，所得RSD均小于4.36%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12、24h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以梔子苷色譜峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，所得RSD均小于4.47%，表明供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1），按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以梔子苷色譜峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，所得RSD均小于4.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

按照“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液，分別按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC圖導(dǎo)入2012版《中藥色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)軟件》，以S1的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，設(shè)時(shí)間窗寬度為0.1min，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正和Mark峰匹配生成15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜R（圖1），并標(biāo)定出24個(gè)共有峰；經(jīng)與混合對(duì)照品的HPLC圖（圖2）比對(duì)，其中3、6、9、10、11、14、21、23、24號(hào)峰對(duì)應(yīng)成分分別為新綠原酸、綠原酸、梔子苷、甘草苷、木犀草苷、異綠原酸A、木犀草素、山柰酚、甘草酸。15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S1～S15）的相似度分別為0.986、0.990、0.988、0.968、0.993、0.977、0.979、0.997、0.983、0.979、0.996、0.972、0.988、0.981、0.977，均不小于0.968，表明不同批次平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑所含化學(xué)成分的種類基本一致。

2.2.9 平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的歸屬研究

通過對(duì)平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑、單味飲片、各飲片陰性樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其單味飲片的特征峰均可傳遞到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜中，詳見圖3。圖3中1號(hào)峰屬于甘草、梔子，2、18號(hào)峰屬于菊花、梔子，3號(hào)峰（新綠原酸）屬于菊花、梔子、白茅根，4、9（梔子苷）、19號(hào)峰為梔子專屬峰，5號(hào)峰屬于梔子、白茅根，6號(hào)峰（綠原酸）屬于菊花、梔子、白茅根、山楂，7、13號(hào)峰屬于菊花、梔子，8號(hào)峰屬于菊花、梔子、白茅根、山楂，10（甘草苷）、24（甘草酸）號(hào)峰為甘草專屬峰，11（木犀草苷）、12、14（異綠原酸A）、15、16、17、20、21（木犀草素）、22、23（山柰酚）號(hào)峰為菊花專屬峰。這表明平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝穩(wěn)定，其特征峰與主要成分在飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑間的傳遞也穩(wěn)定，且歸屬關(guān)系較為清晰。

2.3 15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.3.1 聚類分析

以15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的24個(gè)共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，使用SPSS22.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)組間距離為20時(shí)，可聚為3類，其中S5、S6、S8、S11、S15聚為一類，S7、S9、S10聚為一類，S1、S2、S3、S4、S12、S13、S14聚為一類，這表明不同批次樣品中各成分含量存在差異。

2.3.2 主成分分析

以15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的24個(gè)共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，運(yùn)用SIMCA14.1軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，該數(shù)據(jù)矩陣的解釋率參數(shù)R2X為0.973，模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.648，均大于0.5，表明該模型有較好的預(yù)測(cè)能力[11]。15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主成分得分圖見圖5。由圖5可知，主成分分析與聚類分析的結(jié)果基本一致，其中S5、S6、S8、S11、S15為一類，S7、S9、S10為一類，S1、S2、S3、S4、S12、S13、S14為一類，表明15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑中成分特征存在差異。

2.3.3 正交偏最小二乘判別分析

將15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的24個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析。結(jié)果顯示，該數(shù)據(jù)矩陣的解釋率參數(shù)R2X為0.844，模型區(qū)分參數(shù)R2Y為0.784，模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.690，均大于0.5，表明模型擬合度較好，具有較高的穩(wěn)定性與預(yù)測(cè)能力[12]。15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的正交偏最小二乘判別分析得分圖見圖6。由圖6可知，15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑被分為3類：S5、S6、S8、S11、S15為一類，S7、S9、S10為一類，S1、S2、S3、S4、S12、S13、S14為一類，該結(jié)果與聚類分析、主成分分析結(jié)果一致。

將15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的24個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，以變量重要性投影值（variableimportanceintheprojection，VIP）＞1篩選差異性成分[13]，結(jié)果見圖7。由圖7可知，共篩選出7個(gè)VIP＞1的成分，分別是3（新綠原酸）、6（綠原酸）、9（梔子苷）、12、13、14（異綠原酸A）、18號(hào)峰對(duì)應(yīng)的成分，表明這7個(gè)共有峰可能對(duì)樣品分類具有顯著影響，是引起15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性色譜峰，這也與肖復(fù)耀等[14]的研究結(jié)論一致。

2.4 平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)性成分含量測(cè)定及量值傳遞研究

2.4.1 色譜條件

色譜條件同“2.2.4”項(xiàng)下。

2.4.2 供試品溶液的制備

按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別制備15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液。

2.4.3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取異綠原酸A、梔子苷、甘草苷、甘草酸、木犀草苷對(duì)照品各適量，置于同一5mL容量瓶中，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.6076、0.4116、0.0717、0.4322、0.0809mg/mL的單一對(duì)照品溶液。分別取上述各單一對(duì)照品溶液1mL，置于5mL容量瓶中，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.1215、0.0823、0.0143、0.0864、0.0162mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.4.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液以及空白溶液（70%甲醇），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖8）。結(jié)果顯示，各待測(cè)色譜峰與其相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于10000；供試品溶液色譜圖中，在與混合對(duì)照品溶液色譜圖相對(duì)應(yīng)的位置上均有相同保留時(shí)間的色譜峰，且空白溶液對(duì)測(cè)定無干擾。

2.4.5 線性關(guān)系考察

取“2.4.3”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋配制6個(gè)系列濃度的單一對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸的線性回歸方程分別為Y＝13760767.8004X－28090.1196（R2＝1.0000）、Y＝74115257.9937X－6297.1224（R2＝1.0000）、Y＝33796166.4037X－265897.3293（R2＝0.9996）、Y＝15522544.2912X+41548.9439（R2＝0.9990）、Y＝4920602.0551X－28239.8061（R2＝0.9995）。結(jié)果表明，梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸的質(zhì)量濃度分別在0.020580～0.411600、0.001617～0.080850、0.006076～0.607600、0.005125～0.071740、0.017288～0.432200mg/mL范圍內(nèi)與各自峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.4.6 精密度試驗(yàn)

取平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1），按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為1.71%、2.41%、3.14%、1.72%、2.37%（n均為6），表明該方法精密度良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1）6份，分別按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，供試品溶液中梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸的平均含量分別為6.6618、0.5047、4.1501、1.3184、2.6847mg/g，RSD分別為1.40%、3.95%、2.56%、3.53%、1.82%（n均為6），表示該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1），按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后室溫下放置0、2、4、8、12、24h時(shí)按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為2.95%、3.47%、3.01%、1.78%、1.76%（n均為6），表示平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（S1）6份，分別按樣品中梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸含量的100%加入對(duì)照品，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率與RSD。結(jié)果顯示，梔子苷、木犀草苷、甘草苷、甘草酸、異綠原酸A的平均加樣回收率分別為98.94%、98.61%、98.43%、99.72%、98.93%，RSD分別為1.13%、1.03%、1.29%、0.78%、1.79%（n均為6），RSD均小于3%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.10 樣品含量及轉(zhuǎn)移率測(cè)定

取15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，分別按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中梔子苷、甘草苷、異綠原酸A、木犀草苷、甘草酸的含量，平行測(cè)定3次，并按下式計(jì)算含量的轉(zhuǎn)移率：含量的轉(zhuǎn)移率（%）＝（標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)性成分的含量×凍干粉的質(zhì)量/稀釋倍數(shù)）/（對(duì)應(yīng)批次飲片中指標(biāo)性成分的含量×飲片質(zhì)量）×100%（式中，各對(duì)應(yīng)批次飲片中指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法參照2020年版《中國(guó)藥典》（一部）進(jìn)行操作[15]），結(jié)果見表3。最后將含量測(cè)定范圍按均值±30%計(jì)算[16]，用于擬定平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各指標(biāo)性成分的含量和轉(zhuǎn)移率的范圍。

2.5 出膏率的測(cè)定

取按“2.1”項(xiàng)下方法制備的平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑和各單味飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，各精密吸取10mL置于恒重蒸發(fā)皿中，蒸干，于105℃干燥至恒重，放干燥器冷卻后稱定質(zhì)量[17]，然后按下式計(jì)算15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑及各單味飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率[18]：出膏率（%）＝mv/MV（式中，m表示干膏的質(zhì)量，v表示取樣體積，M表示飲片的質(zhì)量，V表示水煎液的體積）。

平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的組方為：菊花10g、梔子15g、白茅根30g、山楂15g、甘草6g，全方共76g。按各單味藥折算，全方理論出膏率（%）＝10/76×對(duì)應(yīng)批次菊花飲片的出膏率+15/76×對(duì)應(yīng)批次梔子飲片的出膏率+30/76×對(duì)應(yīng)批次白茅根飲片的出膏率+15/76×對(duì)應(yīng)批次山楂飲片的出膏率+6/76×對(duì)應(yīng)批次甘草飲片的出膏率。出膏率的轉(zhuǎn)移率（%）＝全方實(shí)際出膏率/全方理論出膏率×100%；變化幅度（%）＝（全方理論出膏率－全方實(shí)際出膏率）/全方理論出膏率×100%。結(jié)果見表4。

由表4可知，15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的理論出膏率均值為29.24%，范圍為27.03%～33.10%，均在其均值±30%的范圍內(nèi)（20.47%～38.01%）；實(shí)際出膏率均值為20.84%，范圍為17.59%～25.54%，均在其均值±30%的范圍內(nèi)（14.59%～27.09%）；出膏率的變化幅度范圍為15.32%～38.85%，未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)。以上表明平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝較為合理，穩(wěn)定可行，未造成明顯的批間差異。

3 討論

本研究前期對(duì)平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜色譜條件進(jìn)行了考察——對(duì)流動(dòng)相考察了甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液，對(duì)柱溫考察了25、30、35℃，對(duì)進(jìn)樣量考察了5、10、15μL，對(duì)流速考察了0.8、1.0mL/min，對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)考察了230、238、330、348nm。結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相（梯度洗脫）、柱溫為30℃、進(jìn)樣量為10μL、流速為1.0mL/min時(shí)，色譜峰的分離度和峰形均較好，且基線較平穩(wěn)；檢測(cè)波長(zhǎng)在0～37min和85～102min時(shí)設(shè)為238nm、37～85min時(shí)設(shè)為330nm的色譜峰數(shù)量較多，同時(shí)梔子苷、甘草苷、甘草酸在238nm波長(zhǎng)處的響應(yīng)值最高且峰形和分離度較好，木犀草苷、異綠原酸A在330nm波長(zhǎng)處的響應(yīng)值較高且峰形和分離度較好，故選擇以上色譜條件作為平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜條件。

本研究結(jié)果顯示，15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜的相似度均不小于0.968，表明不同批次樣品所含化學(xué)成分基本一致。正交偏最小二乘判別分析結(jié)果與聚類分析及主成分分析結(jié)果一致，均可將15批樣品分為3類，表明不同批次樣品的化學(xué)成分含量存在差異，這可能與飲片來自不同產(chǎn)地、取樣不均一等因素有關(guān)。本研究還通過VIP＞1篩選出對(duì)樣品質(zhì)量影響較大的成分，分別為峰3（新綠原酸）、峰6（綠原酸）、峰9（梔子苷）、峰12、峰13、峰14（異綠原酸A）、峰18所對(duì)應(yīng)的成分。

中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，含量測(cè)定所選擇的化學(xué)成分不僅需要符合2020年版《中國(guó)藥典》的要求，還要確保在相應(yīng)的飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)-復(fù)方中能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的質(zhì)量控制。本研究所選擇的平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑指標(biāo)性成分梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸均為2020年版《中國(guó)藥典》中梔子、菊花、甘草藥材的含量測(cè)定成分，也是各藥材的專屬性成分。梔子苷是君藥梔子的主要有效成分，具有解熱、抗炎、保肝等功效[19]。木犀草苷和異綠原酸A是臣藥菊花的主要藥效成分，均具有抗炎、抗病毒、抗菌、熄內(nèi)熱、平肝火等功效[20]。甘草苷和甘草酸為甘草中的主要藥效成分，具有抗菌、抗炎等多種作用[21]。由于綠原酸在幾種藥材中都有，成分專屬性不強(qiáng)，因此沒有將其作為指標(biāo)性成分進(jìn)行測(cè)定。本研究結(jié)果顯示，平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑中梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸的含量范圍分別為3.2279～10.0022、0.2974～0.5546、3.3501～6.1596、0.7206～1.0733、2.0031～3.0301mg/g，飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量轉(zhuǎn)移率范圍分別為19.7628%～35.8405%、12.1233%～21.2540%、46.0972%～82.8694%、58.7088%～91.6296%、39.1143%～63.7106%；15批平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑中梔子苷、木犀草苷、異綠原酸A、甘草苷、甘草酸含量的轉(zhuǎn)移率均在均值±30%范圍內(nèi)，部分批次指標(biāo)性成分含量的轉(zhuǎn)移率差別較大可能與飲片產(chǎn)地不同有關(guān)[22]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)地為江西宜春的梔子中梔子苷的含量及其轉(zhuǎn)移率較產(chǎn)地為湖北江陵、河南唐河的更高，產(chǎn)地為內(nèi)蒙古鄂爾多斯的甘草中甘草苷、甘草酸的含量及其轉(zhuǎn)移率較產(chǎn)地為甘肅隴西、新疆阿勒泰的更高，產(chǎn)地為安徽滁州的菊花中木犀草苷、異綠原酸A的含量及其轉(zhuǎn)移率較產(chǎn)地為浙江桐鄉(xiāng)、河南焦作的更高。另外，15批樣品的實(shí)際出膏率均小于理論出膏率；出膏率的轉(zhuǎn)移率范圍為61.15%～84.68%，均在其均值±30%范圍內(nèi)（49.89%～92.65%），表明平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮工藝穩(wěn)定。本研究以實(shí)際出膏率范圍（17.59%～25.54%）作為上下限，建議平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率范圍為17%～25%。

綜上所述，本研究所建立的平火茶標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜和含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確度高，可為該制劑的量值傳遞研究、質(zhì)量控制、臨床應(yīng)用及后續(xù)制劑的開發(fā)提供參考。