關(guān)鍵詞雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏；制備工藝；質(zhì)量標準；響應(yīng)面法；薄層色譜法；高效液相色譜法

雞內(nèi)金為雉科動物家雞GallusgallusdomesticusBrisson的干燥沙囊內(nèi)壁，具有斂瘡生肌、善化瘀血等功效，《奇效良方》記載其可止血收瘡、治瘡口不愈[1]。雞內(nèi)金有效成分中以尿苷含量較高，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等生物活性[2]。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有益氣補血、活血化瘀的功效，《傷寒論》記載其可治療厥陰性本升、口傷爛赤及瘡瘍等癥，能促進血管生成和創(chuàng)面修復(fù)[3]。阿魏酸是當(dāng)歸的有機酸成分，具有抗氧化、抑菌消炎、抗血栓、抗腫瘤、抗輻射等作用[4]；藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸揮發(fā)油中的主要成分之一，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、提高造血功能等作用[5]。此外，軟膏制劑因具有柔軟、滲透力強等特點，能使藥物快速在皮膚上發(fā)揮作用，從而適用于潰瘍、腫瘍以及皮膚糜爛等病癥的治療[6]。本課題組參考上述文獻制備了雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，經(jīng)前期預(yù)實驗證實，該藥可減少壓瘡面積，促進創(chuàng)面組織再生與修復(fù)，具有補益氣血、活血化瘀、生肌斂口等作用。

響應(yīng)面法可通過建立連續(xù)變量曲面模型來評價影響生物過程的因子及其交互作用[7]，以確定最佳水平范圍，具有實驗?zāi)M性強、所需實驗組數(shù)相對較少等優(yōu)點，已廣泛用于藥物制備工藝優(yōu)化、食品加工等方面[8]。基于此，本課題組擬采用響應(yīng)面法優(yōu)化雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的制備工藝，以性狀、粒度、裝量限度等為指標進行質(zhì)量標準研究，同時采用高效液相色譜（HPLC）法檢測雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏中尿苷、阿魏酸及藁本內(nèi)酯的含量，旨在為該藥的院內(nèi)制劑生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器主要有1260InfinityⅡLC型HPLC儀（美國Agilent公司）、LC-20AT型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、KQ-300DB型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、ME204型電子天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]、DFY400搖擺式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）、Master-Q30型去離子化純水機（上海和泰儀器有限公司）、101-2-5-Ⅱ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、RE-300B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 主要試劑與藥品

阿魏酸對照品（批號C14534190，純度99%）、藁本內(nèi)酯對照品（批號C15648211，純度98%）、尿苷對照品（批號C14883062，純度99%）均購自上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（分析純，批號2023071101）、甲醇（色譜純，批號LOT22085192）均購自安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；磷酸（?yōu)級純，批號20211212）購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；無水乙醇（分析純，批號2022102101）、乙腈（色譜純，批號LOTF22MAB201）均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；水為純水。

當(dāng)歸藥材（產(chǎn)地甘肅，批號211220）購自欽州醫(yī)藥有限責(zé)任公司，雞內(nèi)金藥材（產(chǎn)地河北，批號B22082401-01211220）購自河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司，經(jīng)廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院民族醫(yī)藥研究所黃瑞松主任藥師鑒定均為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的制備

2.1.1 主藥的提取

取雞內(nèi)金藥材，粉碎，過90目篩，得雞內(nèi)金細粉。取當(dāng)歸藥材，粉碎，得當(dāng)歸粗粉；取當(dāng)歸粗粉，加入9倍量體積的70%乙醇，回流提取30min，共3次；濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮成質(zhì)量濃度為1g/mL的流浸膏，即得當(dāng)歸提取物（阿魏酸的提取率為0.74%，藁本內(nèi)酯的提取率為8.43%）。

2.1.2 軟膏的制備

取當(dāng)歸提取物2.0g、雞內(nèi)金細粉3.0g，置于同一干燥燒杯中，加純水溶解，得藥物溶液。取白凡士林3.0g、單硬脂酸甘油酯4.0g、硬脂酸12.0g、液體石蠟8.0g、羊毛脂5.0g，置于干燥燒杯中，加熱作為油相。取乳化劑（三乙醇胺0.4g）、保濕劑（甘油7.5g）、防腐劑（羥苯乙酯0.3g，用少量純水和乙醇混合溶解）置于干燥燒杯中，加熱作為水相。當(dāng)油相與水相加熱至75℃時，先將藥物溶液加入水相，再將油相緩慢加入水相中，攪拌，然后加入純水至100g，維持75℃攪拌10min，停止加熱，繼續(xù)攪拌冷卻至室溫，即得軟膏。

2.2 雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏制備工藝各評價指標的評分標準

根據(jù)2020年版《中國藥典》（四部）“0109乳膏劑、軟膏劑”[9]及相關(guān)研究[10]，以外觀性狀、涂布性、離心穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性和pH值等為評價指標對制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏進行評分，各指標的總分均為10分。具體如下：（1）外觀性狀：軟膏細膩、均勻，無顆粒感、無氣泡、油水無分層，為0.7～1分；軟膏細膩、均勻度適中，有小顆粒、小氣泡、部分油水分層，為0.3～0.6分；軟膏不細膩、均勻，有大顆粒、大氣泡、油水完全分層，為0～0.2分。（2）涂布性試驗：軟膏細膩、均勻、延展性良好，為1.7～2分；軟膏細膩、均勻度適中、延展性適中，為1.0～1.6分；軟膏不細膩、均勻，有大顆粒，延展性較差，不成形，為0分。（3）離心穩(wěn)定性試驗：油水無分層現(xiàn)象、無液化、無硬化、無藥液滲出為2分，反之為0分。（4）耐熱穩(wěn)定性試驗：油水無分層現(xiàn)象、顏色米白色為1.6～2分；部分油水分層、顏色有變化為1～1.5分；油水完全分層為0分。（5）耐寒穩(wěn)定性試驗：油水無分層現(xiàn)象、顏色乳白色、無藥液滲出為1.7～2分；油水部分分層、顏色有變化、藥液輕微滲出為1～1.6分；油水完全分層為0分。（6）pH值：pH6.5～8為1分，否則為0分。

2.3 雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的單因素實驗

本課題組經(jīng)前期預(yù)實驗及參考文獻[11]后發(fā)現(xiàn)，油相（白凡士林、液體石蠟、羊毛脂）、乳化劑用量和乳化溫度是影響軟膏工藝的主要因素，故本研究分別以油相、乳化劑用量以及乳化溫度為指標進行單因素實驗，且各因素用量均參考文獻[11]。

2.3.1 不同油相用量的單因素實驗

取當(dāng)歸提取物2.0g、雞內(nèi)金細粉3.0g，除白凡士林、液體石蠟、羊毛脂外的其他油相及其他輔料用量均按“2.1.2”項下稱/量取，然后按“2.1.2”項下方法制備雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，分別考察不同白凡士林、液體石蠟、羊毛脂用量對軟膏外觀性狀、涂布性、離心穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性和pH值的影響。結(jié)果顯示，隨著白凡士林、液體石蠟、羊毛脂用量的增加，各指標對應(yīng)的總分均呈先增加后降低趨勢，故選擇白凡士林用量分別為3、4、5g，液體石蠟6、7、8g，羊毛脂3、5、7g進行后續(xù)實驗。結(jié)果見表1。

2.3.2 不同乳化劑用量的單因素實驗

取當(dāng)歸提取物2.0g、雞內(nèi)金細粉3.0g，油相及其他輔料用量均按“2.1.2”項下稱/量取，然后按“2.1.2”項下方法制備雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，考察不同三乙醇胺用量對軟膏外觀性狀、涂布性、離心穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性和pH值的影響。結(jié)果顯示，隨著三乙醇胺用量的增加，各指標的總分逐漸增加，故選擇三乙醇胺用量0.3、0.4、0.5g進行后續(xù)實驗。結(jié)果見表2。

2.3.3 不同乳化溫度的單因素實驗

取當(dāng)歸提取物2.0g、雞內(nèi)金細粉3.0g，油相及其他輔料用量均按“2.1.2”項下稱/量取，然后按“2.1.2”項下方法制備雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，考察不同乳化溫度對軟膏外觀性狀、涂布性、離心穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性和pH值的影響。結(jié)果顯示，隨著乳化溫度的增加，各指標的總分呈先增加后降低趨勢，故選擇乳化溫度為75、80、85℃進行后續(xù)實驗。結(jié)果見表3。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

2.4.1 因素與水平

以不同油相用量（A）、三乙醇胺用量（B）和乳化溫度（C）為指標，采用響應(yīng)面法優(yōu)化雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的制備工藝。因素與水平見表4。

2.4.2 試驗方案與結(jié)果

響應(yīng)面法優(yōu)化的試驗方案與結(jié)果見表5。

2.4.3 模型擬合

采用Design-Expert13.0軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行處理，以各因素的總分為指標進行多元非線性回歸擬合，得到回歸方程為Y＝9.58－0.3125A+0.5B－0.0875C+0.1AB－0.025AC+0.1BC－0.6775A2－0.6525B2－0.0775C2（R2＝0.9816）。二次多項回歸方程模擬項的P值＜0.05，表明回歸方程與總分顯著相關(guān)；失擬項的P值＞0.05，表明非正常誤差所占比例小，未知因素對試驗結(jié)果的干擾較少，提示該模型能較準確地預(yù)測實際情況。結(jié)果見表6。

2.4.4 最優(yōu)制備工藝的確定

依據(jù)二次多項式回歸模型，采用Design-Expert13.0軟件繪制各因素的三維響應(yīng)面圖和等高線圖（圖1），得到回歸模型最大值，即最優(yōu)制備工藝對應(yīng)的白凡士林用量為4.0g、液體石蠟為7.0g、羊毛脂為5.0g、三乙醇胺為0.44g、乳化溫度為78℃，預(yù)測各指標的總分為9.7分。

2.4.5 驗證實驗

取當(dāng)歸提取物2.0g、雞內(nèi)金細粉3.0g，除白凡士林、液體石蠟、羊毛脂外的其他油相及其他輔料用量均按“2.1.2”項下稱/量取，白凡士林、液體石蠟、羊毛脂、三乙醇胺、乳化溫度按“2.4.4”項下所得最優(yōu)制備工藝設(shè)置，然后按“2.1.2”項下方法制備雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，共3批。所得樣品按“2.2”項下方法進行評分，得到3批樣品的總分分別為9.8、9.9、9.8分，平均為9.833分（RSD為0.587%），與預(yù)測值（9.7分）相近。

2.5 雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的薄層鑒別

2.5.1 雞內(nèi)金的薄層鑒別

取按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏5.0g，加入正丁醇飽和水溶液30mL，振搖溶解后，超聲處理30min，濾過；取濾液，靜置6h，蒸干，得殘渣；殘渣加入甲醇2mL溶解，作為供試品溶液。取雞內(nèi)金藥材細粉0.3g，加入正丁醇飽和水溶液30mL，超聲處理30min，濾過，取濾液，蒸干，得殘渣；殘渣加入甲醇2mL溶解，作為雞內(nèi)金對照藥材溶液。按最優(yōu)工藝制備不含雞內(nèi)金的軟膏，按上述供試品溶液制備方法制得雞內(nèi)金陰性對照溶液。根據(jù)2020年版《中國藥典》（四部）通則“0502薄層色譜法”[9]，吸取上述各溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.5，V/V/V）作為展開劑，展開，晾干；噴以含5%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照藥材色譜在相同位置上呈現(xiàn)相同顏色的斑點，陰性對照溶液無相同斑點。結(jié)果見圖2。

2.5.2 當(dāng)歸的薄層鑒別

取按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏5.0g，加入甲醇30mL，超聲提取30min，以3500r/min離心15min，取上清液，蒸干，得殘渣；殘渣加入甲醇2mL溶解，作為供試品溶液。精密稱取阿魏酸、藁本內(nèi)酯對照品各20.0mg，分別用甲醇定容至10mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度均為2mg/mL的單一對照品溶液。取上述各單一對照品溶液100μL，置于1mL容量瓶中，加入甲醇定容，得質(zhì)量濃度均為0.2mg/mL混合對照品溶液。取當(dāng)歸藥材0.3g，加入甲醇30mL，超聲提取30min，以3500r/min離心15min，取上清液，蒸干，得殘渣；殘渣加入甲醇2mL溶解，作為當(dāng)歸對照藥材溶液。按最優(yōu)工藝制備不含當(dāng)歸提取物的軟膏，按上述供試品溶液制備方法制得當(dāng)歸陰性對照溶液。根據(jù)2020年版《中國藥典》（四部）通則“0502薄層色譜法”[9]，吸取上述各溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶1，V/V/V）作為展開劑[12]，展開，晾干，噴以含5%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，紫外燈下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照藥材色譜在相同位置上呈現(xiàn)相同的斑點，陰性對照溶液無相同斑點。結(jié)果見圖3。

2.6 檢查

2.6.1 性狀

肉眼觀察雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏為米白色膏狀。

2.6.2 粒度檢查

取按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏3批，分別按2020年版《中國藥典》（四部）通則“0982粒度和粒度分布測定法”中“第一法（顯微鏡法）”[9]進行粒度檢查。結(jié)果顯示，3批樣品均未檢出粒度＞180μm的粒子，符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。

2.6.3 裝量檢查

雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的標示裝量為50g。取按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏3批，分別按2020年版《中國藥典》（四部）通則“0942最低裝量檢查法”[9]進行裝量檢查。結(jié)果顯示，3批樣品的平均裝量為50.0037g，標示裝量均大于95%，符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。

2.7 雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的含量測定

2.7.1 供試品溶液的制備

（1）尿苷供試品溶液：精密稱定按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏8.0g，加入30%甲醇50mL，超聲提取90min，放冷至室溫，以10000r/min離心30min，取上清液，蒸干，然后用5%甲醇定容至5mL容量瓶中，制得尿苷供試品溶液。

（2）阿魏酸、藁本內(nèi)酯供試品溶液：精密稱定按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏10.0g，加入甲醇溶解后靜置30min，以3500r/min離心15min，取上清液，蒸干，然后用甲醇定容至5mL容量瓶中，制得阿魏酸、藁本內(nèi)酯供試品溶液。

2.7.2 對照品溶液的制備

精密稱取尿苷對照品2.0mg，加入5%甲醇定容至10mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的尿苷對照品溶液。精密稱取阿魏酸、藁本內(nèi)酯對照品各20.0mg，分別用甲醇定容至10mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度均為2mg/mL的單一對照品溶液；精密吸取2種單一對照品溶液各100μL，置于10mL容量瓶中，加入甲醇定容，得2種成分質(zhì)量濃度均為0.02mg/mL的混合對照品溶液。

2.7.3 陰性樣品溶液的制備

分別取按最優(yōu)工藝制備的不含雞內(nèi)金藥材或當(dāng)歸提取物的軟膏8.0g，按“2.7.1”項下方法制備各陰性樣品溶液。

2.7.4 尿苷檢測的色譜條件

以WatersXSelect?HSST3（250mm×4.6mm，5μm）為色譜柱，以甲醇（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0～6min，100%B；6～26min，100%B→98%B；26～46min，98%B；46～50min，98%B→95%B；50～55min，95%B→100%B；55～70min，100%B）；檢測波長為254nm；流速為0.8mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10μL[13]。

2.7.5 阿魏酸、藁本內(nèi)酯檢測的色譜條件

以DiamonsilC18（2）（250mm×4.6mm，5μm）為色譜柱，以0.1%磷酸（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～7min，35%B→50%B；7～7.01min，50%B→75%B；7.01～15min，75%B；15～15.01min，75%B→35%B；15.01～20min，35%B）；檢測波長為316nm；流速為1mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10μL[14]。

2.7.6 專屬性試驗

分別精密吸取上述各供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液，按“2.7.4”“2.7.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照品色譜在相同保留時間處出現(xiàn)色譜峰，陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖4、圖5。

2.7.7 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.7.2”項下尿苷對照品溶液，用5%甲醇稀釋，得系列質(zhì)量濃度的尿苷標準曲線溶液（1.6、3.2、6.4、12.8、25.6μg/mL）。精密吸取“2.7.2”項下藁本內(nèi)酯單一對照品溶液，用甲醇稀釋，得系列質(zhì)量濃度的藁本內(nèi)酯標準曲線溶液（0.006、0.012、0.024、0.048、0.096、0.192mg/mL）。精密稱取阿魏酸對照品10.5mg，加入甲醇定容至10mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為1.05mg/mL的阿魏酸對照品溶液；用甲醇稀釋，得系列質(zhì)量濃度的阿魏酸標準曲線溶液（0.00315、0.0063、0.0126、0.0252、0.0504、0.1008mg/mL）。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結(jié)果見表7。

2.7.8 精密度試驗

精密吸取“2.7.7”項下尿苷標準曲線溶液（質(zhì)量濃度為25.6μg/mL）、“2.7.2”項下阿魏酸及藁本內(nèi)酯的混合對照品溶液，分別按“2.7.4”“2.7.5”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，尿苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.10%、0.24%、0.59%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7.9 穩(wěn)定性試驗

取“2.7.1”項下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、6、8、12、24h時按“2.7.4”“2.7.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，尿苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.40%、0.31%、0.26%（n＝6），表明2種供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.10 重復(fù)性試驗

精密稱取按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，每份10.0g，共6份，按“2.7.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.7.4”“2.7.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結(jié)果顯示，尿苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯含量的RSD分別為0.77%、0.76%、0.11%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7.11 加樣回收率試驗

取已知含量的按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，每份8.0g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入尿苷對照品0.8mg，按“2.7.1（1）”項下方法制備供試品溶液；另取已知含量的按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，每份1.0g，共6份，置于具塞錐形瓶中，加入阿魏酸對照品0.1mg、藁本內(nèi)酯對照品0.4mg，按“2.7.1（2）”項下方法制備供試品溶液；取上述供試品溶液，分別按“2.7.4”“2.7.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，尿苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為98.74%（RSD＝1.48%，n＝6）、98.65%（RSD＝1.43%，n＝6）、99.15%（RSD＝1.53%，n＝6），表明該方法準確度良好。

2.7.12 樣品含量測定

按“2.4.4”項下最優(yōu)工藝制備3批雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏，按“2.7.1”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.7.4”“2.7.5”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結(jié)果顯示，尿苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的平均含量分別為0.0812、0.1000、0.3969mg/g。根據(jù)文獻[15]確定各成分的含量限度（不得低于平均含量的80%），即以阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量總和計每克樣品含當(dāng)歸不得少于0.3975mg，以尿苷計每克樣品含雞內(nèi)金不得少于0.0650mg。結(jié)果見表8。

3 討論

本研究得到的最優(yōu)制備工藝為白凡士林4.0g、液體石蠟7.0g、羊毛脂5.0g、三乙醇胺0.44g、乳化溫度78℃。經(jīng)驗證，得到雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的平均總分為9.833分，表明該工藝穩(wěn)定、可行，重復(fù)性良好，可用于實際生產(chǎn)。含量測定結(jié)果顯示，按最優(yōu)工藝制備的雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏中尿苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的平均含量分別為0.0812、0.1000、0.3969mg/g。

在雞內(nèi)金的薄層色譜鑒別中，由于2020年版《中國藥典》（一部）未記載雞內(nèi)金的薄層色譜鑒別方法，本課題組通過查閱相關(guān)文獻[16]，將樣品采用正丁醇飽和水溶液處理，再以三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.1，V/V/V）作為展開劑，噴以含5%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液后，于105℃加熱，發(fā)現(xiàn)樣品并未顯現(xiàn)與對照藥材相同的斑點；而采用“2.5.1”項下薄層色譜條件時，斑點清晰可見，分離效果良好，且無干擾。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.085%磷酸為流動相，采用梯度洗脫法可成功分離藁本內(nèi)酯，但未能檢測到阿魏酸；進一步優(yōu)化色譜條件后，將磷酸溶液濃度由0.085%提升至0.1%，成功提高了阿魏酸和藁本內(nèi)酯的分離度。此外，本課題組前期分別采用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇50mL為溶劑制備尿苷供試品溶液，得到尿苷的含量分別為69.838、62.831、21.406μg/g，表明隨著甲醇體積分數(shù)升高，尿苷含量逐步下降；分別提取60、90、120min時，得到尿苷的含量分別為39.713、81.413、77.606μg/g，表明隨著提取時間延長，尿苷含量先升高后下降。故選用30%甲醇50mL超聲提取90min制備尿苷供試品溶液。

綜上所述，所得最優(yōu)制備工藝可用于雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的院內(nèi)制劑生產(chǎn)；所建含量測定方法可用于雞內(nèi)金當(dāng)歸褥瘡軟膏的質(zhì)量控制。