畢宏達 王曉云 周廣東 劉 偉 李 鳴 邢 新

大鼠睪丸間質(zhì)細胞體外培養(yǎng)不同時間3β-羥基類固醇脫氫酶的表達

畢宏達 王曉云 周廣東 劉 偉 李 鳴 邢 新

目的探討通過差速貼壁法獲得的7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)細胞的細胞群體構(gòu)成、體外培養(yǎng)不同時間3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）的表達水平變化，以及細胞睪酮分泌功能變化。方法聯(lián)合應(yīng)用膠原酶消化、不銹鋼濾網(wǎng)過濾及差速貼壁法獲得7天齡、3周齡雄性Wistar大鼠睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細胞，貼壁細胞以DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別對原代培養(yǎng)2 h、4 d細胞進行3β-HSD免疫化學(xué)染色及流式細胞分析，原代培養(yǎng)細胞同時給予人絨毛膜促性腺激素（HCG）刺激，測定HCG刺激組和非刺激組各代細胞培養(yǎng)液上清中睪酮水平及其對HCG刺激的反應(yīng)。結(jié)果7天齡、3周齡鼠差速貼壁法獲得的睪丸間質(zhì)內(nèi)細胞群經(jīng)流式細胞鑒定，3β-HSD陽性細胞所占比例分別為（5.4±1.2）%、（59.2±3.2）%；培養(yǎng)4 d后，兩組3β-HSD陽性細胞比例分別為（93.6±1.2）%、（95.4±3.2）%。兩組原代培養(yǎng)細胞均有睪酮生成功能，在HCG刺激下睪酮分泌均明顯上升，7天齡組培養(yǎng)細胞睪酮分泌高峰遲于3周齡組。結(jié)論差速貼壁法獲得的7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)細胞群中均含有部分Leydig干細胞（Stem Leydig cells，SLCs），SLCs在體外培養(yǎng)過程中逐漸分化，表達3β-羥基類固醇脫氫酶，并產(chǎn)生睪酮。

睪丸間質(zhì)細胞差速貼壁法睪酮3β-羥基類固醇脫氫酶組織工程

因創(chuàng)傷、腫瘤等導(dǎo)致的睪丸缺失臨床上并不少見。隨著現(xiàn)代社會生活節(jié)奏加快、環(huán)境污染、人口老齡化等原因，雄激素缺乏癥呈逐年上升的趨勢。采用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有生物學(xué)活性的雄激素分泌組織，有望成為治療上述疾病的理想治療途徑。但是，傳統(tǒng)的Leydig細胞分離技術(shù)主要采用膠原酶消化、Percoll密度梯度離心等一系列復(fù)雜方法，細胞得率低、活力差，使種子細胞的來源問題成為困擾組織工程化雄激素分泌組織研究的瓶頸。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)Leydig細胞在大鼠睪丸分離細胞中具有貼壁迅速的特點，據(jù)此建立了一種簡易快速的Leydig細胞分離技術(shù)。與傳統(tǒng)的Leydig細胞分離方法相比，差速貼壁法分離的Leydig細胞得量大、純度較高、細胞活力良好，初步解決了組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌組織種子細胞來源的問題。用該方法獲得的Leydig細胞所構(gòu)建的組織工程化雄激素分泌組織能在較長時期維持睪酮分泌功能[1-2]。

但是，差速貼壁法所獲得的Leydig細胞具體的細胞成分目前還不清楚，其中是否含有Leydig干細胞（Stem Leydig cells，SLCs）成分尚不肯定；對不同鼠齡的大鼠采用差速貼壁法獲得的Leydig細胞成分是否完全一致仍不明確。本研究中，我們選擇兩種不同鼠齡的大鼠，以差速貼壁法獲取睪丸間質(zhì)Leydig細胞進行體外培養(yǎng)，通過不同培養(yǎng)階段對Leydig細胞標(biāo)志物3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）的檢測，深入研究經(jīng)差速貼壁法獲得大鼠睪丸間質(zhì)細胞具體成分，探討所獲得細胞在體外培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)化過程，以進一步優(yōu)化雄激素分泌組織的種子細胞構(gòu)成。

1 材料與方法

1.1 睪丸間質(zhì)細胞獲取

出生后7天齡、3周齡雄性Wistar大鼠（中科院上海實驗動物中心提供）脫頸法處死，無菌取睪丸，PBS沖洗后，冰上剝離白膜及較大的血管。將0.25%膠原酶NB4（Serva，德國）與組織量按1:1比例，37℃、100次/分鐘振蕩消化至睪丸組織形狀剛好消失，曲細精管間組織松散，但曲細精管連續(xù)而無明顯斷裂時，加入2倍于消化懸液體積的培養(yǎng)液或PBS終止消化，以直徑為30 μm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)1500 r/min離心5 min，所得細胞計數(shù)后以2.5×106cell/cm2的密度進行接種。37℃、5%CO2、95%O2和100%濕度下，以無血清的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液培養(yǎng)。2 h后吸棄培養(yǎng)液中未貼壁的懸浮細胞，以PBS漂洗后加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 原代及培養(yǎng)4 d后細胞成分分析

1.2.1 3β-HSD免疫細胞化學(xué)鑒定

原代細胞貼壁分離后即刻行3β-HSD免疫化學(xué)染色。以4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗，1.25%Triton-X 100破膜，正常羊血清封閉非特異性反應(yīng)位點，滴加兔抗人3β-HSD特異性多克隆抗體、4℃過夜，PBS沖洗一抗，滴加羊抗兔IgG第二抗體，37℃反應(yīng)30 min，DAB顯色，蘇木素核襯染，鏡下觀察。原代細胞培養(yǎng)4 d后重復(fù)上述實驗。

1.2.2 3β-HSD免疫細胞化學(xué)流式細胞儀檢測鑒定

原代細胞貼壁分離后即刻，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，收集待測細胞，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，1%Triton-BSA進行細胞膜穿孔，標(biāo)記兔抗人3β-HSD特異性多克隆抗體（1:100，Santa Cruz，美國）及FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:1 000，DAKO，美國），流式細胞儀（Beckman Coulter，USA）進行3β-HSD陽性鑒定，檢測陽性細胞百分比。原代細胞培養(yǎng)4 d后重復(fù)上述實驗。

1.3 原代培養(yǎng)細胞睪酮分泌功能檢測

原代細胞按每孔1.0×105個接種于24孔板上，每天收集原代細胞HCG刺激組和無刺激組培養(yǎng)液上清，經(jīng)Access全自動免疫分析系統(tǒng)（RIA，微粒子發(fā)光原理）（Beckman Coulter，USA）測定睪酮水平。

2 實驗結(jié)果

2.1 差速貼壁法獲得睪丸間質(zhì)內(nèi)細胞

7天齡的Wistar大鼠睪丸去除白膜后，濕重為(0.081±0.023)g；3周齡大鼠睪丸去白膜后濕重為(1.67±0.49)g。采用差速貼壁法，7天齡大鼠每克睪丸組織濕重可獲得（0.06±0.004）×106個細胞，3周齡大鼠睪丸每克濕重收獲細胞數(shù)為（1.4±0.6）×106個。

2.2 原代培養(yǎng)細胞形態(tài)改變

原代培養(yǎng)2 h后，7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)細胞均為圓形，未鋪展(圖1-A、D)。原代培養(yǎng)12 h，7天齡大鼠睪丸間質(zhì)細胞多數(shù)為長梭形，鏡下觀察具有高折光性，細胞聚集為條索狀，呈特征性的六邊形排列（圖1-B）；培養(yǎng)4 d后，多數(shù)細胞完全鋪展，呈拉網(wǎng)樣生長（圖1-C）。3周齡鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)細胞原代培養(yǎng)12 h后細胞開始鋪展，呈拉網(wǎng)樣生長，其中部分細胞呈長梭形（圖1-E），培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)無顯著改變（圖1-E、F）。

2.3 培養(yǎng)細胞成分分析

7天齡大鼠差速貼壁法獲得的睪丸間內(nèi)細胞絕大多數(shù)3β-HSD免疫化學(xué)染色陰性（圖2-A），體外培養(yǎng)4 d后絕大多數(shù)細胞表達3β-HSD（圖2-B）；經(jīng)流式細胞分析，貼壁分離即刻（5.4±1.2）%細胞3β-HSD陽性，原代培養(yǎng)4 d后3β-HSD陽性細胞比例為（93.6±1.2）%（圖3-A、B）。3周齡大鼠大部分原代細胞表達3β-HSD（圖3-C），培養(yǎng)4 d后，絕大多數(shù)梭形細胞及鋪展細胞均表達3β-HSD（圖3-D）；經(jīng)流式細胞分析，貼壁分離即刻（59.2±3.2）%細胞3β-HSD陽性，原代培養(yǎng)4 d后3β-HSD陽性細胞比例為（95.4±3.2）%（圖3-C、D）。

2.4 培養(yǎng)細胞睪酮分泌功能檢測

7天齡鼠睪丸間質(zhì)細胞在培養(yǎng)中睪酮分泌能力逐漸增強，第5天達到高峰（圖4）；3周齡鼠睪丸間質(zhì)細胞在培養(yǎng)第2天睪酮分泌功能達到高峰，其后逐漸下降（圖5）。兩組培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細胞均對HCG刺激有反應(yīng)，在HCG作用下睪酮分泌增加。

圖1 原代培養(yǎng)細胞形態(tài)變化

圖2 培養(yǎng)細胞3β-HSD免疫組織化學(xué)染色

圖3 培養(yǎng)細胞3β-HSD流式細胞學(xué)分析

圖47 天齡大鼠睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌能力檢測

3 討論

組織工程技術(shù)的發(fā)展可能為睪丸缺失、雄激素缺乏性疾病的治療提供理想的治療手段。作為組織工程化雄激素分泌組織的重要種子細胞，睪丸Leydig細胞的獲取一直是限制該研究深入的瓶頸。傳統(tǒng)的Leydig細胞收獲技術(shù)，是基于細胞密度差異基礎(chǔ)上、以Percoll密度梯度離心為主要手段的一系列復(fù)雜分離過程，細胞獲得量少、流失量大且活力低。本課題組在前期研究中采用差速貼壁的方法收獲Leydig細胞，初步解決了雄激素分泌組織構(gòu)建的種子細胞來源問題。但對于差速貼壁法獲得的Leydig細胞具體細胞成分了解尚少。本研究中，我們采用差速貼壁法收獲7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)細胞，通過細胞培養(yǎng)觀察、免疫組織細胞化學(xué)染色、流式細胞術(shù)分析以及細胞生物學(xué)活性檢查等方法，證實了經(jīng)差速貼壁法，從不同鼠齡的大鼠睪丸內(nèi)獲得的Leydig細胞中均含有一定比例的SLCs，不同鼠齡大鼠睪丸Leydig細胞群中干細胞比例是不同的，但在體外培養(yǎng)過程中所獲得的SLCs均逐漸分化，獲得3β-HSD酶活性。

睪丸SLCs是具有向Leydig成體細胞定向分化能力的間充質(zhì)來源干細胞，大鼠的SLCs在出生后第2周(有報道最早于出生后第10天)開始向成體細胞分化，形成Leydig前體細胞（Progenitor Leydig cells，PLCs）。3β-HSD的表達與否，是SLCs與PLCs區(qū)別的重要標(biāo)志[3-4]。本研究中，我們在體外培養(yǎng)的不同時段對兩組培養(yǎng)細胞進行3β-HSD免疫化學(xué)染色鑒定及流式細胞分析，原代培養(yǎng)4 d后的檢測結(jié)果，證實了所獲得的細胞為純化的Leydig系細胞。而在培養(yǎng)初期（貼壁2 h），兩組均有部分細胞為3β-HSD陰性，培養(yǎng)4 d后細胞3β-HSD陽性率明顯升高。我們在培養(yǎng)過程中沒有觀察到細胞增殖現(xiàn)象，不存在陽性細胞增殖導(dǎo)致培養(yǎng)細胞3β-HSD陽性率升高的可能。因此可以肯定，培養(yǎng)初期的3β-HSD陰性細胞在培養(yǎng)過程中發(fā)生了轉(zhuǎn)化，獲得了3β-HSD活性。上述結(jié)果表明，差速貼壁法能夠獲得的7天齡、3周齡大鼠睪丸Leydig系細胞中，都含有一定比例的SLCs。但是，在DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，所獲得的SLCs很快發(fā)生了分化。

圖53 周齡大鼠睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌能力檢測

不同鼠齡的大鼠，經(jīng)差速貼壁法獲得的Leydig細胞中干細胞所占的比例存在較大差異，這種差異與大鼠睪丸Leydig細胞發(fā)育的階段特點是一致的。睪丸SLCs向成體細胞分化開始于出生后第10天，7天齡大鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)SLCs尚處于未分化狀態(tài)，僅有少量的胎兒型Leydig細胞存在[5]。自出生后第10天開始，SLCs大量增殖、分化，產(chǎn)生成體Leydig細胞，SLCs在睪丸間質(zhì)內(nèi)的比例隨著Leydig細胞的發(fā)育成熟逐漸下降[6]。我們通過差速貼壁法獲得的睪丸間質(zhì)細胞，在7天齡大鼠組以睪丸間質(zhì)干細胞為主，在3周齡大鼠組Leydig前體細胞、成體細胞占到了較高的比例，反映了SLCs在睪丸組織內(nèi)所占比例的變化規(guī)律。

兩組大鼠Leydig細胞在培養(yǎng)過程中都檢測到睪酮分泌功能，在HCG刺激下睪酮分泌能力均明顯提高，但睪酮分泌功能變化不完全一致。3周齡組細胞中因成體細胞占到了一定比例，早期即表現(xiàn)出睪酮分泌能力，在培養(yǎng)第2天達到睪酮分泌高峰后逐漸下降；7天齡組最初睪酮分泌水平較低，在培養(yǎng)過程中細胞逐漸獲得睪酮分泌活性，分泌高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)第5天。上述結(jié)果說明，SLCs有助于睪丸Leydig細胞維持睪酮分泌的持續(xù)時間。在成年動物體內(nèi)，雄激素來源主要依賴于睪酮分泌功能最旺盛的成體Leydig細胞，而成體Leydig細胞為終末分化細胞，不具備增殖能力，其數(shù)量的穩(wěn)定依靠SLCs維持。我們以前構(gòu)建的雄激素分泌組織在較長時間（6個月）內(nèi)維持睪酮分泌能力，與差速貼壁法獲得的Leydig細胞中含有一定量的SLCs不無關(guān)系。

純化的SLCs在特殊設(shè)計的培養(yǎng)體系內(nèi)能夠維持細胞表型穩(wěn)定，持續(xù)增殖[6]。本研究中，我們獲得的SLCs未出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，并且細胞在培養(yǎng)過程中很快出現(xiàn)分化。一方面是由于目前的培養(yǎng)體系不利于細胞擴增；另一方面，差速貼壁法獲得的細胞群中，各級Leydig細胞成分混雜在一起，細胞共培養(yǎng)通常會促使干細胞分化。通過改善細胞培養(yǎng)體系、細胞純化等措施，有望實現(xiàn)差速貼壁法獲得的SLCs的穩(wěn)定體外擴增，并通過調(diào)節(jié)種子細胞中干細胞比例的方式，優(yōu)化雄激素分泌組織種子細胞的構(gòu)成，實現(xiàn)組織工程化雄激素分泌組織維持長期、穩(wěn)定的睪酮分泌功能。

綜上所述，經(jīng)差速貼壁法獲得的睪丸間質(zhì)細胞群中含有一定比例的SLCs，其比例隨著動物年齡的不同而存在一定差異，體外培養(yǎng)過程中SLCs能夠分化為有睪酮分泌功能的成體細胞，有助于差速貼壁法獲得的細胞群睪酮分泌功能的持續(xù)。但是，差速貼壁法獲得的睪丸Leydig系各種細胞成分的純化、增殖，仍需進一步深入研究。

[1]王曉云,邢新,周廣東.簡易快速獲得大量高純度大鼠Leydig細胞[J].中華泌尿外科雜志,2007,28:86-90.

[2]王曉云,邢新,周廣東.共培養(yǎng)大鼠睪丸體細胞組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌組織[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2007,87(31):2223-2227.

[3]Chamindrani SML,Handagama M,Siril HB,et al.Differentiation of the adult Leydig cell population in the postnatal rat testis[J]. Bio Repro,2001,65:660-671.

[4]Davidoff MS,Middendorff R,Enikolopov G,et al.Progenitor cells of the testosterone-producing Leydig cells revealed[J].J Cell Biology,2004,167(5):935-944.

[5]Siril HB,Chamindrani SML,Handagama M,et al.Studies on the onset of Leydig precursor cell differentiation in the prepubertal rat testis[J].Bio Repro,2000,63:165-171.

[6]Teerds KJ,Rijntjes E,Veldhuizen-Tsoerkan MB,et al.The development of rat Leydig cell progenitors in vitro:howessential is luteinising hormone[J]?J Endocrinology,2007,194:579-593.

[7]Ge RS,Dong Q,Sottas CM,et al.In search of rat stem Leydig cells: Identification,isolation,and lineage-specific development[J]. PNAS,2006,103(8):2719-2724.

Expression of 3β-Hydroxysteroid Dehydrogenase in Rat Leydig Cells Cultured by Differential Adhesion In Vitro

BI Hongda1,WANG Xiaoyun1,ZHOU Guangdongi2,LIU Wei2,LI Ming1,XING Xin1.
1 Department of Plastic Surgery, Changhai Hispital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.2 Shanghai Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding auther:XING Xin.

ObjectiveTo investigate the constitution of cells population,changes in 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD)expression and androgen productivity in rat Leydig cells cultured by differential adhesion during 4 days primary culture.MethodsTestes from 7 days and 3 weeks old rats were harvested,then Leydig cells were isolated by using collagenase dispersion,stainless steel mesh infiltration and differential adhesion.3β-HSD expression in cultured cells was observed by immunohistochemistry and flow Cytometry analysis immediately after cell isolation and 4 days later.Testosterone level in isolated Leydig cells with or without HCG stimulation was also tested.ResultsIn 7 days group and 3 weeks old group 3β-HSD positive rates in cultured cells were 5.4±1.2%and 59.2±3.2%respectively after isolation immediately.4 days affer culture,most of the cultured cells(93.6±1.2%in 7 days old group,95.4±3.2%in 3 weeks old group)became 3β-HSD positive.Testosterone level,increased by HCG stimulation,in cultured cells from both groups.ConclusionLeydig cells obtained by differential adhesion from 7 days and 3 weeks old rats consist Stem Leydig cells(SLCs).These SLCs were differentiated and gained 3β-HSD activity during cell culture.

Leydig Cell;Differential Adhesion;Testosterone;3β-hydrosteroid dehydrogenase;Tissue Engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）－01－0007－05

2008年12月11日；

2009年1月14日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.003

200433上海市第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院整形外科（畢宏達，王曉云，李鳴，邢新）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海組織工程重點實驗室（周廣東，劉偉）。

邢新。