單桂芬,林 偉,榮墨克,張靜春

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗科,吉林長春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C,Cys C)為非糖基化蛋白質(zhì),分子量為13 kDa,等電點約為9.3,由有核細(xì)胞產(chǎn)生。其低分子量及高等電點的特性使其容易由腎小球濾過,近曲小管對其重吸收并將其分解。Cys C在體內(nèi)產(chǎn)生恒定,不受體重、身高、年齡、性別等因素影響。其血液動力學(xué)及生理學(xué)特點優(yōu)于血清肌酐對腎功能的判斷。當(dāng)腎小球濾過率下降時血中的Cys C濃度增高,當(dāng)近曲小管重吸收障礙時尿中的Cys C濃度增高。因此,Cys C是反映腎小濾過率功能及近曲小管重吸收功能的良好內(nèi)生性指標(biāo)[1-3]。由于方法學(xué)的原因,目前該項檢驗還沒有在臨床上廣泛應(yīng)用。本試驗用ELISA方法測定血清Cys C,方法簡便快速,適于常規(guī)檢測。

1 材料與方法

1.1 對象 選健康體檢者65名。男35名,年齡18-65歲。女30名,年齡20-62歲。采靜脈血3 ml,分離血清,放-20℃冰箱,待測。

1.2 試劑和儀器Cys C,辣根過氧化物酶,過碘酸鈉,均購自Sigma公司。包被緩沖液:0.2 mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液。稀釋液:0.1 mol/L pH 7.4 PBS含1%牛血清白蛋白、0.05%Twen-20、0.4 g/L疊氮鈉。洗滌液:0.1 mol/L pH 7.4 PBS。底物:0.1 mol/L pH 5.0檸檬酸 緩沖液,含40%鄰苯二胺、0.3%H2O2。終止液:2 mol/L H2SO4。酶標(biāo)儀(Model 430),聚苯乙稀酶標(biāo)板。

1.3 抗體制備 0.5 g/L Cys C1 ml與1 ml福氏完全佐劑混合制成乳化液。免疫雌性大耳白兔,分別于4周和6周加強免疫,測定抗體效價達(dá)到1∶32以上時,取0.5 g/L CysC 1 ml靜注,3天后取血分離血清,以45%飽和度硫酸銨純化抗體,-70℃保存。

1.4 包被方法 取兔抗Cys C抗體,用包被緩沖液稀釋成濃度為5 mg/L,包被聚苯乙稀酶標(biāo)板,每孔100 μ l,于4℃包被8小時,用洗滌液洗滌3次。以稀釋液封閉1小時,然后用洗滌液洗滌3次,吸干。包被后的酶標(biāo)板用膠紙封好放4℃冰箱保存。

1.5 酶聯(lián)方法 將10 mg辣根過氧化物酶加5 ml 0.2 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液、5 ml 0.1 mol/L過碘酸鈉,混勻后置4℃30 min。加0.1 mol/L聚乙二醇5 ml混勻后置室溫30 min。加抗Cys C抗體10 mg,以0.2 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液透析6 h。加1 ml 5 mmol/L氫硼化鈉置4℃2 h。加20 ml 45%飽和硫酸銨置4℃30 min。離心后以稀釋液將沉淀溶解,并對其透析6 h,離心去除沉淀。4℃冰箱保存。

1.6 測定方法 包被好的酶標(biāo)板,放室溫30分鐘。加100 μ l以稀釋液稀釋的血清標(biāo)本,37℃水浴20分鐘,洗滌,吸干。加 200 μ l酶標(biāo)抗體。37℃水浴 20分鐘。加200 μ l底物。37℃水浴10分鐘。以50 μ l終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定其吸光度,檢測波長為450 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得Cys C濃度。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 配制濃度為 0.1、10、50、100、200 μ g/L的Cys C標(biāo)準(zhǔn)物。檢測波長為 450 nm。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 抗血清鑒定 免疫得40 ml Cys C抗血清,以紫外分光光度法測定蛋白含量為10 mg。瓊脂免疫擴散測定抗體效價為1:32。

2.2 最適包被濃度 以0.5-20 mg/L Cys C抗體對濃度為0.1-200 mg/L Cys C作ELISA試驗,低濃度Cys C抗體吸光度值低,高濃度Cys C抗體呈非直線,Cys C抗體濃度為5 mg/L時呈良好直線,該濃度的吸光度值為1.025。

2.3 酶標(biāo)抗體鑒定 以Cys C對酶標(biāo)抗體作對流免疫電泳,得酶標(biāo)抗體效價為1:32。以分光光度計對結(jié)合物進行定量測定,結(jié)合物酶量為0.46 g/L,摩爾比值為1.74,符合酶標(biāo)抗體的最佳效果。

2.4 最適反應(yīng)時間 對試驗中各反應(yīng)步驟在不同濃度時不同反應(yīng)時間的觀察,其最適反應(yīng)時間是:包被濃度為10 mg/L37℃時包被時間為2 h,免疫反應(yīng)分別為20 min,顯色時間為10 min。

2.5 方法學(xué)簡評 CysC的線性范圍為:1-100 μ g/L。回收率為:99.1±3.1%。批內(nèi)變異為:5.8±0.5%。批間變異為:7.3±0.7%。

2.6 參考值范圍 對象組進行參考值測定,每份標(biāo)本測定3次,以均數(shù)加減2個標(biāo)準(zhǔn)差確定參考值范圍。分別為:男,1.81±0.73 mg/L。女,1.72±0.69 mg/L。

3 討論

Cys C檢驗方法目前主要采用比濁儀及配套試劑以免疫比濁法測定,需要購置相應(yīng)的設(shè)備,使其臨床應(yīng)用受到限制,所得的臨床檢驗實驗數(shù)據(jù)較少,未能廣泛應(yīng)用。ELISA方法是一般臨床檢驗科都能開展的較簡便的檢驗方法,檢驗設(shè)備一般臨床檢驗科都具備,本實驗建立以ELISA方法測定血清Cys C,并優(yōu)選酶聯(lián)方法和ELISA方法,以求準(zhǔn)確快速。免疫過程的靜注加強免疫可得到高質(zhì)量的抗體,要嚴(yán)格遵守此過程。對酶聯(lián)方法采用加大反應(yīng)濃度以縮短酶聯(lián)時間并提高酶聯(lián)效果。對包被方法加大包被液濃度相應(yīng)縮短包被時間,以5 mg/L的Cys C濃度包被液,在37℃包被8小時,可達(dá)到良好的測定敏感性、精確性和準(zhǔn)確性。時間延長未見明顯變化。通過試驗,測定方法反應(yīng)時間分別為20分鐘,可得良好回收率。顯色最適終止時間優(yōu)選為10分鐘。酶標(biāo)板一次性包被后,冰箱保存可用半年。本方法Cys C的參考值范圍為:男,1.81±0.73 mg/L。女,1.72±0.69 mg/L。男女間無顯著差別(P＞0.05)。線性范圍為:1-100 μ g/L?；厥章蕿?99.1±3.1%。批內(nèi)變異為:5.8±0.5%。批間變異為:6.3±0.7%。由于本室未開展其它Csy C測定方法,未作方法間的相關(guān)性實驗。該方法簡便快速,準(zhǔn)確特異,適于臨床常規(guī)應(yīng)用。

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