姜敏,馬正良,顧小萍,張娟,劉成龍

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210009;2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院麻醉科,江蘇南京 210008)

圍手術(shù)期外科操作、腦梗死、失血性休克等常可發(fā)生局部的缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷。腦是富含磷脂的器官,對(duì)缺血缺氧十分敏感,I/R損傷將會(huì)嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。因此積極探索腦 I/R損傷的分子機(jī)制有著重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)價(jià)值。

近年的研究發(fā)現(xiàn),一種突觸后密度蛋白 Homer1a可負(fù)向調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的過度興奮,可能具有神經(jīng)保護(hù)作用[1-3]。Homer1a是 Homer家族中第一個(gè)被確認(rèn)的蛋白[4],可由神經(jīng)活動(dòng)誘導(dǎo)而快速、短暫地增加表達(dá),其表達(dá)增加有重要的生理意義[5-6]。Homer1a的功能主要通過與組成型表達(dá)的剪切變體 Homer1b/c競(jìng)爭(zhēng)與許多受體的結(jié)合而產(chǎn)生,Homer1a及 Homer1b/c是Homer蛋白家族中的主要成員。目前比較熱門的 I/R后神經(jīng)損傷機(jī)制認(rèn)為 Homer蛋白是關(guān)鍵分子,其參與興奮性氨基酸谷氨酸及其受體的興奮通路,參與如神經(jīng)病理性疼痛[7]、腦損傷[8]等神經(jīng)病理生理過程,但在腦局灶 IR損傷后 Homer1蛋白表達(dá)的變化情況如何尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈栓塞(middle carotis arterial occlusion,MCAO)法制作局灶腦 I/R模型,在穩(wěn)定的I/R模型基礎(chǔ)上通過免疫印跡技術(shù)觀察 I/R損傷對(duì)大鼠神經(jīng)功能及 Homer1a、Homer1b/c蛋白表達(dá)的影響,探討二者參與該損傷過程的關(guān)鍵蛋白亞型,為探索該疾病的病理生理機(jī)制及開發(fā)新的神經(jīng)保護(hù)劑提供思路。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

Homer蛋白多克隆抗體購(gòu)自 SantaCruz公司,Western blotting相關(guān)試劑盒包括不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白及 BCIP/NBT顯色盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

動(dòng)物由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,健康雄性SD大鼠 120只,體重 250～280 g,在 20℃、50%濕度環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲水?dāng)z食,晝夜各 12 h。隨機(jī)分為正常組(N組)、假手術(shù)組(S組)及 I/R組各 40只,I/R組出現(xiàn)對(duì)側(cè) horner征及肢體活動(dòng)障礙的大鼠方可進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物模型制作

術(shù)前 12 h大鼠禁食不禁水,術(shù)中用烤箱保持動(dòng)物體溫。腹腔注射水合氯醛 350 mg?kg-1麻醉后,將大鼠置于操作臺(tái)上仰臥位固定,頸部局部剪毛,碘伏消毒,頸正中切口,游離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA),游離頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)主干一段,穿活線備用,無(wú)創(chuàng)微血管夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。在靠近 ECA、ICA分叉處剪開 CCA一個(gè)小口,將預(yù)先浸泡到肝素生理鹽水中的插線栓子插入,松開微血管夾,緩緩?fù)ㄟ^游離頸內(nèi)動(dòng)脈入顱,適度調(diào)節(jié)頸總動(dòng)脈懸線的角度以利于線栓插入,插線有輕微阻力感且深度約為(1.8±0.5)cm時(shí),固定線栓并縫合皮膚,體外留少許栓線,造成大腦中動(dòng)脈供血范圍的局灶性腦缺血狀態(tài)。插線留置于血管內(nèi) 2 h后拔出,完成 I/R模型的制作[9]。

1.4 行為學(xué)

本實(shí)驗(yàn)借鑒 Li等[10]的神經(jīng)損傷嚴(yán)重度評(píng)分(neurological severity scores,NSS)方法,結(jié)合改良NSS[11]評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損。NSS包括運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡和反射,為 0～18分,0分為正常,分值越高表示損傷越重。每組各 16只大鼠術(shù)前 1 d測(cè)定基礎(chǔ)值 1次,術(shù)后連續(xù)測(cè) 6、12、24、48和 72 h動(dòng)物行為學(xué)改變,測(cè)試前均適應(yīng)觀測(cè)環(huán)境 30 min。每只大鼠每次測(cè)試 3次,取其平均值為 NSS結(jié)果。

1.5 W estern-b lotting

各組大鼠分別在術(shù)后 0、1、6、12、24、48和 72 h取缺血側(cè)海馬及覆蓋在海馬上方腦額頂葉皮層勻漿,12 000×g離心 10 min后取上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度,平衡各上樣樣本總蛋白一致。行 SDS-PAGE凝膠電泳,最后采用 BCIP/NBT顯色劑顯示各組 Homer蛋白。每組各 21只大鼠,7個(gè)時(shí)間點(diǎn)每點(diǎn)取 3只。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以x±s表示。組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,結(jié)果有差異后采用 LSD法作進(jìn)一步分析,組內(nèi)比較采用單因素方差分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 I/R對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響

剔除手術(shù)過程中評(píng)估前死亡的大鼠,實(shí)際參與本實(shí)驗(yàn)大鼠 S組為 17只,I/R組為 18只。I/R組大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失,表現(xiàn)為缺血側(cè)眼裂變小、上眼瞼無(wú)力,對(duì)側(cè)肢體活動(dòng)障礙,尤以前肢為重。提鼠尾可見其左前肢內(nèi)收緊貼胸壁,左側(cè)肢體肌力下降,行走時(shí)偏向左側(cè)或向左側(cè)旋轉(zhuǎn),重者向左側(cè)傾倒。本實(shí)驗(yàn)成功的 I/R模型多在動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)向偏癱側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為學(xué)改變。I/R組 NSS在再灌注后 6 h達(dá)到峰值(12.56±1.24),到 72 h時(shí)基本恢復(fù)(2.44±0.72),見圖1。

圖1 各組大鼠手術(shù)前后不同時(shí)間點(diǎn)的 NSSFig 1 NSS among 3 groups at different tim epionts

在術(shù)前篩選所有大鼠均無(wú)運(yùn)動(dòng)及平衡障礙,術(shù)后N組及 S組 NSS評(píng)分分值雖不為 0,但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 I/R組,與 I/R組比較 P＜0.05。

2.2 I/R損傷對(duì)大鼠皮層及海馬 Homer1a、Homer1b/c表達(dá)的影響

見圖2。模型制作及取腦過程中 N組有 3只、S組有 2只、I/R組有 1只大鼠因操作失敗而被剔出實(shí)驗(yàn)。

圖2 Homer蛋白 W estern-b lotting表達(dá)結(jié)果Fig 2 Exp ression of Homer1a by Western-b lotting

圖2顯示,上面的條帶為分子質(zhì)量較大的Homer1b/c,約 43 000;下面的條帶為分子質(zhì)量約29 000的Homer1a。各組大鼠額頂葉皮層及海馬組織內(nèi)可見 Homer1b/c蛋白陽(yáng)性持續(xù),而 Homer1a只在腦損傷后開始出現(xiàn)并持續(xù)至傷后 72 h,N組及 S組均未見陽(yáng)性表達(dá),即所謂的誘導(dǎo)表達(dá);所以為了方便觀察比較,我們將所有時(shí)間點(diǎn) Homer1蛋白的表達(dá)放在了1張圖上。另外我們也可以看出,即使是有損傷發(fā)生腦內(nèi)Homer1a的表達(dá)量也是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 Homer1b/c的。

3 討 論

腦 I/R損傷是一種常見的臨床病理生理過程,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量,但具體的發(fā)生機(jī)制仍不明確。

本實(shí)驗(yàn)中 I/R組的大鼠麻醉清醒后表現(xiàn)出同側(cè)Horner征及對(duì)側(cè)明顯的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙,在可評(píng)估時(shí)間內(nèi) 6 h時(shí)損害最為嚴(yán)重(6 h以前大鼠尚未從麻醉中完全清醒,對(duì)外界刺激反應(yīng)較差,無(wú)法進(jìn)行運(yùn)動(dòng)、平衡能力的評(píng)估,6 h是經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索選定的),表現(xiàn)為大鼠運(yùn)動(dòng)減少、平衡能力極差,對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍。再灌注 24 h后 NSS分值明顯降低,主要體現(xiàn)在大鼠缺血對(duì)側(cè)的肢體肌力及覓食反射的恢復(fù)方面,再灌注 48及 72 h后,大鼠除了左前肢運(yùn)動(dòng)能力稍遜于 N組及 S組外,其他功能已經(jīng)接近術(shù)前水平。至于 S組與 N組間的統(tǒng)計(jì)差異,我們認(rèn)為是由于麻醉及手術(shù)操作產(chǎn)生的影響,它們分別與 I/R組比較,差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證明 NSS較好地反映了 I/R損傷對(duì)動(dòng)物神經(jīng)功能的影響,模型的建立是成功而且穩(wěn)定的。遺憾的是由于麻醉清醒時(shí)間的因素,我們未能評(píng)估到損傷后 6 h以內(nèi)神經(jīng)功能的改變,無(wú)法確定損傷開始及最嚴(yán)重功能障礙出現(xiàn)的時(shí)間。

因?yàn)樾袨閷W(xué)評(píng)估受到麻醉因素的限制,結(jié)合我們Western blotting的結(jié)果來(lái)看,損傷 6 h內(nèi) Homer1a蛋白的表達(dá)已經(jīng)開始了,所以不能排除 I/R造成的神經(jīng)損傷在 6 h之內(nèi)更為嚴(yán)重。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),NSS評(píng)分顯示動(dòng)物神經(jīng)功能逐漸恢復(fù),Homer1a蛋白的表達(dá)也減少。研究結(jié)果顯示,在無(wú)藥物干預(yù)下 I/R損傷明顯影響到 Homer1a蛋白的表達(dá),該蛋白在 N組和 S組大鼠腦內(nèi)表達(dá)幾乎檢測(cè)不到,I/R損傷后表達(dá)量瞬間升高并延續(xù)一定時(shí)間,提示 Homer1a蛋白對(duì)腦缺血性損傷后引起的神經(jīng)細(xì)胞異常電位活動(dòng)反應(yīng)靈敏,可能參與大腦局灶 I/R神經(jīng)細(xì)胞損傷過程。而 Homer1b/c呈持續(xù)性穩(wěn)定表達(dá)且表達(dá)水平明顯高于 Homer1a可能說明該蛋白的主要作用在細(xì)胞構(gòu)架組成上。不足之處在于實(shí)驗(yàn)條件及經(jīng)費(fèi)所囿,未能取大鼠腦內(nèi)多個(gè)功能核團(tuán)分別行免疫分析法判斷該蛋白的分布,無(wú)法判斷該蛋白與某些神經(jīng)功能的關(guān)聯(lián)性。

Homer蛋白自 1997年 Brakeman等發(fā)現(xiàn)以來(lái),在許多組織中均有發(fā)現(xiàn),但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)顯著。哺乳動(dòng)物中有 3種基因已經(jīng)得到確認(rèn),Homer1、2、3,據(jù)其剪切位點(diǎn)不同又分為 Homer1a-h、Homer2a-d、Homer3等 10種亞型,其中 Homer1是 Homer蛋白家族的主要成員。對(duì) Homer1a和 Homer1b/c的研究較多,Homer1b/c為組成型表達(dá),而 Homer1a是誘導(dǎo)型表達(dá),表明 Homer1基因的剪切、轉(zhuǎn)錄和翻譯受神經(jīng)元突觸活化調(diào)節(jié)。Homer蛋白根據(jù)其 C-末端是否含有Coiled-Coil(CC)二級(jí)結(jié)構(gòu)分為長(zhǎng)型和短型,長(zhǎng) Homer蛋白如 Homer1b/c在突觸后神經(jīng)元谷氨酸受體信號(hào)傳導(dǎo)中成簇排列,通過 CC-區(qū)域相互作用和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)形成二聚體或四聚體結(jié)構(gòu),在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步多聚化,從而以多聚體形式將谷氨酸及其受體包括相關(guān)信號(hào)傳遞因子如鈣通道受體,IP3R等錨定在靶細(xì)胞膜上,形成 mGluR-Homer-IP3R復(fù)合體完成興奮性信號(hào)傳導(dǎo)[11]。

短 Homer如 Homer1a同其他家族蛋白一樣,N-末端含有高度保守序列 EVH1結(jié)構(gòu)域,可結(jié)合興奮性氨基酸受體傳遞細(xì)胞信號(hào)。但其 C-末端缺乏CC結(jié)構(gòu)域不能形成多聚體,因此可與長(zhǎng) Homer蛋白競(jìng)爭(zhēng),動(dòng)態(tài)解耦 mGluR-Homer-IP3R復(fù)合物,延緩 IP3R分子的激活,減少或延遲胞內(nèi) Ca2+的進(jìn)一步釋放,減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷,而被認(rèn)為具有神經(jīng)保護(hù)作用[12]。但該蛋白mRNA長(zhǎng)約 6.5 kDa,決定其基因轉(zhuǎn)錄高效但短暫。我們的研究也顯示 Homer1a在 72 h后表達(dá)已經(jīng)接近 N、S組水平,證明該蛋白的表達(dá)是短暫且不穩(wěn)定的。

綜上所述,我們推測(cè) Homer1a在 I/R損傷后表達(dá)增加,是參與競(jìng)爭(zhēng)性拮抗 Homer1b/c蛋白橋聯(lián)的mGluR-Homer-IP3R/Ca2+途徑,隨時(shí)間進(jìn)展該蛋白消耗增多,而又缺乏新的刺激促使該蛋白長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá),最終只持續(xù)到再灌注后 72 h。這個(gè)推測(cè)又引起我們思考:I/R損傷引起 Homer1a蛋白表達(dá)的變化,該蛋白在損傷過程中是否如本文所引文獻(xiàn)中所言具有神經(jīng)保護(hù)作用?Homer1a保護(hù)作用的具體機(jī)制又是什么?I/R后該蛋白表達(dá)控制在什么水平對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用最合適?如果通過藥物或是其他刺激手段調(diào)節(jié)Homer1a蛋白的表達(dá)是否可以減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷程度呢?這些問題在我們的實(shí)驗(yàn)中尚未找到答案,需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探索,從而為臨床 I/R損傷患者的治療帶來(lái)新的思路。

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