張彩英 曹華斌 李浩棠 郭小權(quán) 胡國良

銅是動(dòng)物生長所必需的微量元素之一，在機(jī)體造血、新陳代謝、生長繁殖、維持正常生產(chǎn)性能、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等方面具有不可替代的作用；銅還是體內(nèi)許多酶的重要組成成分。高銅添加劑因具有良好的促生長作用，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)[1]。動(dòng)物長期攝入高銅日糧，會(huì)導(dǎo)致銅在組織，尤其是肝臟的蓄積，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)貧血，引起中毒，甚至導(dǎo)致死亡[2]。高銅對(duì)豬的促生長作用已得到大家的公認(rèn),但對(duì)于家禽 ,研究結(jié)果很不一致[3-4]。因此,本試驗(yàn)擬通過在基礎(chǔ)日糧中添加不同劑量的蛋白質(zhì)螯合銅，觀察其對(duì)育成蛋雞肝臟和血液某些生化指標(biāo)的影響，為生產(chǎn)上選擇蛋白質(zhì)螯合銅的添加劑量提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

將9周齡健康海藍(lán)褐蛋雞216只，隨機(jī)分成6組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只，放入按防疫要求消毒后的3層籠舍中飼養(yǎng)，每籠12只。

1.2 試驗(yàn)日糧及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用蛋白質(zhì)螯合銅(百樂銅 Bioplex Copper，實(shí)測(cè)銅含量10%，由美國奧特奇生物技術(shù)公司生產(chǎn))作為銅源，在相同日糧基礎(chǔ)上添加蛋白質(zhì)螯合銅（以銅量計(jì)），第Ⅰ組 0 mg/kg，第Ⅱ組(對(duì)照組)6.5 mg/kg，第Ⅲ組 15 mg/kg，第Ⅳ組 30 mg/kg，第Ⅴ組 60 mg/kg，第Ⅵ組125 mg/kg。按常規(guī)程序進(jìn)行免疫、驅(qū)蟲，每日飼喂兩次，自由采食與飲水，定期清理糞便。預(yù)試期7 d，正式試驗(yàn)期35 d?；A(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 樣品的采集與保存

1.3.1 血液樣品

在蛋雞12、14、16周齡的最后1 d，從各組隨機(jī)選取3只雞（每重復(fù)1只），翅下靜脈采血10 ml，析出血清，分裝于去離子水洗凈的干燥青霉素小瓶中，置-20℃冰箱保存，用于血清生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 組織樣品

在蛋雞12、14、16周齡的最后1 d，從各組隨機(jī)選取3只雞（每重復(fù)1只），頸靜脈放血致死，取肝臟樣品5 g左右，包裝于塑料樣品袋中，置于-20℃冰箱保存，用于測(cè)定肝臟蛋白含量及Cu/Zn-SOD、AST、ALT的活力。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）的活性測(cè)定：把低溫保存的血清樣品在室溫下解凍，按試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）說明書方法進(jìn)行。

1.4.2 肝臟組織生化指標(biāo)測(cè)定

取肝組織塊0.5 g在冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙吸干，稱重，放入5 ml的小燒杯內(nèi)。用移液槍移取3.5 ml冷的生理鹽水于小燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，將剪碎的組織倒入玻璃組織勻漿器中，再用1 ml冷的生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的組織碎塊，一起倒入勻漿器中進(jìn)行勻漿，充分勻碎，使組織勻漿化。制備好的10%勻漿液經(jīng)4000 r/min離心15～20 min，取上清液備用。

取按上述方法制備的勻漿液用754紫外分光光度計(jì)測(cè)定肝臟組織Cu/Zn-SOD、ALT、AST的活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，差異顯著性分析采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清和肝組織Cu/Zn-SOD活性變化（見表2）

由表2可知，不同周齡時(shí)隨著螯合銅添加水平的升高血清和肝臟Cu/Zn-SOD活性變化都是先上升后降低，Ⅲ組或Ⅳ組活性最高，Ⅰ組最低。血清Cu/Zn-SOD 活性：Ⅲ、Ⅳ組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），Ⅰ組和Ⅵ組顯著或極顯著低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。肝臟Cu/Zn-SOD活性：Ⅰ組極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），14周齡時(shí)，Ⅲ組和Ⅳ組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），16周齡時(shí)，Ⅲ、Ⅳ組和Ⅴ組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），Ⅵ組極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

表2 血清和肝組織Cu/Zn-SOD活性變化

2.2 血清和肝組織AST活性變化（見表3）

從表3可知，不同周齡時(shí)隨著螯合銅添加水平的升高血清和肝組織AST的活性均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，Ⅵ組活性最高，Ⅳ組最低。血清AST活性：Ⅵ組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組都極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。肝組織AST活性：Ⅲ、Ⅳ組和Ⅴ組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。Ⅰ組和Ⅵ組顯著或極顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 血清和肝組織AST活性變化

2.3 血清和肝組織ALT活性變化（見表4）

從表4可知，ALT活性：Ⅵ組＞Ⅰ組＞對(duì)照組，活性最低的是Ⅲ或Ⅳ組，Ⅵ組肝組織ALT極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組與對(duì)照組相比差異不顯著（但16周齡時(shí)肝臟ALT活性Ⅰ組顯著高于對(duì)照組）。

3 討論

3.1 蛋白質(zhì)螯合銅對(duì)血清和肝臟Cu/Zn-SOD活性的影響

Cu/Zn-SOD位于真核細(xì)胞漿內(nèi)，分子量為2000，由2個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基含1個(gè)銅與1個(gè)鋅，鋅原子與酶分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)，銅原子與酶的活性有關(guān)。根據(jù)Cu/Zn-SOD活性變化，可敏感反映出機(jī)體銅營養(yǎng)狀態(tài)。Cu/Zn-SOD廣泛存在于動(dòng)物組織中，是抗氧化代謝防御體系所必要的組成成分。Cu/Zn-SOD是抗自由基毒性的關(guān)鍵酶之一，可有效地清除體內(nèi)的自由基。Lauridsen(2002)等認(rèn)為，銅有助于改善組織抗氧化能力，高銅對(duì)Cu/Zn-SOD有極顯著的影響，補(bǔ)銅組比缺銅組肝臟Cu/Zn-SOD活性提高了2.7倍，一定范圍內(nèi)適當(dāng)提高日糧銅水平可提高動(dòng)物組織中Cu/Zn-SOD活性[5]，本試驗(yàn)得到相同的結(jié)果。本試驗(yàn)各階段0添加組血清和肝臟Cu/Zn-SOD活力都極顯著低于6.5 mg/kg組，說明當(dāng)動(dòng)物日糧缺銅時(shí)，可降低Cu/Zn-SOD活性，趙昕紅等(1999)[6]也有相似報(bào)道。

表4 血清和肝組織ALT活性變化

本試驗(yàn)表明，日糧添加銅水平為15、30 mg/kg時(shí)，能增強(qiáng)血清和肝臟Cu/Zn-SOD活性，添加銅水平從60 mg/kg提高到125 mg/kg時(shí)，血清和肝組織Cu/Zn-SOD活性分別下降。這說明Cu/Zn-SOD活性并非隨日糧銅水平增加而呈線性上升。馬得瑩等（2003）[7]報(bào)道，當(dāng)日糧銅含量從125 mg/kg提高到250 mg/kg時(shí)，豬血液中Cu/Zn-SOD活性下降了9%。趙麗等（2008）[8]報(bào)道，日糧銅水平為100 mg/kg和200 mg/kg時(shí)，能增強(qiáng)血清Cu/Zn-SOD活性，當(dāng)銅添加量達(dá)600 mg/kg時(shí)，血清Cu/Zn-SOD活性顯著下降。由此可見，日糧銅過高會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物組織與血液中Cu/Zn-SOD活性下降，體內(nèi)自由基蓄積，引起脂酯氧化，導(dǎo)致肝臟等組織損傷。

3.2 蛋白質(zhì)螯合銅對(duì)血清和肝臟AST和ALT活性的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧添加銅水平為125 mg/kg時(shí)，血清和肝組織AST和ALT活性顯著或極顯著高于其它組，且隨日齡增長顯著升高，這與崔恒敏等（2005）[9]報(bào)道的血清AST活性隨銅中毒劑量的增加而升高的結(jié)果一致。0添加組AST和ALT活力也高于其它組，15、30、60 mg/kg組酶活性相對(duì)較低。AST和ALT都是細(xì)胞內(nèi)酶，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)酶由于細(xì)胞膜的屏障作用不易逸出，僅由于細(xì)胞的不斷更新而少量釋放出來。只有當(dāng)細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞膜的通透性升高才會(huì)使細(xì)胞內(nèi)酶釋放出來的速度大大增加，酶活性才會(huì)明顯上升。

AST存在于肝臟、心肌、骨骼肌、腎和腦等組織中；ALT存在于機(jī)體肝、心肌、腦、骨骼肌、腎及胰腺等組織細(xì)胞內(nèi)，但以肝細(xì)胞及心肌細(xì)胞含量最多。在細(xì)胞中AST和ALT主要存在于線粒體及胞漿內(nèi)，是肝細(xì)胞合成蛋白質(zhì)不可缺少的酶。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，血清AST和ALT活性升高，故AST和ALT活性的改變是肝臟受到銅毒性損害的一種應(yīng)答反應(yīng)[10]，血清AST和ALT活性的升高也是肝臟受損、功能障礙的一種反應(yīng)，能很好地評(píng)估肝細(xì)胞的功能狀況，對(duì)肝臟疾病診斷有較高特異性。

4 結(jié)論

日糧中添加15 mg/kg和30 mg/kg銅可顯著提高育成蛋雞的抗氧化功能和肝臟功能，添加125 mg/kg銅可造成肝臟的損傷，因此，在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)日糧下，15～30 mg/kg銅（以蛋白質(zhì)螯合銅的形式）為育成蛋雞最適宜的添加范圍。

[1]趙麗,楊帆,彭西,等.高銅對(duì)雛鴨生長的作用效果[J].中國家禽,2007,29(2):22-24.

[2]崔恒敏,陳懷濤.雛鴨銅中毒的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國家禽,2003,25(11):8-10.

[3]程忠鋼.高銅的應(yīng)用及應(yīng)注意的幾個(gè)問題[J].畜禽業(yè),2000(3):50-53.

[4]姜淑貞,楊在賓,楊維仁.銅在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用趨勢(shì)[J].中國飼料,2000(17):7-9.

[5]Bonham M O,connor J M,Hannigan B M,et al.The immune system asaphysiological in dicator of marginal copper status?[J].British Journal of Nutrition,2002,87:393-403.

[6]趙昕紅,李德發(fā),田福剛,等.高鋅、高銅對(duì)仔豬生長性能、免疫功能和抗氧化酶活性的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,4(1):91-96.

[7]馬得瑩,單安山.銅對(duì)動(dòng)物體內(nèi)自由基防御系統(tǒng)酶活性及其基因表達(dá)的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2003,30(5):27-29.

[8]趙麗,崔恒敏,楊帆,等.日糧中添加高水平銅對(duì)雛鴨血液指標(biāo)的影響[J].中國家禽,2008,30(5):24-28.

[9]崔恒敏,楊光,彭西,等.銅中毒對(duì)雛雞血液生化指標(biāo)影響的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,36(12):1329-1333.

[10]王幼明,王小龍.高銅的應(yīng)用對(duì)畜禽的慢性中毒作用及對(duì)環(huán)境生態(tài)的影響[J].中國獸醫(yī)雜志,2001,37:36-38.