魯 雪,李 赟,黃 倢

(1.中國海洋大學水產(chǎn)學院,山東青島 266003;2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室,山東青島 266071)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是體外擴增 DNA序列的技術(shù),它的基本原理類似于DNA的天然復制過程。自1985年P(guān)CR技術(shù)建立以來[1],該技術(shù)不斷發(fā)展,逐漸成為分子生物學、基因組學、疾病診斷等領(lǐng)域的基本研究手段。PCR反應(yīng)過程包括變性、退火和延伸三個階段,因此PCR技術(shù)需要特殊的熱循環(huán)儀器,耗時長(2 h～3 h)。由于PCR技術(shù)靈敏度高,容易產(chǎn)生假陽性反應(yīng),并且,由于檢測形式單一,結(jié)果不易判讀[2]。因此,亟需更加有效的核酸擴增方法來替代PCR技術(shù)。目前,在聚合酶鏈反應(yīng)這一基本原理的基礎(chǔ)上發(fā)展出來一系列新的核酸擴增概念和實驗方法,本文簡要介紹了幾種新的核酸擴增技術(shù)。

1 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導的等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermalamp lification,LAMP)是一種簡單、快速、特異性強、耗費低的核酸擴增技術(shù),可以在等溫條件下一步完成。LAM P技術(shù)的過程可以分為三個階段,即起始階段,循環(huán)擴增階段以及延伸階段。由于原理比較復雜,可以通過網(wǎng)站上的動畫了解其過程[3]。LAMP技術(shù)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),以及針對目的基因的6個不同區(qū)域設(shè)計的2條內(nèi)引物(FIP,BIP)和2條外引物(F3,B3)進行等溫擴增[4]。這一擴增反應(yīng)是恒溫進行的鏈置換反應(yīng)。將樣品、引物、DNA聚合酶混合物在63℃溫育,基因的擴增和檢測可以一步完成。與PCR技術(shù)和熒光定量 PCR技術(shù)相比,LAMP技術(shù)更加簡單、特異性和靈敏度更高。LAMP的高特異性和高靈敏度是基于恒溫條件下進行的連續(xù)擴增,其擴增的高效性產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物和焦磷酸根離子,焦磷酸根離子與反應(yīng)液中的鎂離子結(jié)合形成焦磷酸鎂白色沉淀。隨著DNA的不斷合成,焦磷酸鎂沉淀量不斷增加,反應(yīng)混合物的混濁度也不斷增大。根據(jù)這一關(guān)系,實時測量反應(yīng)混和物的混濁度可以實現(xiàn)實時監(jiān)測LAMP反應(yīng)的進程[5]。

作為一種恒溫擴增反應(yīng),LAMP技術(shù)不需要熱循環(huán),因此使用簡單的金屬浴或者水浴就可以進行反應(yīng),同時,LAMP技術(shù)不需要特別的試劑。由于對設(shè)備和試劑的要求低,LAMP技術(shù)的成本也比較低。在LAMP反應(yīng)中,擴增和監(jiān)測同時在指數(shù)生長期完成,而不是平臺期,因此可以避免平臺期出現(xiàn)的假陽性反應(yīng)而造成的低靈敏度[6]。此外,只有當靶基因的6個區(qū)域全部被引物準確識別時,擴增反應(yīng)才能進行,因此LAMP技術(shù)具有很高的特異性。加入反轉(zhuǎn)錄酶還可以直接從RNA擴增DNA(RTLAMP)[7]。

LAM P技術(shù)原理雖然復雜,但是實際操作過程卻十分簡單,是一種簡單、快速、有效的核酸擴增技術(shù)。黃倢,張慶利等[8-9]近年來,研發(fā)出對蝦白斑綜合征病毒核酸等溫擴增檢測試劑盒,以及大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法。LAMP技術(shù)診斷試劑盒的研發(fā),將會給研究人員帶來更大的便利,市場前景將十分廣闊。

2 賴解旋酶恒溫基因擴增技術(shù)

賴解旋酶恒溫基因擴增技術(shù)(helicase-dependent isothermal DNA am plification,HDA)是美國 New England Biolabs的研究人員近年來研究出來的一種新型體外恒溫基因擴增技術(shù)[10]。該技術(shù)在恒溫(62℃～65℃)下進行,依賴解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶。其基本原理是:首先,解旋酶打開DNA雙鏈,形成單鏈DNA;其次,單鏈結(jié)合蛋白(SSB)與之結(jié)合,保持單鏈 DNA穩(wěn)定性;接下來,在DNA聚合酶的作用下催化生成新的雙鏈DNA,新生成的雙鏈DNA成為下一輪擴增的模板,如此重復,DNA的量呈指數(shù)增加。

目前常用的解旋酶是大腸埃希菌 UvrD解旋酶[10-11],還有一種解旋酶是T7噬菌體基因4編碼蛋白,與大腸埃希菌UvrD解旋酶相比較,其解鏈速度更快,擴增長度更長[12-13];常用的單鏈結(jié)合蛋白(SSB)有T4噬菌體基因32編碼蛋白,以及RB49噬菌體基因32編碼蛋白[10];常用的DNA聚合酶則選擇Bst酶,或者 K lenow Fragment聚合酶[10,14]。

HDA技術(shù)與其他恒溫基因擴增技術(shù)相比,優(yōu)勢在于其DNA循環(huán)復制體系。由于其解旋酶不需要熱變性就可以打開DNA雙鏈,使得HDA技術(shù)的反應(yīng)程序十分簡單,恒溫條件下就可以完成,這一優(yōu)勢使其成為核酸體外擴增的有利手段[12]。

3 固相PCR技術(shù)

固相PCR(solid phase PCR)技術(shù)是在固體表面進行的核酸擴增技術(shù)。它是將引物通過各種共價鍵結(jié)合到固相基質(zhì)上,使擴增反應(yīng)在固相基質(zhì)表面進行。自Adessi C等[15]于2000年發(fā)明了這種技術(shù)以來,許多研究者對這項技術(shù)進行了優(yōu)化,以期其能夠替代常規(guī)PCR技術(shù)。固相支持物有瓊脂糖小珠,聚丙烯酰胺小珠、乳膠小珠、磁珠、硅片、玻片以及尼龍膜等[16]。固定引物有許多種不同的化學方法,其中,引物5′末端修飾巰基后,通過偶聯(lián)劑將其共價結(jié)合到氨基硅烷化玻片上的效果最好[15]。

固相PCR技術(shù)可以解決多重PCR技術(shù)難以克服的問題:當許多不同的引物對作為反應(yīng)物同時出現(xiàn)在同一PCR體系中,引物之間、引物和模板之間容易產(chǎn)生錯配,因而降低了反應(yīng)的特異性。固相PCR技術(shù)將引物固定在固相支持物表面,可以在空間上阻止引物彼此接觸而形成的二聚體。但是,這一技術(shù)同樣會導致反應(yīng)效率降低,以及支持物表面反應(yīng)物的損失。M euzelaar L S等[17]于2007年發(fā)明了MegaPlex PCR技術(shù),這一技術(shù)首先將擴增基因的特異引物固定到磁珠上,反應(yīng)起始階段,特異引物起作用,在固相支持物表面擴增出一定拷貝的模板,隨后引入一種通用引物,替代特異引物,該通用引物在反應(yīng)液中繼續(xù)擴增,這樣可以充分提高反應(yīng)效率。MegaPlex PCR是一種創(chuàng)新的固相PCR技術(shù),可以很好地實現(xiàn)高通量的多重PCR。

4 指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)

指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是20世紀90年代初由Tuerk C和Gold L發(fā)明的一種新型組織化學技術(shù)[18]。其基本原理是:首先在體外合成一個大量的隨機寡核苷酸庫(SSR),每條寡核苷酸由兩端的固定序列和中間的隨機序列構(gòu)成,隨機序列長度在20個～40個堿基之間。將靶分子與該隨機寡核苷酸庫混合,靶分子會與寡核苷酸(RNA或 ssDNA)“適配子”結(jié)合形成復合物,再將該復合物分離,洗脫下寡核苷酸,以其為模板進行PCR擴增,來制備下一輪的寡核苷酸文庫。經(jīng)過結(jié)合-分離-洗脫-加倍這一過程的反復篩選,與靶分子親和力高的“適配子”便從隨機寡核苷酸庫中分離出來,并且其純度也不斷增高,最終可以占據(jù)庫的90%以上[18]。

通常隨機寡核苷酸庫的容量是1014～1015個寡核苷酸序列。由于寡核苷酸“適配子”能夠形成多種三維構(gòu)象,它們幾乎可以與自然界所有種類的分子結(jié)合[19],從大分子如氨基酸多肽、核酸、復雜藥物高分子,到有機小分子,甚至是金屬離子,這些“適配子”對它們都具有很高的親和力,因此“適配子”被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥學基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)、體外診斷和體內(nèi)治療[20]。由于寡核苷酸“適配子”只識別那些具有與之互補空間結(jié)構(gòu)的分子,因此其識別特異性非常高。根據(jù)Jenison等研究發(fā)現(xiàn),用茶堿篩選得到的RNA“適配子”對茶堿的親和力是對咖啡因的10 000倍,盡管咖啡因與茶堿的空間結(jié)構(gòu)相差很小,只有一個甲基[21]。氨基酸、核苷酸的寡核苷酸“適配子”能將其與鏡像體、突變體區(qū)別開來。同時,“適配子”也具有高親和力的特點。這種“適配子”與蛋白質(zhì)靶分子作用的解離常數(shù)可達nmol/L甚至pm ol/L的水平,與小分子靶物質(zhì)作用的解離常數(shù)也可以達到μmol/L～nmol/L的水平,有的“適配子”親和力甚至高于天然配體[22]。目前,SELEX技術(shù)已經(jīng)得到不斷完善,通過各種手段對“適配子”進行修飾,進一步提高了其親和力和穩(wěn)定性,加之操作過程的自動化,大大增加了SELEX技術(shù)的效率。

5 SOLEXA高通量測序技術(shù)

Solexa高通量測序技術(shù)是由劍橋大學的Solexa公司創(chuàng)立[23],該技術(shù)運用獨特的邊合成邊測序技術(shù)(sequencing-by-synthesis)和可逆中止化合物染料技術(shù)(reversible terminator chemistry),提供高通量、低成本的基因組測序。是“下一代”測序技術(shù)[24],也稱“深度”測序技術(shù)[25]的代表之一。

Solexa技術(shù)的原理是首先把基因組DNA從細胞中提取出來,然后將其打斷成100 bp～200 bp大小的片段,在每個片段末端都加上接頭(adapter),再經(jīng)過PCR擴增制成DNA簇,將DNA簇加入到帶有接頭的芯片上,通過接頭綁定在芯片上,之后加入四種熒光染料標記的核苷和聚合酶,應(yīng)用邊合成邊測序的原理,互補的核苷與核苷酸片段的第一個堿基配對,通過聚合酶結(jié)合到引物上,多余的核苷被移走,單鏈DNA分子通過堿基互補配對原則進行延伸,最后,利用生物發(fā)光蛋白檢測每個加入到DNA片段上堿基的信號,便可對基因組DNA進行測序[25]。

用于DNA測序的技術(shù)主要有Sanger等發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法[26]以及M axam和 Gilbert發(fā)明的化學降解法[27]。當前普遍使用的測序儀,一次只能讀取1 000個左右的堿基。Solexa技術(shù)可在每一張芯片獲取1 G的堿基數(shù)據(jù),速度比傳統(tǒng)的Sanger測序要快上百倍。除了大大降低成本,Solexa技術(shù)還不受物種限制,對人類、動植物、微生物DNA都可以進行測序。同時可以檢測到單拷貝分子的變化,用于SNP分析。Solexa測序技術(shù)在對基因組進行測序的同時,也可以對基因表達調(diào)控,核酸蛋白互作,以及基因功能等進行研究。

6 結(jié)語

本文介紹的幾種核酸擴增新技術(shù)中,LAMP技術(shù)引物設(shè)計是關(guān)鍵,同時利用鏈置換活性的Bst酶進行環(huán)介導的擴增;HDA技術(shù)依賴解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白和聚合酶這3種酶的共同作用,因此對酶的要求非常高;LAM P技術(shù)和HDA技術(shù)均是恒溫條件下的核酸擴增,HDA技術(shù)甚至不需要熱變性,二者已經(jīng)脫離了PCR的概念。固相PCR技術(shù)是改良的PCR技術(shù),通過化學或者生物學手段將引物固定在固相基質(zhì)上,以避免引物間相互干擾,更便于產(chǎn)物的分離和純化;SELEX技術(shù)利用PCR技術(shù)與寡核苷酸隨機文庫的結(jié)合,來進行特異序列的篩選;SOLEXA技術(shù)是PCR應(yīng)用的新概念,用于基因組文庫的高通量測序,是固相PCR應(yīng)用的平臺。

這些核酸擴增的新技術(shù)有著重要的應(yīng)用價值,和各自無法比擬的優(yōu)點,已經(jīng)得到快速的推廣和應(yīng)用,隨著研究者們對這些技術(shù)不斷的完善,其操作過程將更加簡單和規(guī)范,其效率也將進一步提高。這些核酸擴增的新技術(shù)應(yīng)用于生命科學及相關(guān)的各個領(lǐng)域,是必然趨勢,發(fā)展前景十分廣闊。

[1]Saiki RK,Scharf S,Faloona F,et al.Enzym atic amplification of beta-globin genom ic sequen ces and restriction site analysis for diagnosis of sick le cell anemia[J].Science,1985,230(4732):1350-1354.

[2]Maruyam a F,Kenzaka T,Yamagu chi N,et al.Detection of bacteria car rying the stx2 gene by in situ loop-mediated isothermal amplification[J].Appl Environ M icrobiol,2003,69(8):5023-5028.

[3]M ori Y,Notom i T.Loop-mediated isothermal amplification(LAMP):a rapid,accu rate,and cost-effective diagnostic m ethod fo r infectious diseases[J].J Infec Chem,2009,15(2):62-69.

[4]Notom i T,Okayama H,M asubuchi H,et a1.Loop-mediated isotherm al amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):E63.

[5]M ori Y,Nagamine K,Tomita N,et al.Detection of loop-mediated isothermal am plification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,289:150-154.

[6]Parida M M.Rapid and real-time detection technologies for emerging viruses of biomedical im portance[J].JBiosci,2008,33(4):617-628.

[7]Mori Y,Notom i T.Loop-mediated isothermal amplification(LAMP):a rapid,accu rate,and cost-effective diagnostic m ethod for infectiousdiseases[J].J Infect Chemother,2009,15(2):62-69.

[8]黃 倢,張慶利,宋曉玲,等.對蝦白斑綜合癥病毒核酸等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法:中國,200810139949.4[P].2008-09-07.

[9]張慶利,黃 倢,史成銀,等.大菱鲆紅體病虹彩病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法:中國,200810015154.2[P].2008-03-13.

[10]V incent M,Xu Y,Kong H.H elicase-dependen t isothermal DNA am plification[J].EMBO Rep,2004,5(8):795-800.

[11]Collins R,M cCarthy T V.Purification and characterization of Thermus thermoph ilus UvrD[J].Extremophiles,2003,7(1):35-41.

[12]Jeong Y J,Park K,K im D E.Isotherm al DNA amplification in v itro:the helicase-dependent amplification system[J].Cell M ol Life Sci,2009,1:24.

[13]Nakai H,Richardson C C.The effect of the T 7 and Escherich ia coli DNA-binding proteins at the replication fork of bacteriophage T7[J].Biol Chem,1988,263(20):9831-9839.

[14]An L,Tang W,Ranalli T A,et al.Characterization of a therm ostab le UvrD helicase and its participation in helicasedependent amplification[J].Biol Chem,2005,280(32):28952-28958.

[15]AdessiC,Matton G,Ayala G,etal.Solid phase DNA amplification:characterisation of primer attachm ent and am plification mechanism s[J].Nuc leic Acids Res,2000,28(20):E87.

[16]陶生策,張治平,張先恩.PCR技術(shù)研究進展[J].生物工程進展,2001,21(4):26-29.

[17]Meuzelaar L S,Lancaster O,Pasche J P,et al.MegaPlex PCR:a strategy for mu ltiplex amplification[J].Nat Meth,2007,4(10):835-837.

[18]Tuerk C,Gold L.Systematic evolution of ligands by exponen tial en richment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J].Science,1990,4968(249):505-510.

[19]Gold L,Polisky B,Uhlenbeck O,et al.Diversity of oligonucleotide functions[J].Annu Rev Biochem,1995,64:763-797.

[20]Stoltenbu rg R,Reinemann C,Strehlitz B.SELEX-a(r)evolutionarymethod to generate high-affinity nu cleic acid ligands[J].Biomol Eng,2007,24(4):381-403.

[21]Jenison RD,GillS C,Pardi A,etal.High-resolutionm olecular discrimination by RNA[J].Science,1994,5152(263):1425-1429.

[22]Bridonneau P,Chang Y F,Buvoli A V,et al.Site-directed selection of oligonucleotide an tagonists by competitive elu tion[J].Antisense Nu cleic Acid Drug Dev,1999,9(1):1-11.

[23]Schuster SC.Next-generation sequencing transforms today＇s biology[J].Nat M ethods,2008,5(1):16-18.

[24]Sultan M,Schulz M H,Richard H,et al.A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcrip tome[J].Science,2008,321(5891):956-960.

[25]Fields S.M olecular biology:Site-seeing by sequencing[J].Science,2007,5830(316):1441-1442.

[26]Sanger F,Nicklen S,Cou lson A R.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA,1977,74(12):5463-5467.

[27]M axam A M,GilbertW.A new method for sequencing DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1977,74(2):560-564.