李 樂,苗海生

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南昆明 650224)

口蹄疫病毒非型特異性檢測方法研究進(jìn)展*

李 樂,苗海生

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南昆明 650224)

口蹄疫病毒非型特異性檢測方法避免了口蹄疫不同血清型影響試驗(yàn)的敏感性,可快速簡單的診斷口蹄疫病毒,判斷免疫效果,檢測感染歷史等,如口蹄疫非型特異性RT-PCR、口蹄疫3ABC檢測、VIA抗原AGID檢測等,在口蹄疫防控中有廣泛的應(yīng)用。目前一些新開發(fā)的非型特異性檢測方法更突出了簡便性、快速性的特點(diǎn),如橫流裝置(lateral flow device,LFD)可在1 min～10 min完驗(yàn),設(shè)備只需要一臺(tái)簡單的樣品攪拌器,非常適合基層使用。

口蹄疫病毒;非型特異性;非結(jié)構(gòu)蛋白

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的主要侵害偶蹄類動(dòng)物的A類動(dòng)物疫病。常見的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有 RT-PCR、抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(AC-ELISA)、液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(LPB-ELISA)、3ABC-ELISA檢測、中和試驗(yàn)(VN)、正向血凝抑制試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)等。口蹄疫有7個(gè)血清型,VN、AV-ELISA、LPB-ELISA等檢測方法能夠區(qū)別口蹄疫病毒的血清型,為型特異性口蹄疫診斷方法,而AGID、3ABC檢測方法等檢測方法不能區(qū)別口蹄疫血清型,為非型特異性口蹄疫診斷方法,口蹄疫病毒血清型特異性檢測方法和非型特異性檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn),型特異性檢測方法可以檢測出口蹄疫病毒血清型來,但是很多情況需要使用非型特異性檢測,如邊境動(dòng)物流動(dòng)控制中,只需要1次非型特異性檢測檢測就可以得出是否口蹄疫感染的結(jié)論,如果一個(gè)動(dòng)物進(jìn)行7次口蹄疫檢測,就會(huì)消耗大量的人力物力。進(jìn)行口蹄疫免疫狀況調(diào)查也需要非特異性檢測方法,一次試驗(yàn)可檢測出疫苗的免疫效果,不必要進(jìn)行多次的試驗(yàn)。常見的口蹄疫病毒非特異型檢測方法有口蹄疫非型特異性 RT-PCR、口蹄疫3ABC檢測、VIA抗原AGID檢測等,目前開發(fā)的很多口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(NSPs)檢測方法都為非型特異性檢測方法。

1 非型特異性RT-PCR檢測方法

RT-PCR是一種快速方便的口蹄疫病毒檢測方法,非型特異性RT-PCR,用于普查動(dòng)物否隱性帶有口蹄疫病毒,如果檢測到陽性,可再進(jìn)行病毒分離和定型等一系列試驗(yàn)。國內(nèi)早在1998年朱彩珠等[1]報(bào)告非型的特異性RT-PCR檢測方法,檢測序列相應(yīng)于FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因后2/3區(qū)段,在4個(gè)血清型之間基本一致。目前開發(fā)的口蹄疫PCR方法多為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(real-time RTPCR),比傳統(tǒng)PCR有更高的敏感性,針對非型特異性的核酸片段,使real-time RT-PCR能夠更加方便的用于動(dòng)物流動(dòng)控制,世界參考實(shí)驗(yàn)室(WRL)研究的一步法real-time RT-PCR[2],通過257份樣品的檢測,證明有診斷價(jià)值,比傳統(tǒng)的二步法real-time RT-PCR更方便穩(wěn)定,花群義等[3]針對口蹄疫非型特異性的聚合酶3D基因序列,設(shè)計(jì)合成了引物和探針,可檢測到相當(dāng)于9.1TCID50的病毒RNA,敏感性非常高。設(shè)計(jì)合理的口蹄疫非型特異性RT-PCR可以從混合感染病料中檢測出口蹄疫病毒,Fernández J等[4]開發(fā)優(yōu)化的多元 RT-PCR(multiplex RT-PCR),可從豬水皰性口炎(Swine vesicular disease,SVD)、水皰性口炎(Vesicular stomatitis)病料中一步檢測出口蹄疫病毒核酸,有良好的應(yīng)用前景。

2 口蹄疫病毒NSPs檢測方法

大部分口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白為保守蛋白,不具有型特異性,依據(jù)非結(jié)構(gòu)蛋白開發(fā)的診斷方法可無區(qū)別的用于7個(gè)血清型的檢測,即據(jù)此方法可檢測出攜帶任何血清型口蹄疫病毒的動(dòng)物,而不區(qū)分出其攜帶的是哪種血清型。常見的非結(jié)構(gòu)蛋白檢測方法有3ABC、3AB、3D等,口蹄疫疫苗免疫的動(dòng)物很少有3ABC、3AB抗體,因此3ABC和3AB檢測方法常用于檢測動(dòng)物是否感染口蹄疫病病毒,由于具有非型特異性,3ABC和3AB試劑盒可方便的用于大批量的動(dòng)物普查,找到隱性感染口蹄疫病毒的動(dòng)物。有關(guān)3ABC和3AB檢測方法有大量的研究報(bào)告[5-8],市場上也已有3ABC和3AB檢測試劑盒上市。3ABC和3AB檢測方法不能用于免疫動(dòng)物的血清抗體水平評價(jià),免疫動(dòng)物的抗體評價(jià)需要使用傳統(tǒng)的型特異性口蹄疫病毒LPB-ELISA和微量細(xì)胞中和試驗(yàn)的方法精確檢測抗體滴度,但由于型特異性的特點(diǎn)和條件上的限制不適用于大批量的田間抗體普查。

3D蛋白是感染性相關(guān)抗原(virus-infection-associated antigen,VIAA)的主要組成部分,為 RNA聚合酶,在疫苗中含量比較高,疫苗免疫動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生VIAA抗體,因此用3D蛋白開發(fā)的方法一般不用于區(qū)別免疫和感染。3D蛋白非常保守,不同血清型和血清亞型的3D核酸系列和蛋白構(gòu)像基本不變[9-10],使得3D蛋白成為開發(fā)非型特異性口蹄疫檢測方法的理想目標(biāo)。3D蛋白可用于大批量評價(jià)的動(dòng)物血清抗體水平普查,可確定動(dòng)物是否接觸過口蹄疫抗原,并可對疫苗的免疫效果進(jìn)行評價(jià)。早在1970年McVicar J W等[11]就建立了VIAA抗原檢測瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID),該方法用組織培養(yǎng)的病毒培養(yǎng)液提取半純化的VIA抗原(semi-purified)來進(jìn)行試驗(yàn),該方法的缺點(diǎn)是敏感性不高,優(yōu)點(diǎn)是便宜,容易操作,AGID作為一種標(biāo)準(zhǔn)的口蹄疫病毒非型特異性檢測方法用于世界各地,在我國也作為一種標(biāo)準(zhǔn)檢測方法而廣泛應(yīng)用于邊境動(dòng)物檢測。AGID目前正被以重組技術(shù)為基礎(chǔ)的非結(jié)構(gòu)蛋白檢測方法取代。

起初通過表達(dá)VIAA建立的檢測方法可用于評價(jià)動(dòng)物是否接觸過口蹄疫病毒抗原,但該方法的敏感性還是不夠,無法用于要求精確的試驗(yàn)[12]。世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室(WRL)將3D和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)融合表達(dá)后,通過提取高純度的3D蛋白建立的簡單間接ELISA可無區(qū)別的檢測出7個(gè)血清型口蹄疫病毒抗體,敏感性稍微低于LPB-ELISA[13],檢測口蹄疫病毒的特異性為95%,但是試驗(yàn)也證明了3D蛋白和其他腸道病毒的聚合酶有相同的抗原表位,使診斷產(chǎn)生有一定的誤差。

3 以單抗為基礎(chǔ)的非型特異性口蹄疫病毒檢測方法

合適的的單克隆抗體可以提高檢測的敏感性、準(zhǔn)確性。Brocchi E等[14]通過單抗建立了型特異性的口蹄疫檢測方法,該方法敏感性特異性高,成為倫巴第及艾米利亞-羅馬涅大區(qū)的動(dòng)物疾病預(yù)防實(shí)驗(yàn)室(Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna,IZSLER)常規(guī)口蹄疫檢測方法。挑選針對非型特異性抗原位點(diǎn)的單抗,能建立非型特異性口蹄疫檢測方法,Smitsaart E N等[15]報(bào)告了針對口蹄疫12 S抗原挑選的單克隆抗體,能夠檢測出7個(gè)口蹄疫血清型中的6個(gè),但未見以此單抗建立檢測試劑盒的后續(xù)報(bào)告。Yang M等[16]通過對口蹄疫3D蛋白的肽庫的分析,選擇挑選了Mabs位點(diǎn)來建立非型特異性ELISA,他們共合成了92個(gè)肽段,通過15頭感染康復(fù)牛的血清來進(jìn)行間接ELISA,發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)肽段能識(shí)別15頭牛中的12頭,該肽段由3D蛋白中的16～30氨基酸構(gòu)成,通過該肽段獲得Mabs進(jìn)行cELISA試驗(yàn),研究表明牛羊經(jīng)過人工感染后9 d可檢測出陽性,試驗(yàn)證明用該單克隆抗體可開發(fā)新診斷方法。

橫流裝置(lateral flow device,LFD)是WRL最新開發(fā)的一種快速FMDV非特異性檢測方法[17],該方法的基礎(chǔ)是一個(gè)挑選出來的單克隆抗體,該抗體能夠與口蹄疫病毒血清型毒株泛反應(yīng)(pan-reactive),也就是具有非型特異性特征。用LFD方法對304份陽性血清和1 003份陰性血清進(jìn)行檢測,結(jié)果表明 LFD試驗(yàn)的敏感性和特異性比抗原捕獲ELISA(AC-ELISA)稍低,LFD敏感性為84%,特異性為99%,AC-ELISA的敏感性為85%,特異性為99.9%,但是LFD比AC-ELISA更為快速的方便,整個(gè)試驗(yàn)1 min～10 min完成,簡單的樣品攪拌器可以完成樣品處理,非常適合田間試驗(yàn)。LFD目前有試劑盒銷售。

4 展望

口蹄疫病毒非型特異性檢測方法突出的優(yōu)點(diǎn)為簡單、快速、適合基層應(yīng)用,LFD橫流裝置在1 min～10 min完成試驗(yàn),具有一定敏感性,是理想的口蹄疫病毒檢測方法,但LFD是抗原檢測方法,口蹄疫臨床癥狀比較明顯,抗原檢測方法意義沒有抗體檢測意義大,抗體檢測可以用于免疫效果檢測、感染歷史檢測等,如果能夠建立快速簡單、適合基層應(yīng)用的口蹄疫非型特異性血清抗體檢測方法,如在方便簡單方面達(dá)到LFD橫流裝置的指標(biāo),將有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Progress on Non-type-specific Detection Method for FMDV

LI Le,MIAO Hai-sheng

(Y unnan Animal Husbandry and Veterinary Science Institute,K unming,Y unnan,650224,China)

Non-type-specific detection methods can not distinguish serotypes of FMDV antigen,but can quickly and accurately determine the animal carriers,and the immunological conditions,so play important role in FMD control strategy.Non-type-specific FMDV detection methods include RT-PCR,FMDV 3ABC test,VIA antigen AGID test and so on.At the present,many new non-type-specific detection methods underline its simpleness and rapidness.Such as lateral flow device(LFD),can give result in 1-10 minute,so can be easily used in fields.

Foot-and-mouth diseases virus;non-typespecificity;non-structural protein

S852.659.6

A

1007-5038(2010)03-0079-03

2009-09-30

云南省社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007C255M);云南省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2008LA019)

李 樂(1969-),男,云南昆明人,副研究員,主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。