岳昌海，朱許慧，侯文貴，李憑力*

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072； 2.天津市膜科學(xué)與海水淡化技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072； 3.天大天久科技股份有限公司，天津 300072)

傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵工藝采用糧食高溫蒸煮然后發(fā)酵的方式，不僅耗費(fèi)大量能源，而且稀酸和高溫對(duì)設(shè)備損壞極大，副產(chǎn)物較多[1-5]。現(xiàn)階段生產(chǎn)乙醇的原料主要是糧食，近些年糧食價(jià)格上漲等其它因素導(dǎo)致高乙醇成本。再加上國家節(jié)能減排以及非糧食酒精政策的出臺(tái)，使糧食酒精受到很大限制。許多研究者正在尋找可替代的發(fā)酵原料，如秸稈、木材或生產(chǎn)中的某些副產(chǎn)品等。近年來，生淀粉乙醇發(fā)酵工藝在國內(nèi)外受到了高度重視[6-8]，我國對(duì)生料釀酒的研究20世紀(jì)90年代進(jìn)入快速發(fā)展期[9]，許多學(xué)者利用各種生物酶制劑對(duì)生料發(fā)酵進(jìn)行了研究[10-11]。甘薯渣是甘薯提取淀粉后的副產(chǎn)品，在許多加工 廠中堆積如山，酸化腐敗，造成環(huán)境污染。而且粉渣中蛋白質(zhì)含量很低，纖維素含量較高，也不適合做飼料使用。本研究以甘薯渣為原料，生料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。這不僅能克服傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇高能耗的缺點(diǎn)，而且就原料的取材符合國家的非糧乙醇政策。

1　試驗(yàn)部分

1.1　主要儀器及藥品

甘薯渣，產(chǎn)于河北行唐縣，濕甘薯渣含水分約83.2%，干燥后原料含淀粉約48%左右，偏酸性，pH值在6.5～7.0之間；生料酒曲，可用于生料釀酒，湖南中南食品科學(xué)研究院生產(chǎn)；活性干酵母，釀酒用耐高溫型，湖北安琪股份有限公司生產(chǎn)；耐高溫α-淀粉酶(液化酶)，Liquozyme SC,液態(tài)酶，活力7 199 IU，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；糖化酶，Suhong GA 475，液態(tài)酶，活力2 000 IU，中外合資蘇州宏達(dá)制酶有限公司生產(chǎn)；纖維素酶，固態(tài)粉末狀，活力16 670 IU，北京百靈威科技有限公司生產(chǎn)；葡萄糖，分析純；乙醇，分析純；硫酸，分析純。

UV-722分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；668型真空干燥箱(江蘇省東臺(tái)縣電器廠)；9790Ⅱ高效氣相色譜(溫嶺福立分析儀器有限公司)；PHS-25型數(shù)字酸度計(jì)(上海精科)；LD5-2A型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究發(fā)酵條件例如pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等對(duì)甘薯渣無蒸煮一步發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響，并選定最適宜因素水平配比組合。

在甘薯渣無蒸煮一步發(fā)酵過程中，原料中水分含量直接影響物料的浸潤(rùn)程度。而且酵母乙醇發(fā)酵過程是典型的產(chǎn)物抑制，水量的多少可以影響抑制程度的大小。因此要確定原料的含水量。對(duì)于酶及酵母等具有生物活性的物質(zhì)，要保證其最大活性，必須選擇最適宜pH值和最適宜溫度，因此發(fā)酵料的pH值及發(fā)酵時(shí)溫度也是影響發(fā)酵的重要因素。最后，發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響著酶對(duì)底物的作用效果以及酵母消耗酶解產(chǎn)物并發(fā)酵成乙醇的過程，故也將發(fā)酵時(shí)間作為一個(gè)因素考慮在內(nèi)。

因此，選擇溫度、pH值、發(fā)酵時(shí)間、含水量以及酒曲量5個(gè)影響因素，可以有效得出試驗(yàn)規(guī)律，為實(shí)現(xiàn)生料發(fā)酵產(chǎn)乙醇、提高產(chǎn)率提供依據(jù)。

基于生料發(fā)酵現(xiàn)有的條件，根據(jù)生物酶活性的最適宜條件和酵母生長(zhǎng)的最適宜環(huán)境，各因素選取4個(gè)水平，如表1所示。

表1　因素與水平表

A：pH值；B：發(fā)酵時(shí)間 /h；C：發(fā)酵溫度/℃；D：水料比；E：酒曲含量/% 。

本試驗(yàn)考察5個(gè)因素，各因素均取4個(gè)水平，由于各個(gè)因素之間沒有交互作用，因此可使用L16(45)正交表。

1.2.2單因素試驗(yàn)

正交試驗(yàn)得出的最適宜配比需要進(jìn)一步驗(yàn)證。固定發(fā)酵的4個(gè)影響因素，改變另1個(gè)因素，考察此因素的不同水平對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，并得出各因素的最適宜值。

將干燥過的甘薯渣搗碎后與適量的40 ℃蒸餾水混勻，加入適量生料酒曲，混勻，密封于500 mL廣口瓶中，放入恒溫箱中，在特定溫度下進(jìn)行發(fā)酵。觀察發(fā)酵料的顏色變化和封口薄膜的鼓起情況。在酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生一部分CO2，會(huì)使薄膜鼓起，從鼓起程度可以判斷發(fā)酵程度。同時(shí)瓶中的發(fā)酵料會(huì)由灰色變?yōu)槠【泣S色，而且塊料變松散。

1.3　分析方法

1.3.1乙醇濃度的測(cè)定

在生料甘薯渣發(fā)酵試驗(yàn)中，乙醇含量的分析方法如下：將發(fā)酵醪放入蒸餾鍋中蒸餾，通過蒸汽帶走發(fā)酵醪中的乙醇，并經(jīng)冷卻，收集，得到乙醇和水的冷凝液。利用酒精計(jì)或氣相色譜測(cè)定溶液中乙醇含量。

1.3.2乙醇理論產(chǎn)率的計(jì)算

酵母發(fā)酵淀粉產(chǎn)生乙醇的過程分兩步：淀粉水解成糖；葡萄糖經(jīng)酵母發(fā)酵生成乙醇和CO2。反應(yīng)式如下：

(C6H10O5)n+162nH2O→18nC6H12O6180
C6H12O6→1802C2H5OH+2×462CO22×44

1 g淀粉理論上生產(chǎn)乙醇量為：2×46/162=0.567 9 g，則1 g干料理論上產(chǎn)生乙醇量為：1×48%×0.567 9=0.272 g。

1.3.3pH值測(cè)定

用蒸餾水清洗發(fā)酵料，濾紙過濾，得到清液將其定容，用PHS-25型數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定。

1.3.4原料水分的測(cè)定

用電子天平稱取5～10 g原料，放入烘箱，在110 ℃下烘6～7 h(以達(dá)到恒重為準(zhǔn))，取出，置于干燥器內(nèi)冷卻30 min后，稱重。

2　結(jié)果與討論

2.1　正交試驗(yàn)結(jié)果與討論

甘薯渣生料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2中的極差R可知，影響乙醇產(chǎn)率的主次因素順序?yàn)椋喊l(fā)酵pH值>水料比>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>曲量。

從圖1可以看出，乙醇產(chǎn)率隨發(fā)酵pH值的增加而增加，取原料自然pH值時(shí)發(fā)酵結(jié)果最好，有必要進(jìn)一步研究提高pH對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響；乙醇產(chǎn)率隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在發(fā)酵時(shí)間192 h時(shí)，乙醇產(chǎn)率較高，超過192 h后，乙醇產(chǎn)率有下降趨勢(shì)；當(dāng)水料比在2時(shí)，乙醇產(chǎn)率較大，但不能確定2就是最適宜，可以進(jìn)一步研究減小水料比對(duì)發(fā)酵的影響；發(fā)酵溫度適中，在35 ℃時(shí)乙醇產(chǎn)率最大，高于酵母菌最適生長(zhǎng)溫度；酒曲添加量在1.0%時(shí)乙醇產(chǎn)率最大，當(dāng)超過1.0%時(shí)，乙醇產(chǎn)率有下降趨勢(shì)。

表2　試驗(yàn)結(jié)果

圖1　因素水平趨勢(shì)圖Fig.1　Trend lines of factor levels

因此得出可能最適宜發(fā)酵方案是：A4B3C1D3E3，即：發(fā)酵pH值為原料的自然pH值，水料比為2，發(fā)酵時(shí)間為192 h，發(fā)酵溫度為35 ℃，曲量為原料質(zhì)量的1.0%。在此條件下發(fā)酵驗(yàn)證。發(fā)酵結(jié)果無水乙醇生成量為0.24 g/g，達(dá)理論值的87.8%。在此基礎(chǔ)上做單因素試驗(yàn)，結(jié)果列于2.2節(jié)。

2.2　單因素試驗(yàn)結(jié)果與討論

在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)每一個(gè)影響發(fā)酵的因素進(jìn)行研究，分別對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行討論。

圖2是不同pH值對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響。

圖2　不同pH值對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響Fig.2　Variation of ethanol yield under pH

從圖2可以看出，在pH值為6.5和7.0之間時(shí)乙醇產(chǎn)率可達(dá)最大值。隨著pH值的降低，氫離子會(huì)將菌體細(xì)胞膜內(nèi)陽離子置換出來，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，細(xì)胞死亡[13-14]。所以隨pH值的降低乙醇產(chǎn)率也降低。當(dāng)pH值超過7時(shí)，乙醇產(chǎn)率逐漸下降。因?yàn)閴A性環(huán)境改變了菌體的發(fā)酵途徑，致使乙醇產(chǎn)量減少，甘油產(chǎn)量增加。甘薯在加工完生產(chǎn)淀粉后本身就略呈酸性，約為6.5左右，所以選擇原料的自然pH值，符合發(fā)酵條件，而且工藝更簡(jiǎn)單。

對(duì)于生料甘薯渣來說，淀粉顆?；旧鲜峭暾鴪F(tuán)聚的，表露出來的可與酶結(jié)合的活性位點(diǎn)很少[16-17]，因此很難被淀粉酶輕易降解。如果淀粉經(jīng)高溫蒸煮后，會(huì)因?yàn)榉肿娱g氫鍵的斷裂而變得膨脹松散，易于酶解的進(jìn)行和發(fā)酵。另外，原料甘薯渣中含有大量的纖維素，妨礙了酶與淀粉的接觸，減緩了發(fā)酵速度。所以適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，可以使降解酶有充分的時(shí)間與淀粉顆粒接觸并將其降解，有利于酵母發(fā)酵。圖3給出了發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響。

圖3　發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響Fig.3　Influence of fermentation time on yield of ethanol

從圖3可以看出，在180 h時(shí)發(fā)酵效果最好。但發(fā)酵時(shí)間持續(xù)過長(zhǎng)，生長(zhǎng)雜菌的幾率就會(huì)變大，有的細(xì)菌以乙醇為營養(yǎng)碳源，消耗乙醇并且產(chǎn)生酸，致使發(fā)酵后酸度加大、產(chǎn)品產(chǎn)量下降。

合適的加水比是獲得最適宜的工藝條件的前提。傳統(tǒng)的乙醇工業(yè)采取液態(tài)發(fā)酵，水料比通常在3.0以上，這使后期的蒸餾能耗增加，而且造成大量的廢水無法回收。如果水料比太小，水分不易將干燥的物料充分浸潤(rùn)，乙醇產(chǎn)率就會(huì)很低。不同水料比的結(jié)果見圖4。

圖4　水料比對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響Fig.4　Influence of water-material ratio on yield of ethanol

從圖4中可以看出，在水料比2.4時(shí)乙醇產(chǎn)率最大。水料比再增大，不僅會(huì)影響乙醇產(chǎn)率，而且給后期的水處理帶來麻煩。

溫度是影響微生物存活的重要因素之一。在發(fā)酵過程中，溫度對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響很明顯。因各種生物酶活性的最適宜溫度、酵母生長(zhǎng)的溫度以及產(chǎn)物的生成溫度不一定相同，所以需要找到一個(gè)合適的溫度使乙醇產(chǎn)率最大[17,18]。溫度是保證酶活性的重要條件，一般隨發(fā)酵溫度升高，酶反應(yīng)速率加快，而且菌體細(xì)胞膜的流動(dòng)性增大。乙醇發(fā)酵溫度略高于酵母正常生長(zhǎng)溫度，這有利于酶的活性處于較高水平并且維持細(xì)胞膜高滲透性，利于營養(yǎng)物的進(jìn)入和乙醇與CO2的排出。所以在發(fā)酵試驗(yàn)過程中，需要調(diào)整溫度以找到最佳條件使產(chǎn)品產(chǎn)率最大。不同發(fā)酵溫度對(duì)應(yīng)的結(jié)果如圖5。

圖5　發(fā)酵溫度對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響曲線圖Fig.5　Influence of fermentation temperature on yield of ethanol

從圖5中可以看出，乙醇產(chǎn)率隨溫度的升高而升高，在33 ℃時(shí)達(dá)最大。當(dāng)溫度再升高時(shí)，乙醇產(chǎn)率逐漸下降。因?yàn)槊副旧砗苋菀滓蜻^熱而失去活性，使酵母質(zhì)量下降，發(fā)酵能力變差，甚至菌體會(huì)過早的衰亡。較高的溫度不僅抑制酵母發(fā)酵，還會(huì)使耐高溫的乳酸菌等細(xì)菌有可能快速繁殖，消耗葡萄糖及乙醇等而產(chǎn)生酸，增加發(fā)酵醪酸度。

一般來講，乙醇的形成是菌體代謝的結(jié)果，故菌體濃度越大，產(chǎn)物的產(chǎn)量就會(huì)越高。酒曲添加量的影響見圖6。

圖6　曲量對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響曲線Fig.6　Influence of amount of Koji on yield of ethanol

從圖6可知，隨著酒曲添加量的增加，乙醇產(chǎn)率增大，但超過0.9%后，增加趨緩甚至有降低的趨勢(shì)，可能原因有2個(gè)：1)接種量過大，菌體濃度較高時(shí)，增加發(fā)酵醪黏度，而且由于空間條件的限制、菌體之間的相互作用以及營養(yǎng)物質(zhì)的相對(duì)稀少等因素，致使菌體繁殖較慢，活性降低甚至過早衰亡[19-20]；2)接種量過大使菌體大量消耗原料糖分，從而降低乙醇的產(chǎn)率。因此，在曲量為1.0%時(shí)產(chǎn)率最大，考慮到乙醇生產(chǎn)成本，發(fā)酵時(shí)酒曲添加量取0.9%合適。

綜上，由單因素試驗(yàn)得出的最適宜發(fā)酵條件為：發(fā)酵pH值為原料的自然pH值，發(fā)酵時(shí)間為180 h，水料比為2.4，發(fā)酵溫度為33 ℃，酒曲添加量為0.9%。并在此最適宜條件下做發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3　最適宜條件的驗(yàn)證試驗(yàn)及其結(jié)果

單因素試驗(yàn)得出的最適宜條件較正交試驗(yàn)得出的最適宜條件略有不同。在單因素試驗(yàn)得出的最適宜條件下，發(fā)酵取得了更好的結(jié)果。

3　結(jié)　論

1)影響甘薯渣生料發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的主次因素順序?yàn)椋喊l(fā)酵pH值>水料比>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>曲量。

2)甘薯渣生料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的最適宜條件組合為：發(fā)酵pH取原料的自然pH值,發(fā)酵時(shí)間取180 h，水料比取2.4，發(fā)酵溫度取33 ℃，酒曲添加量為0.9%。

3)在最適宜條件下，對(duì)甘薯渣進(jìn)行生料發(fā)酵，1 g干料產(chǎn)乙醇0.240 g，達(dá)到理論值的88.2%。

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