張青，徐群為，黃長(zhǎng)高，都述虎(南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京市210029)

左氧氟沙星(LOFL)為氧氟沙星的左旋活性異構(gòu)體，屬第3代氟喹諾酮類(lèi)廣譜抗菌藥物，通過(guò)抑制細(xì)菌DNA回旋酶，對(duì)大多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有顯著的殺菌作用，對(duì)非典型病原體也有較好的抗菌作用[1]。目前，LOFL遞藥系統(tǒng)主要有普通注射劑、滴眼劑、片劑和膠囊劑，但這些劑型的缺陷是藥物進(jìn)入體內(nèi)后消除較快，而緩釋制劑比普通制劑能更長(zhǎng)時(shí)間維持LOFL的有效濃度，所以很多學(xué)者在研究LOFL的緩釋劑型[2，3]。

酪蛋白(Cas)是主要從牛奶中提取的一種混合蛋白質(zhì)，根據(jù)編碼基因不同，分為αs1、αs2、β、κ 4種組分[4]，其質(zhì)量比為4∶1∶4∶1，平均等電點(diǎn)為4.8，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品的處方中[5]，具有高乳化性、穩(wěn)定性、膠凝性及生物相容性[6]。因?yàn)镃as具有親水和親脂的氨基酸殘基，所以在溶液中能自發(fā)組裝成膠束[7]，并且其可以與戊二醛發(fā)生交聯(lián)，形成生物可降解的、具有緩控釋能力的微球[8]。以Cas為載體材料制備的藥物傳輸系統(tǒng)，不僅具有生物可降解性，而且具有藥物緩控釋能力，有良好的研究前景[8，9]。

本文通過(guò)熒光光譜技術(shù)，研究LOFL與Cas的相互作用，推斷其作用機(jī)制，計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。本研究可為制備以Cas為載體材料的LOFL遞藥系統(tǒng)提供緩釋機(jī)制、藥物載體比例、穩(wěn)定性等方面的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

F4600型熒光光度計(jì)(日本Hitachi公司)；Delta 320-S pH計(jì)(瑞士Mettler-Toledo公司)；AY220型電子天平(日本Shimadzu公司)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；PURELABTMCLASSIC超純水機(jī)(德國(guó)Pall公司)。

1.2 試藥

LOFL(乳酸鹽，上海三維制藥有限公司，批號(hào):200510124，純度:99%)；Cas(酪蛋白酸鈉，百靈威科技有限公司，批號(hào):C0594，純度:90%)；所有樣品溶液均用氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度為0.1 mol·L－1；試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

2 方法

2.1 熒光光譜的研究

為了考察研究對(duì)象的熒光發(fā)射光譜是否相互干擾，記錄了各單一組分的熒光發(fā)射光譜。在緩沖液(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，Tris-HCl)中160 W功率下超聲10 min，溶解Cas，制備成2 g·L－1的貯備液；LOFL在緩沖液中制備成1.0×10－4mol·L－1的貯備液，均置于冰箱中1～4℃保存。取Cas貯備液1 mL和LOFL貯備液0.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用緩沖液定容，搖勻，掃描熒光光譜。預(yù)試驗(yàn)測(cè)得LOFL和Cas的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為285/461 nm和278/340 nm。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)范圍295～700 nm，掃描速度為1200 nm·min－1，激發(fā)和發(fā)射光狹縫寬度分別為10 nm和5 nm，光電倍增管(PMT)電壓為400 V，記錄0.2 g·L－1的Cas溶液、5×10－5mol·L－1的LOFL溶液和緩沖液的熒光光譜。

2.2 熒光猝滅試驗(yàn)

熒光猝滅試驗(yàn)可以推斷分子間相互作用的機(jī)制，計(jì)算相互作用的熱力學(xué)參數(shù)以及分子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[10～12]。在編號(hào)為0～8號(hào)的10 mL的容量瓶中，均加入1.0 mL的Cas貯備液，然后分別加入0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL的LOFL貯備液，用pH7.4的緩沖液稀釋至刻度，混合均勻，于恒溫水浴鍋中保溫1 h，得到0～8號(hào)樣品。其中Cas濃度均為0.2 g·L－1，LOFL濃度分別為0、0.2×10－5、0.3×10－5、0.4×10－5、0.5×10－5、0.6×10－5、0.7×10－5、0.8×10－5、0.9×10－5mol·L－1。分別在25℃和30℃2種溫度下記錄各樣品的熒光光譜。從熒光光譜中可以得到在不含或含不同濃度的LOFL情況下，Cas在最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度。

熒光猝滅的機(jī)制分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是熒光分子在擴(kuò)散中遭遇猝滅劑而發(fā)生的碰撞猝滅；靜態(tài)猝滅是熒光分子與猝滅劑之間形成了基態(tài)復(fù)合物引起的熒光猝滅[12]。如果猝滅機(jī)制是動(dòng)態(tài)猝滅，熒光猝滅過(guò)程遵循Stern-Volmer方程[13]，見(jiàn)方程(1):

式中，F(xiàn)0和F分別代表不存在和存在猝滅劑時(shí)最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度；kq為生物分子猝滅速率常數(shù)；τ0是無(wú)猝滅劑存在時(shí)熒光體的熒光壽命，對(duì)于生物大分子而言，τ0＝10－8s；[Q]為猝滅劑濃度；Ksv是Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

對(duì)于靜態(tài)猝滅，可用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系式擬合:

式中，KLB是靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)[13]。

對(duì)于靜態(tài)猝滅，熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度間存在方程(3)所描述的關(guān)系，可以用來(lái)確定結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)[10]。

式中，Kb為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 熒光光譜

分別對(duì)0.2 g·L－1的Cas溶液、0.5×10－5mol·L－1的LOFL溶液、緩沖液在285 nm波長(zhǎng)處激發(fā)，記錄發(fā)射光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cas的最大發(fā)射波長(zhǎng)在340 nm處；LOFL的最大發(fā)射波長(zhǎng)為461 nm；而緩沖液和LOFL溶液在340 nm波長(zhǎng)處幾乎未見(jiàn)發(fā)射熒光峰，所以不會(huì)對(duì)Cas溶液產(chǎn)生的熒光造成干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 3種溶液的熒光光譜Fig 1Fluorescence spectra of 3 kinds of solutions

圖2 LOFL對(duì)Cas的熒光猝滅光譜Fig 2Effect of LOFL on fluorescence spectra of Cas

3.2 LOFL對(duì)Cas的熒光猝滅作用

蛋白質(zhì)是熒光體，內(nèi)源性熒光主要來(lái)自于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基，在280 nm波長(zhǎng)附近激發(fā)，其熒光峰分別位于348、303、282 nm波長(zhǎng)處，強(qiáng)度比為T(mén)rp∶Tyr∶Phe＝100∶9∶0.5[10，11]。Cas的最大發(fā)射波長(zhǎng)在340 nm處，所以可以判斷Cas的熒光主要來(lái)自于Trp殘基。與熒光物質(zhì)相互作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降或者能使熒光量子產(chǎn)率降低的物質(zhì)稱(chēng)為熒光猝滅劑，LOFL對(duì)Cas的熒光猝滅光譜詳見(jiàn)圖2(圖中0→8指依次為0～8號(hào)樣品)。

由圖2可以發(fā)現(xiàn)，LOFL是Cas的熒光猝滅劑。固定Cas濃度，不斷提高混合溶液中LOFL的濃度，結(jié)果Cas的熒光有規(guī)律地猝滅。對(duì)于LOFL，隨著其濃度升高，在461 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在394.8 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)了1個(gè)等強(qiáng)度發(fā)射點(diǎn)，提示藥物與蛋白之間形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

3.3 猝滅機(jī)制的推斷和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

圖3 2種溫度下LOFL與Cas相互作用的Stern-Volmer曲線(xiàn)Fig 3Stern-Volmer plots for the interaction between LOFL and Cas at 2 kinds of temperatures

對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅而言，由于猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol－1·s－1，如果計(jì)算出的kq值小于2.0×1010L·mol－1·s－1，表明該猝滅過(guò)程是分子擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅。如果計(jì)算出的kq值遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol－1·s－1，則表明該猝滅過(guò)程是分子之間形成了基態(tài)復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。另外，溫度對(duì)Ksv值的影響也可以幫助區(qū)分動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程中，當(dāng)溫度升高，分子間碰撞加劇，Ksv值變大；靜態(tài)猝滅過(guò)程中，溫度升高，基態(tài)復(fù)合物穩(wěn)定性下降，Ksv值變小[12]。為了推測(cè)熒光猝滅機(jī)制，分別在25℃和30℃2個(gè)溫度下測(cè)定熒光猝滅情況，從熒光光譜中可以得到F0和F值，以F0/F對(duì)[Q]作圖，得到圖3。根據(jù)圖3中的曲線(xiàn)，應(yīng)用Stern-Volmer方程擬合的參數(shù)見(jiàn)表1。

圖4 2種溫度下LOFL與Cas相互作用的Lineweaver-Burk曲線(xiàn)Fig 4Lineweaver-Burk quenching plots for the interaction between LOFL and Cas at 2 kinds of temperatures

表1 LOFL與Cas相互作用的Stern-Volmer常數(shù)和曲線(xiàn)擬合方程Tab 1Stern-Volmer quenching constants and curves fitted equation of interaction between LOFLand Cas

從表1中發(fā)現(xiàn)，計(jì)算得到的kq值遠(yuǎn)大于2.0×10－10L·mol－1·s－1，所以可推斷猝滅過(guò)程是靜態(tài)猝滅；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，Ksv值變小，這一結(jié)果也證明了猝滅過(guò)程是靜態(tài)猝滅而不是動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程。

所以采用靜態(tài)猝滅模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。根據(jù)方程(2)對(duì)25℃和30℃2種溫度下的熒光猝滅數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。

從圖4中發(fā)現(xiàn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系良好，從斜率可以計(jì)算得到相應(yīng)溫度下的KLB值，KLB近似于熱力學(xué)結(jié)合常數(shù)K[13]。結(jié)合KLB值與相關(guān)熱力學(xué)公式(4)、(5)，可以計(jì)算得到相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表2。

式中，ΔG為自由能，ΔH為標(biāo)準(zhǔn)焓，ΔS為標(biāo)準(zhǔn)熵，R為氣體常數(shù)，T為絕對(duì)溫度。

表2 LOFL與Cas相互作用的Lineweaver-Burk猝滅常數(shù)、曲線(xiàn)擬合方程和相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Tab 2Lineweaver-Burk quenching constant KLB，curves fitted equation and the relative thermodynamic parameters of the interaction between LOFLand Cas

從表2中可以發(fā)現(xiàn)，KLB值隨著溫度的升高而變小，與KSV值隨溫度的變化是一致的，說(shuō)明溫度升高后降低了LOFL與Cas之間的相互作用。蛋白質(zhì)與小分子之間的非共價(jià)鍵相互作用包括4種類(lèi)型，分別是范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作用[14]。ΔG、ΔH和ΔS能夠反映相互作用模式。當(dāng)溫度變化較小時(shí)，ΔH可以看作是常數(shù)，ΔH是負(fù)值顯示反應(yīng)是放熱過(guò)程；ΔG為負(fù)值表示反應(yīng)是自發(fā)過(guò)程。對(duì)于典型的疏水作用，ΔH和ΔS都是正值；當(dāng)焓變和熵變都是負(fù)值表示主要存在范德華力以及形成了氫鍵[15]。測(cè)得LOFL與Cas結(jié)合的ΔH和ΔS分別為－39.85 kJ·mol－1和－48.54 J·mol－1·K－1，所以推斷LOFL與Cas之間的相互作用主要是范德華力和氫鍵。

圖5 2種溫度下lg[(F0－F)/F]-lg[Q]關(guān)系曲線(xiàn)Fig 5Plots of the interaction between lg[(F0－F)/F]and lg[Q]at 2 kinds of temperatures

3.4 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)確定

將25℃和30℃2種溫度下測(cè)定的熒光猝滅數(shù)據(jù)用公式(3)擬合，得到圖5。

從圖5中直線(xiàn)的斜率可以得到結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。計(jì)算得到平均結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n＝1.38，即LOFL與Cas分子以接近1∶1的比例發(fā)生相互作用。

4 討論

對(duì)LOFL與Cas存在相互作用的研究，對(duì)制備藥物傳輸系統(tǒng)有一定幫助。例如載體和藥物的作用位點(diǎn)數(shù)，可以指導(dǎo)確定藥物和載體的比例，以?xún)?yōu)化載藥量和包封率。載體和藥物存在相互作用，可以提高藥物的穩(wěn)定性，而且大幅提高藥物的緩釋性能[16，17]；另外相互作用類(lèi)型可以為設(shè)計(jì)刺激敏感型藥物傳輸系統(tǒng)提供理論指導(dǎo)[18]。

本文利用熒光光譜研究了LOFL與Cas之間的相互作用。發(fā)現(xiàn)LOFL對(duì)Cas的內(nèi)源性熒光具有猝滅作用。根據(jù)熒光猝滅數(shù)據(jù)推斷猝滅機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅而不是動(dòng)態(tài)猝滅。計(jì)算了不同溫度下的靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù)，結(jié)合熱力學(xué)方程，計(jì)算得到相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。結(jié)果提示二者的相互作用是以氫鍵和范德華力為主，二者以接近1∶1的比例發(fā)生相互作用。

[1]孫曼春，方世平，王智勇，等.鹽酸左氧氟沙星在健康人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，13(3):5.

[2]裴志強(qiáng)，尹莉芳，周建平.中心復(fù)合設(shè)計(jì)法優(yōu)化鹽酸左氧氟沙星緩釋片處方[J].藥學(xué)進(jìn)展，2007，31(11):508.

[3]劉金虹，關(guān)宗.左氧氟沙星劑型的研制[J].天津藥學(xué)，2006，18(3):57.

[4]Wal JM.Structure and function of milk allergens[J].Allergy，2001，56(Suppl 67):35.

[5]Yan L，Rong G.Interaction between casein and sodium dodecyl sulfate[J].J Colloid Interface Sci，2007，315(2):685.

[6]梁琪.酪蛋白酸鈉功能性的研究[J].食品科學(xué)，2002，23(3):30.

[7]Narambuena CF，Ausar FS，Bianco ID，et al.Aggregation of casein micelles by interactions with chitosans:a study by Monte Carlo simulations[J].J Agric Food Chem，2005，53(2):459.

[8]Latha MS，Lal AV，Kumary TV，et al.Progesterone release from glutaraldehyde cross-linked casein microspheres:in vitro studies and in vivo response in rabbits[J].Contraception，2000，61(5):329.

[9]Shapira A，Markman G，Assaraf YG，et al.Beta-caseinbased nanovehicles for oral delivery of chemotherapeutic drugs:drug-protein interactions and mitoxantrone loading capacity[J].Nanomedicine，2010，6(4):547.

[10]王公軻，閆長(zhǎng)領(lǐng)，盧秀敏，等.鹽酸環(huán)丙沙星與胰蛋白酶相互作用的光譜和分子模擬研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，67(17):1967.

[11]尹燕霞，向本瓊，佟麗.熒光光譜法在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010，27(2):33.

[12]Teng W，Bingren X，Ying W，et al.Spectroscopic investigation on the binding of bioactive pyridazinone derivative to human serum albumin and molecular modeling[J].Colloids Surf B Biointerfaces，2008，65(1):113.

[13]顏承農(nóng)，童金強(qiáng)，熊丹，等.熒光光譜法研究培氟沙星與牛血清白蛋白結(jié)合反應(yīng)特征[J].分析化學(xué)，2006，34(6):796.

[14]Leckband D.Measuring the forces that control protein interactions[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct，2000，29:1.

[15]Ross PD，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions:forces contributing to stability[J].Biochemistry，1981，20(11):3096.

[16]夏盛杰，倪哲明，于尚琴，等.卡托普利插層鋅鋁水滑石的超分子結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性及緩釋性能研究[J].無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(10):1747.

[17]曹根庭，邢方方，王平，等.藥物-無(wú)機(jī)復(fù)合材料姜黃素嵌入鎂鋁水滑石的合成、表征及緩釋性能的研究[J].無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(6):956.

[18]Chunyan W，Alireza J，Mehdi G，et al.A pH-sensitive molecularly imprinted nanospheres/hydrogel composite as a coating for implantable biosensors[J].Biomaterials，2010，31(18):4944.