陸 合，張碧波，羅雪蓮

(1.重慶醫(yī)科大學微生物教研室，重慶400016;2.重慶文理學院生命科學系，重慶402168)

陸 合1，張碧波2，羅雪蓮2

(1.重慶醫(yī)科大學微生物教研室，重慶400016;2.重慶文理學院生命科學系，重慶402168)

豆豉是中國古老的食品。研究表明:利用毛霉發(fā)酵豆豉生產(chǎn)GLA是可行的，最佳的接種量為每10g煮熟的大豆接種5.3×107個孢子，發(fā)酵最適溫度26℃，最佳豆豉曲發(fā)酵時間為72～96h，豆豉曲后發(fā)酵8d時獲得含量比較平穩(wěn)的γ－亞麻酸。在研究的最佳條件下發(fā)酵豆豉，能獲得3倍于傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的GLA。

γ－亞麻酸，豆豉，毛霉，發(fā)酵

GLA(gamma－linolenic acid GLA;18∶3Δ6，9，12)作為人體前列腺素類、白三烯、血栓素等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)，具有降低膽固醇、血壓、血粘度等作用，作為一類功能性食品原料已廣泛用于醫(yī)藥、食品等方面［1］。由于植物生產(chǎn)脂肪酸受到季節(jié)、環(huán)境等多因素限制［2］，利用微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸就成為新的發(fā)展方向。國內(nèi)外對微生物生產(chǎn)不飽和脂肪酸都已進行了大量研究［3－5］，其中部分菌株已開始用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)GLA，如深黃被孢霉(Mortierella isabelline)、毛霉(Mucor)［6－7］。但這些研究和生產(chǎn)主要集中在通過微生物發(fā)酵獲得多不飽和脂肪酸后，再分離提純多不飽和脂肪酸，添加到食品中去。由于分離提純多不飽和脂肪酸的成本大、難度高以及生產(chǎn)菌株本身的安全性等問題，使得微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的運用受到限制。豆豉作為我國一種古老的食品已經(jīng)被人們普遍接受，根據(jù)發(fā)酵微生物的不同可以分為細菌類型(山東地區(qū))，毛霉型(重慶永川)和曲霉型(廣東陽江)3種，雖然生產(chǎn)地方和方式不一樣，但它們之間僅有一些小的風味區(qū)別［8］。由于在豆豉中發(fā)現(xiàn)了抗氧化、抗菌的物質(zhì)，從而使得豆豉的價值大大提高，但還遠遠不夠［9］。如何進一步開發(fā)和提高豆豉中的生物活性物質(zhì)成為當前研究的重點。Kim和Li等［10－11］通過對中國國內(nèi)常見豆豉品種進行成分分析，在商品豆豉中發(fā)現(xiàn)了多種不飽和脂肪酸，但并沒有發(fā)現(xiàn)GLA。汪晨輝、章銀良［12－13］等人都曾報道過利用毛霉屬菌株發(fā)酵生產(chǎn)GLA，永川豆豉恰好屬于毛霉型，發(fā)酵過程中主要是毛霉在起作用，這就意味著利用毛霉菌株發(fā)酵豆豉生產(chǎn)GLA是可行的。本研究通過在豆豉發(fā)酵中接種具有食品安全級的總狀毛霉，調(diào)整豆豉發(fā)酵的條件，最終在大眾食品豆豉中獲得了較高的GLA，降低了GLA的生產(chǎn)成本，使其能在直接食用豆豉的同時獲得GLA，為開發(fā)和提高豆豉的品質(zhì)提供了新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

總狀毛霉Mucor racemosus CICC3039 從中國工業(yè)微生物菌種保存管理中心購買，利用固態(tài)PDA培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接活化后，轉(zhuǎn)入麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(每升水含麥芽膏粉130g，氯霉素0.1g，瓊脂15g)，30℃培養(yǎng)3d待用;麥角固醇、γ－亞麻酸標樣 購自Sigma公司;其他試劑 購自國藥化學試劑公司。

氣相色譜儀GC－2010 島津公司;752S可見紫外分光光度計。

1.2 豆豉的發(fā)酵生產(chǎn)

豆豉的生產(chǎn)參照周玉蘭的方法進行［14］。

1.2.1 原料處理 取上等黃豆1000g，用水洗去混有的砂粒雜質(zhì)等，將其在40℃熱水中浸泡120min后，常壓下蒸煮150min。

1.2.2 豆豉曲的制作 蒸煮后大豆出鍋，冷卻至35℃左右，進行接種。接種的方法可以是自然接種或者是人工接種總狀毛霉M.racemosus 3039的菌絲體或孢子，人工接種量為0.4%。拌勻后放入制曲容器簸箕后轉(zhuǎn)入烘箱，保持箱溫26℃，每隔6h觀察，20h后進行第一次翻曲，28h后進行第二次翻曲，制曲期間通過翻曲嚴格控制曲溫。制曲總時間為4d。

1.2.3 豆豉的后發(fā)酵 發(fā)酵成熟的豆豉曲中加入12%的鹽，混勻后裝入陶罐中至八、九成滿，層層壓實，置于28～32℃恒溫室中保溫發(fā)酵，發(fā)酵時間控制在15d左右。

1.3 菌絲體生物量的測定

依照姜緒林等人的方法［15］，精確稱取0.1g菌絲，放入25mL比色管中，加入10mL醇堿混合液，在恒溫水浴中反應1.5h。冷卻、離心后，取上清液沸水浴中將乙醇蒸盡，然后再加入10mL無水乙醚，充分振蕩，萃取2h。吸取上層乙醚層，將乙醚蒸盡后，用無水乙醇溶解并定容至10mL。用紫外分光光度計在波長282nm處進行比色，測定OD值。與測定的麥角固醇含量標準曲線進行比對，最終得到菌絲體的量。

1.4 脂肪酸的甲酯化及氣相色譜分析

參照劉莉等人的方法［16］。將豆豉曲或后發(fā)酵好的豆豉用研缽研粹后，用石油醚∶乙醚(1∶1)的有機混合溶劑浸提1d后，用5%的KOH－甲醇液進行酯化，用島津公司生產(chǎn)的氣相色譜儀GC－2010，進行氣相色譜分析。分析條件為載氣壓力 150kPa，柱溫220℃，進樣溫度250℃，F(xiàn)ID250℃。GLA的含量采用面積歸一法和內(nèi)標法。

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方法對豆豉產(chǎn)GLA的影響

豆豉生產(chǎn)中，手工作坊通常采用的是自然接種方式，這導致豆豉的風味和品質(zhì)存在極大差異。所以要想提高豆豉的生產(chǎn)水平、穩(wěn)定豆豉的風味與品質(zhì)、使豆豉中GLA的含量穩(wěn)定，就必須對豆豉發(fā)酵的接種方法進行相應的調(diào)整，固定接種方法。目前在豆豉曲的生產(chǎn)過程中人工接種方法有孢子和菌絲體接種二種，GC分析發(fā)現(xiàn)，利用不同的接種方法，產(chǎn)生的GLA不一樣。從表1可以看出，用5.0×106個總狀毛霉孢子和與孢子濃度相當?shù)木z體分別接種每10g大豆后，在同樣的豆豉曲發(fā)酵時間內(nèi)，孢子接種比用菌絲體接種后產(chǎn)生的GLA要高一半，所以在后面的優(yōu)化中就使用人工的孢子接種方法。

表1 接種方式對豆豉中GLA含量的影響

2.2 接種量大小對豆豉曲中GLA的影響

在表2中，可以明顯看到在接種生產(chǎn)豆豉曲的過程中，同等發(fā)酵條件下接種量的大小也同樣會影響到豆豉曲中GLA的量，在營養(yǎng)充足的條件下，加大接種量有利于提高豆豉曲中總狀毛霉的生物量，進而能加大豆豉曲中GLA的含量。當接種量為5.3×107個/10g時，產(chǎn)生的GLA量最多。

表2 接種量對豆豉曲中GLA含量的影響

2.3 制曲時間對豆豉曲中GLA的影響

豆豉曲生產(chǎn)的好壞是整個豆豉發(fā)酵中的重點。從圖1可以看出，在不同生長溫度下，隨著發(fā)酵時間的延長，總狀毛霉的生物量都表現(xiàn)為增長。發(fā)酵4～5d時，菌絲體的生長進入對數(shù)生長末期，發(fā)酵溫度在26℃時菌絲體的生物量最大。通過圖1、圖2看到，GLA在豆豉曲中的含量隨著生物量的生長而逐漸增加。發(fā)酵到第4d時，除22℃外，其他培養(yǎng)溫度的GLA量都已經(jīng)達到最高，因此把豆豉曲的制曲時間定在4d。

圖1 不同發(fā)酵溫度對菌絲體生物量的影響

圖2 不同發(fā)酵溫度對GLA的影響

2.4 后發(fā)酵時間對豆豉中GLA的影響

后發(fā)酵生產(chǎn)是豆豉制作的最后一道工序，這時由于所加食鹽的抑制，使得總狀毛霉菌絲體的生長基本上處于停頓。所以這時的GLA含量不會表現(xiàn)出明顯的增加，相反由于高鹽的脅迫，GLA的含量肯定會隨著后發(fā)酵時間的延長而降低。從圖3可以發(fā)現(xiàn)，隨著后發(fā)酵時間的延長，豆豉中的GLA量呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。特別是在后發(fā)酵8d后GLA的含量出現(xiàn)了明顯的下降。如果繼續(xù)延長后發(fā)酵時間，包括商品豆豉還要在貨架上放置較長的時間，到最后豆豉中GLA的含量完全可能趨于零。這可能就是在商品豆豉中沒有發(fā)現(xiàn)GLA的原因之一。所以我們在綜合考慮豆豉的品質(zhì)和GLA的含量后，將后發(fā)酵時間定在8d內(nèi)。

表3 新工藝豆豉產(chǎn)GLA與其它產(chǎn)GLA的比較

圖3 后發(fā)酵時間對GLA量的影響

2.5 豆豉產(chǎn)GLA與其它方法產(chǎn)GLA的比較

對如何利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)GLA，已經(jīng)進行了菌種篩選、誘變和優(yōu)化發(fā)酵條件等研究。通過表3可以看到，將豆豉發(fā)酵生產(chǎn)GLA與其它真菌發(fā)酵生產(chǎn)GLA進行比較不難發(fā)現(xiàn)［5，13，18］，利用豆豉生產(chǎn)獲得的GLA含量雖然不是最高，但它能有效避免其它真菌發(fā)酵方法生產(chǎn)后需要高費用的提純過程，同時因為可以直接通過食用豆豉獲得GLA，從而使補充GLA的方法簡單化。

3 討論

國內(nèi)外對利用微生物生產(chǎn)不飽和脂肪酸已進行了大量研究，但研究主要集中在通過微生物獲得多不飽和脂肪酸后，分離、添加到食品中。由于分離提純的成本大、難度高等使得多不飽和脂肪酸的運用受到限制。豆豉作為我國一種古老的食品已經(jīng)被人們普遍接受，生產(chǎn)工藝比納豆復雜，已在豆豉中發(fā)現(xiàn)抗氧化、抗菌等多種活性物質(zhì)存在，但由于手工作坊生產(chǎn)工藝落后，導致傳統(tǒng)生產(chǎn)豆豉的方法均存在著質(zhì)量不穩(wěn)定、發(fā)酵周期長等缺點。如何進一步開發(fā)、提高、穩(wěn)定豆豉中的生物活性物質(zhì)成為當前研究的重點。

總狀毛霉菌株屬于毛霉屬，是一類食品安全性較高的微生物，主要用于生產(chǎn)豆豉、豆腐乳等。目前已有利用不同毛霉屬菌株直接發(fā)酵生產(chǎn)γ－亞麻酸的報道，但大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的工藝尚在研究中。本研究通過在豆豉發(fā)酵中接種具有食品安全級的總狀毛霉，調(diào)整豆豉發(fā)酵的條件，最終在大眾食品豆豉中獲得了較高的GLA，降低了GLA的生產(chǎn)成本，使其在直接食用豆豉的同時獲得GLA，為開發(fā)和提高豆豉的品質(zhì)提供了新的證據(jù)。

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Study on production of γ－linolenic acid(GLA)by Douchi using Mucor racemosus

LU He1，ZHANG Bi－bo2，LUO Xue－lian2
(1.Department of Microbiology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China;2.College of Life Sciences，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing 402168，China)

Douchi is a popular oriental food in China.The studies showed that production of γ－linolenic acid by Douchi using Mucor racemosus was feasible.The optimal amount of inoculums was 5.30×107spores/10g cooked soybean.The optimal temperature for fermentation was about 26℃，GLA content plateau could be obtained between 72h and 96h during the fermentation of Douchiqu then 8d of post－fermentation.Under the optimal fermentation conditions，GLA content in Douchi was over 3 times than that of the traditional spontaneous inoculums fermentation process.Key words:γ－linolenic acid;Douchi;Mucor.sp;fermentation

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0201－03

2010－03－24

陸合(1978－)，男，講師，主要從事分子微生物研究。