李彥媚 葉鐵真 賴冬波 何映誼 林慧玲

目前，隨著治療方法的進步，90%以上的兒童急性淋巴細胞白血病(ALL)在誘導化療后可獲得完全緩解(CR)，并有70%～80%可獲得5年持續(xù)完全緩解(CCR)。然而，仍有20%～30%患兒在緩解后復發(fā)，這與體內(nèi)仍然存在形態(tài)學上無法檢測的殘留白血病細胞，即微小殘留白血病(MRD)有關。大量研究證明，MRD是最能反映個體治療效果和預后情況的指標之一，也是引起白血病復發(fā)的最主要原因之一。在白血病治療過程中準確檢測MRD并分析其意義，對臨床追蹤病情和判斷預后，并據(jù)此制定更具針對性的個體化治療方案等，具有重要意義[1]。

RQ-PCR檢測免疫球蛋白(Ig)/T細胞抗原受體(TCR)基因重排是目前定量追蹤ALL-MRD的可靠方法[2,3]。本研究以RQ-PCR檢測[4,5]Ig/TCR基因重排，監(jiān)測廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(我院)收治ALL患兒在治療過程中MRD的變化趨勢，以評價該方法在兒童ALL中的應用價值。

1 方法

1.1 納入標準 ①2009年3月至2011年3月在我院血液腫瘤科初診和治療的ALL患兒；②均經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學[6]和免疫分型診斷[7]；③以廣東地區(qū)兒童ALL 2008化療協(xié)作組方案(GD2008ALL)進行危險度分型及化療[8]；④采集的骨髓樣本除用于細胞學檢測外的剩余標本被用于Ig/TCR基因重排檢測。

1.2 倫理審核 本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。

1.3 隨訪觀測時點 以下時間點采集骨髓標本用于臨床評估：①初診時(0個月)；②誘導緩解治療末d33(隨訪1個月)；③鞏固治療前(隨訪2個月)；④早期強化治療前(隨訪4個月)；⑤維持治療前(隨訪6 個月)；⑥維持治療階段(由維持治療開始后每90天隨訪1次)。連續(xù)隨訪至早期強化治療前的患兒進入分析。以上時間同時檢測Ig/TCR基因重排表達量。

1.4Ig/TCR基因重排檢測

1.4.1 標本處理 骨髓標本以Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞，并使用分離柱試劑盒(購自中國TRANSGEN公司)提取單個核細胞DNA。

1.4.2 PCR檢測初診患兒Ig/TCR基因重排 ①選取歐洲Biomed-1和Biomed-2研究中的12對引物(表1)，以PCR擴增每例初診ALL患兒骨髓標本的IgH、Igκ、TCRγ和TCRδ基因重排[9,10]。PCR反應體系包括PCR MixBuffer (10×)5.0 μL(日本TOYOBO公司)、上下游引物(由廣州英駿生物公司合成)各70 pmol、模板DNA 100 ng，加去離子水至終體積50 μL。PCR反應條件：94℃ 7 min；94℃30 s，60℃ 45 s，72℃ 90 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。每次反應均設陽性對照(Jurkat細胞或Reh細胞DNA)、陰性對照(正常人DNA)和空白對照(以雙蒸水取代模板DNA)；②1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

表1 PCR檢測Ig/TCR基因重排的引物序列

Tab 1 Sequence of primers forIg/TCRgene rearrange-ments detection

PrimerSequenceIgHVH1/VH7-F5'-CCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG-3'VH3-F5'-GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA-3'VH4-F5'-TCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGC-3'JH-R5'-ACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3'IgkVk1-F5'-GTAGGAGACAGAGTCACCATCACT-3'Vk2-F5'-TGGAGAGCCGGCCTCCATCTC-3'Vk3-F5'-GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG-3'Vk4-F5'-GGCGAGAGGGCCACCATCAAC-3'Kde-R5'-CCTCAGAGGTCAGAGCAGGTTGTCCTA-3'TCRδVδ2-F5'-GGACATCGAGTCATGTCAGCC-3'Dδ2-F5'-AGAAGAGGGTTTTTATACTGATGTG-3'Dδ3-R5'-AGGGAAATGGCACTTTTGCC-3'TCRγVγ1-F5'-CAGGCCGACTGGGTCATCTGC-3'Vγ2-F5'-CAGCCCGCCTGGAATGTGTGG-3'Vγ4-F5'-CTGAAATATCTATTTCCAGACCAGC-3'Jγ1.3/2.3-R5'-AATGTTGTATCTTCCGATACTTACC-3'albuminabm-F5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'abm-R5'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTT-3'

Notes F：forward primer；R：reverse primer，reverse primer labeled with FAM at 5′ site

1.4.3 基因掃描分析Ig/TCR基因重排產(chǎn)物克隆特性[10]①取上述PCR的陽性產(chǎn)物1 μL，加入9.5 μL甲酰胺和0.5 μL Genescan-500熒光標記分子量標準品(美國ABI公司)，置于PCR儀上反應，95℃ 2 min，4℃ 60 min，以形成異源雙鏈DNA；②將異源雙鏈DNA置基因掃描儀(美國ABI公司)上檢測，使用儀器配置的軟件分析Ig/TCR基因重排的克隆性。

1.4.4 RQ-PCR檢測Ig/TCR基因重排相對表達量 ①對經(jīng)上述基因掃描鑒定為單克隆的PCR產(chǎn)物進行測序；②將測序結果輸入IMGT數(shù)據(jù)庫(http://imgt.cines.fr/imgt-vquest/ share/ textes/)進行同源性比對，確定每例患兒特異的Ig/TCR基因重排序列，以此序列為MRD追蹤靶目標，在Primer 3.0軟件中設計特異性引物，根據(jù)IgH、Igκ、TCRγ、TCRδ基因的J片段保守序列設計探針[11]；③用正常人DNA將初診患兒骨髓DNA(600 ng)梯度稀釋至1.0×10-1～1.0×10-6濃度以建立Ig/TCR基因重排的標準曲線；以去離子水將正常人DNA梯度稀釋至1 000、500、100、50和10 ng以建立內(nèi)參基因albumin的標準曲線。RQ-PCR反應體系見表2，反應條件：95℃ 60 s；95℃ 15 s，60°C 60 s，共40個循環(huán)，退火溫度可根據(jù)特異性引物Tm值調(diào)整。③對各觀察時間標本以標準曲線計算Ig/TCR基因重排表達量。每份樣本設2個復管，同時以albumin基因為陽性對照、正常人DNA為陰性對照和雙蒸水為空白對照。以Ig/TCR基因重排的表達量與albumin管基因表達量之比，即Ig/TCR基因重排的相對表達量反映MRD水平。

表2 RQ-PCR反應體系(μL)

Notes NC: negative control; PC: positive control; F：forward primer；R：reverse primer

1.5 研究指標的定義 ①臨床危險度：誘導治療前按GD2008ALL方案[8]分為高危(HR)、標危(SR)和中危(IR)。②Ig/TCR基因重排表達量危險度分期：在誘導緩解治療結束時(d33)劃分危險度：Ig/TCR基因重排相對表達量<1.0×10-4為SR，～1.0×10-3為IR,≥1.0×10-3為HR；③MRD陰性：Ig/TCR基因重排相對表達量<1.0×10-4；④ CCR：經(jīng)治療獲得完全緩解后，持續(xù)3～5年或更長時間無復發(fā)者。⑤復發(fā)：治療達到緩解后發(fā)生以下任一項：a.骨髓原始細胞+幼稚細胞>0.05但<0.20，經(jīng)過有效抗白血病治療1個療程仍未達到骨髓CR標準者；b.骨髓原始細胞+幼稚細胞≥0.20者；c.骨髓外白血病浸潤者。

2 結果

2.1 一般情況 86例初診ALL患兒進入分析，其中男52例，女34例；年齡1～13(4.3±3.0)歲；1～5歲63例，≥6歲23例；L1型50例，L2型30例，L3型6例；B-ALL 76例，T-ALL 10例； 臨床危險度SR 28例，IR 40例和HR 18例。隨訪至2011年4月30日，隨訪時間1～26(14.3±7.0)個月，復發(fā)5例(5.8%)。

2.2 初診ALL患兒Ig/TCR基因重排的總檢出率 86例初診ALL患兒中，83例(96.5%)檢出1種或以上Ig/TCR基因重排，共檢出209個Ig/TCR基因重排，平均每例檢出2.52個。1種基因重排者占13.2%(11/83例)；同時存在2、3和4種Ig/TCR基因重排分別為34.9%(29例)、38.6%(32例)和13.2%(11例)。4種Ig/TCR基因重排的比例依次為IgH80.7%(67例)、TCRδ67.5%(56例)、Igκ55.4%(46例)和TCRγ49.4%(41例)。

2.3 初診患兒Ig/TCR基因重排的克隆特性 83例檢出Ig/TCR基因重排的病例中，根據(jù)患兒來院隨訪條件最大限度的依從性，61例患兒的172個Ig/TCR基因重排行基因掃描。56/61例(91.8%)可檢出1種或以上單克隆性Ig/TCR基因重排；172個Ig/TCR基因重排中，單克隆性、寡克隆性和多克隆性Ig/TCR基因重排的檢出率分別為58.1%(100個)、30.8%(53個)和11.0%(19個)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

2.4 隨訪患兒Ig/TCR基因重排相對表達量 26/56例單克隆性Ig/TCR基因重排患兒完成連續(xù)3次隨訪，其中22例CCR和4例復發(fā)。如表3所示，22例CCR患兒初診時Ig/TCR基因重排的相對表達量為2.70×10-1±2.55×10-1，誘導緩解治療結束時d33降至9.91×10-4±2.08×10-3，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；在鞏固治療開始前，Ig/TCR基因重排的相對表達量進一步下降至7.85×10-5±2.76×10-4，與誘導緩解結束時d33比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036)；其后至維持治療9個月期間，各檢測時點Ig/TCR基因重排相對表達量在1.0×10-5～1.0×10-6，與相近上個隨訪時點比較差異均無統(tǒng)計學意義；在維持治療12個月后，均未檢出Ig/TCR基因重排相對表達量。

表3 22例CCR患兒不同治療時點的Ig/TCR基因重排相對表達量

Notes m: month; 1)vsinitial; 2)vsd33; 3)compared with the last follow-up point

表4顯示，4例復發(fā)患兒初診時Ig/TCR基因重排相對表達量均>1.0×10-1；在誘導緩解治療結束時(d33)均明顯下降，處于同期CCR病例水平。例1Ig/TCR基因重排相對表達量在早期強化治療前開始升高，其后繼續(xù)升高，并一直維持在同期CCR病例的均值水平以上，至維持治療6個月時骨髓復發(fā)，從回升至骨髓復發(fā)為8個月；例2的Ig/TCR基因重排相對表達量在誘導緩解治療結束時(d33)至早期強化治療前呈下降趨勢，但一直高于同期CCR病例水平，至維持治療前開始回升，在維持治療3個月時出現(xiàn)骨髓復發(fā)，從回升至骨髓復發(fā)為3個月；例3和4Ig/TCR基因重排的相對表達量在鞏固治療前回升至同期CCR病例水平以上，均在早期強化前即出現(xiàn)骨髓復發(fā)，從回升到骨髓復發(fā)均為2個月。復發(fā)病例4經(jīng)再予誘導緩解治療后，Ig/TCR基因重排表達量降至8.66×10-4。4例患兒Ig/TCR基因重排的相對表達量開始回升至臨床復發(fā)的平均時間為3.75(2～8)個月。

表4 4例復發(fā)患兒不同治療時點的Ig/TCR基因重排相對表達量

Notes m: month; red fonts indicated relapse

2.4 臨床危險度與Ig/TCR基因重排劃分危險度的關系 表5顯示，26例隨訪患兒誘導治療結束時(d33)根據(jù)Ig/TCR基因重排相對表達量劃分危險度，SR 10例(38.5%)，IR 12例(46.2%)，HR 4例(15.4%)；誘導治療前SR 7例(26.9%)，IR 13例(50.0%)，HR 6例(23.1%)。兩者分級一致11例(42.3%)，其中SR 4例、IR 5例、HR 2例。

4例復發(fā)患兒初診時IR 3例，SR 1例；根據(jù)Ig/TCR基因重排相對表達量重新劃分危險度，例3原為SR調(diào)整為IR(Ig/TCR基因重排相對表達量為8.00×10-4)，例2原為IR調(diào)整為HR(Ig/TCR基因重排相對表達量為1.20×10-3)，例1和4的分級不變。

表5 臨床危險度分級與根據(jù)Ig/TCR基因重排相對表達量劃分危險度分級結果(n)

Tab 5 Comparison of risk stratification by clinical data andIg/TCR(n)

Ig/TCRriskClinicalriskSRIRHRSR460IR354HR022

Notes SR: standard risk; IR: intermediate risk; HR: high risk

3 討論

3.1 聯(lián)合檢測多種Ig/TCR基因重排可保證檢出率 文獻報道，Ig/TCR基因重排在兒童和成人ALL中均具有極高的檢出率，97%以上B-ALL患者可檢出1種Ig/TCR基因重排[12]。歐洲白血病治療協(xié)作組通過Biomed-1和Biomed-2研究，已建立了PCR檢測Ig/TCR基因重排的通用引物系統(tǒng)，該系統(tǒng)所使用的引物共108對，Ig/TCR基因重排的檢出率達到100%。但該系統(tǒng)引物數(shù)量較多，不利于其臨床應用。Szczepański等[13]選用Biomed-1引物系統(tǒng)中的25對引物檢測96例初診B-ALL患兒的IgH、Igκ、TCRδ和TCRγ基因重排，結果顯示98%患兒可檢出Ig/TCR基因重排。本研究初診ALL患兒Ig/TCR基因重排的檢出率達96.5%，提示通過聯(lián)合檢測多種Ig/TCR基因重排，既可減少引物的數(shù)量，同時又可獲得較高的檢出率，這可能更適合兒科臨床實際，提高臨床應用的可行性。

3.2 基因掃描可有效篩選出不同克隆特性的Ig/TCR基因重排 寡克隆性基因重排在兒童B-ALL中常見，其中寡克隆性IgH和TCRδ基因重排發(fā)生率為30%～40%[13]；并且不同克隆來源的基因重排在白血病治療過程中可發(fā)生優(yōu)勢變化，若以寡克隆性基因重排作為MRD檢測的靶目標，則可因為隨訪過程中靶目標的丟失，使MRD檢測出現(xiàn)假陰性結果。因此，多個研究機構均建議初診時應對Ig/TCR基因重排進行克隆性分析[5,11,13]，首選單克隆性基因重排作為MRD檢測的靶目標。本研究采用基因掃描方法，對ALL患兒的Ig/TCR基因重排PCR產(chǎn)物進行克隆性分析，結果符合白血病淋巴細胞Ig/TCR基因重排的克隆特點，提示基因掃描可準確分析Ig/TCR基因重排的克隆性，有效篩選出不同克隆特性的Ig/TCR基因重排。

3.3Ig/TCR基因重排可評價療效和判斷預后 本研究22例CCR患兒的Ig/TCR基因重排相對表達量在誘導治療后明顯下降，并隨著治療時間的延長而持續(xù)下降，直至陰性。Li等[14]用RQ-PCR擴增Ig/TCR基因重排，對36例誘導緩解化療d29的B-ALL患兒進行MRD定量檢測，MRD水平≥1.0×10-3與復發(fā)顯著相關(P=0.002 5)。Zhou等[15]以RQ-PCR檢測284例B-ALL患兒Ig/TCR基因重排，誘導治療結束時Ig/TCR基因重排相對表達量<1.0×10-3者5年復發(fā)風險為12%，≥1.0×10-3者為72%。Ryan等[16]分別在誘導治療15 d、鞏固治療、強化治療結束等時間點檢測Ig/TCR基因重排相對表達量，發(fā)現(xiàn)以上各時點的MRD水平均與復發(fā)顯著相關，尤其≥1.0×10-3者在短期內(nèi)有復發(fā)傾向。本研究中4例復發(fā)的ALL患兒，復發(fā)前Ig/TCR基因重排相對表達量均已回升，從開始回升至復發(fā)的平均時間為3.75(2～8)個月，并在復發(fā)時Ig/TCR基因重排相對表達量均升至1.0×10-2以上；提示Ig/TCR基因重排相對表達量下降后又重新回升，有預示復發(fā)的意義，對此部分患兒應加強監(jiān)測或調(diào)整治療。

本研究在誘導治療后根據(jù)Ig/TCR基因重排表達量劃分危險度，15/26例與初診時的危險度分級不一致，其中4例復發(fā)患兒誘導化療結束時，以Ig/TCR基因重排相對表達量重新劃分危險度，1例原為IR調(diào)整為HR，1例SR患兒調(diào)整為IR，即2例患兒的危險度升級。提示在誘導緩解治療結束時，按Ig/TCR基因重排相對表達量重新劃分危險度可準確地評價療效、判斷預后。

3.4 本研究的不足之處和局限性 ①由于患兒入組時間不一致，部分患兒未完成本研究設定的連續(xù)3次隨訪；同時部分患兒失訪，導致本研究進入Ig/TCR基因重排相對表達量動態(tài)分析的樣本量不多；②納入復發(fā)患兒僅4例，因此無法按B-ALL 和T-ALL進一步分析。

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