朱錦輝 裘華森

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,浙江 杭州 310006)

人工血管是重要的血管移植物,已被廣泛地用于血管重建。但在人工血管置換病變的靜脈和口徑小于6mm的動脈時,常因腔內(nèi)血栓形成而閉塞。其主要原因是人工血管不具備與自體血管相同的內(nèi)膜和內(nèi)皮細胞(EC)。研究表明,在人工血管內(nèi)壁種植內(nèi)皮細胞,使其早期快速內(nèi)皮化,可以改善移植血管的通暢性[1],但種植的單層內(nèi)皮細胞往往粘附力差,在血流的沖擊下容易脫落[2]。提高內(nèi)皮細胞的黏附性有著重要意義。本研究采用bFGF預(yù)處理人工血管用再種植內(nèi)皮細胞,以期提高內(nèi)皮細胞的保存率?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 3月齡新西蘭白兔6只,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供,實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 內(nèi)皮細胞取自人大隱靜脈,用標(biāo)準酶分離技術(shù)和細胞培養(yǎng)技術(shù)[1]。在細胞培養(yǎng)過程中,在培養(yǎng)液中加入含lacZ基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,使內(nèi)皮細胞事先載入lacZ基因,可通過X-gal染色確認內(nèi)皮細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體保存于293T/17包裝細胞(美國ATCC公司),采用含10%胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)和2mol/L的DMEM 131培養(yǎng)基(Hyclone公司)包裝細胞,并擴增逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

1.2.2 人工血管 選用聚四氟乙烯人工血管(PTFE)(IMPRA,Inc·,AZ)6根,內(nèi)徑 4mm,試驗組3根經(jīng)bFGF溶液(北京鑫琪百奧公司)預(yù)襯處理,即在人工血管腔內(nèi)加壓灌注bFGF溶液(0.1 mg/mL),直至外壁出現(xiàn)“冒汗”現(xiàn)象;對照組3根人工血管不予處理。

1.2.3 細胞種植 兩組人工血管內(nèi)分別注入內(nèi)皮細胞懸浮液(3×105cells/mL),二端加熱封閉,在37℃條件下,以每10分鐘1次轉(zhuǎn)動人工血管共2小時,使細胞均勻附著排列于內(nèi)壁。然后剪開封閉口,將此人工血管放入DMEM 131培養(yǎng)液中孵育24小時。使內(nèi)皮細胞在內(nèi)壁黏附生成完成細胞種植。

1.2.4 體內(nèi)灌注試驗 實驗用3月齡新西蘭白兔隨機分為2組,每組各3只,取EC種植的人工血管2/3段植入兔腹主動脈,采用血管旁路方式,術(shù)中注意避免損傷人工血管內(nèi)壁上的細胞,手術(shù)前后給予適當(dāng)抗凝劑,術(shù)后應(yīng)用甲基潑尼松龍抑制急性排斥反應(yīng),植入2小時后取出觀察。

1.2.5 細胞計數(shù)檢查 體內(nèi)灌注前后各取人工血管標(biāo)本3段,縱形剖開,磷酸緩沖液輕柔漂洗,10%甲醛固定,X-半乳糖苷染色顯示種植的內(nèi)皮細胞,相差顯微鏡(40倍)計數(shù)內(nèi)皮細胞,每段隨機取10個視野計數(shù),共30個視野,計算其平均值。

2 結(jié) 果

細胞種植后內(nèi)皮細胞密度觀察 對照組未經(jīng)任何預(yù)襯處理的人工血管,細胞種植成功率低,內(nèi)皮細胞密度僅為(167±14)cell/mm2。試驗組經(jīng)bFGF預(yù)襯處理的人工血管,內(nèi)皮細胞種植后,人工血管內(nèi)壁內(nèi)皮細胞密度達到(364±19)cells/mm2,見表1。

體內(nèi)循環(huán)灌注實驗 在兔腹主動脈灌注2小時后,人工血管內(nèi)種植的細胞均有脫落現(xiàn)象,其中單純內(nèi)皮細胞種植組71%細胞脫落,而bFGF預(yù)襯處理EC種植組僅有38%內(nèi)皮細胞脫落,該種植組細胞保存率達62%,明顯高于單純內(nèi)皮細胞種植組29%(P＜0.01),見表1。

表1 灌注前后人工血管腔面種植細胞密度和保存率比較±s)

表1 灌注前后人工血管腔面種植細胞密度和保存率比較±s)

與對照組比較**P＜0.01

組 別 n 細胞數(shù)(cells/mm2)灌流前 灌流后保存率(%)對照組 30 167±14 48±19 29±14試驗組 30 364±19 226±27 62±22**

3 討 論

血管內(nèi)皮細胞具有防止血液凝固和血栓形成的作用,并且內(nèi)皮愈合能夠減輕吻合口內(nèi)膜增生程度。人工血管腔面內(nèi)皮細胞種植和早期快速內(nèi)皮化有利于維持管腔通暢[2]。但是由于種植的內(nèi)皮細胞黏附性差,容易被血流沖脫,實際應(yīng)用效果不佳[3]。因此,提高內(nèi)皮細胞的粘附性有著重要意義,目前主要途徑有:(1)預(yù)襯纖維結(jié)合素等細胞外基質(zhì)[4];(2)人工血管表面進行化學(xué)修飾,摻入RGD等特異性的細胞附著肽鏈序列[5]。這些方法顯示了一定的作用,但效果欠佳,不能普遍應(yīng)用。

堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是一種廣泛存在于人體各種組織中的生物活性物質(zhì)。它被認為是血管生成刺激物、成纖維細胞增殖趨化因子、成肌細胞、角膜細胞、神經(jīng)細胞生長的刺激物等。除了能促進內(nèi)皮細胞在細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)上粘附和轉(zhuǎn)移外,bFGF還具有促進內(nèi)皮細胞增殖、促進內(nèi)皮細胞合成ECM成分以及趨化等作用,從而有利于細胞的附著固定[6]。

本研究在內(nèi)皮細胞種植前,先用bFGF溶液預(yù)襯處理人工血管,以提高內(nèi)皮細胞的粘附性和保存率。由于體內(nèi)血管中血流方式復(fù)雜,呈脈沖性層性流動、渦流和2次流等,對血管壁的作用很大,因此對于觀察內(nèi)皮細胞在人工血管中的粘附性是否提高有更實際的意義。本實驗將種植內(nèi)皮細胞后的兩組人工血管分別植入兔腹主動脈,模仿人體血流的生理狀態(tài),分析比較在復(fù)雜的血流切力作用下,bFGF預(yù)襯處理提高內(nèi)皮細胞保存率的情況。

結(jié)果顯示,未用bFGF處理的對照組,無論是種植細胞密度還是在兔腹主動脈血流作用下的細胞保存率均低于bFGF預(yù)襯處理組,故bFGF預(yù)襯處理人工血管不僅可以明顯提高初期的種植效果,提高靜態(tài)培養(yǎng)條件下人工血管壁的內(nèi)皮細胞密度,而且可以提高脈沖灌注情況下EC的保存率。

有研究表明,bFGF還能逆轉(zhuǎn)缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞增殖能力下降[7]。因此,在種植細胞過程中更有效的保證了內(nèi)皮細胞的增殖和分化,從而有利于內(nèi)皮細胞在血管表面的均勻分布。血液流動產(chǎn)生的流體剪切應(yīng)力影響內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能,內(nèi)皮細胞可通過形態(tài)變化、相關(guān)細胞粘附分子基因表達及纖維產(chǎn)生等反應(yīng),以承受高剪切應(yīng)力的需要[5]。本實驗中bFGF預(yù)處理提高內(nèi)皮細胞在人工血管上的粘附性,其機制可能是上調(diào)了β1整合素,該整合素通過介導(dǎo)內(nèi)皮細胞間的連接和內(nèi)皮細胞與細胞外基質(zhì)間的信號導(dǎo)以及作為一種細胞表面手提介導(dǎo)內(nèi)皮細胞與ECM的粘附,從而使細胞牢固附著在基底膜上,耐受血流切應(yīng)力的沖擊[8-9]。

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