閆明先，趙華清，王文奇，王亞茹，劉長虹，張梅娟

(1山東大學(xué)附屬山東省千佛山醫(yī)院，濟(jì)南250014;2濟(jì)南國際機(jī)場醫(yī)療急救中心)

近年研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起的高脂血癥已成為胰腺損傷的重要原因之一。盡管諸多研究者觀察到高脂血癥時的胰腺損傷，但迄今為止，高脂血癥時胰腺腺泡細(xì)胞中介導(dǎo)外分泌的信號途徑的變化尚未見報道。2010年7月～2011年10月，我們觀察了高脂血癥大鼠腺泡細(xì)胞內(nèi)信號分子三磷酸肌醇(IP3)變化及其對縮膽囊素(Cholecystokinin，CCK)刺激的淀粉酶釋放的影響，旨在探討高脂血癥對胰腺腺泡細(xì)胞CCK/IP3信號途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量65～75 g，購于山東大學(xué)實驗動物中心。淀粉酶試劑盒和CCK-8分別購自羅氏公司和Sigma公司;IP3檢測試劑盒購自Amersham公司。

1.2 高脂血癥模型的建立 將24只大鼠隨機(jī)分為兩組各12只，觀察組建立高脂血癥模型，予高脂飼料(普通飼料77%，豬油20%，膽固醇3%)飲食，喂養(yǎng)4周，血生化指標(biāo)檢測示膽固醇與甘油三酯水平明顯升高，光鏡下胰腺組織可見部分腺泡細(xì)胞內(nèi)由于脂肪沉積造成的空泡化，伴有輕度淋巴細(xì)胞浸潤。電鏡下可見腺泡細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和胰腺血管內(nèi)皮細(xì)胞破損，證實高脂血癥模型建立成功。期間對照組喂食普通飼料。

1.3 相關(guān)指標(biāo)檢測 ①淀粉酶釋放率:胰腺腺泡細(xì)胞分離培養(yǎng)參考相關(guān)文獻(xiàn)［1］:大鼠胰膽管內(nèi)逆行注射8 mL含0.5 mg/mL膠原酶的稀釋液(pH7.4)，迅速取下胰腺組織置于37℃水浴消化8 min，用力震蕩后200目篩網(wǎng)過篩。10%胎牛血清中和膠原酶，RPMI1640培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min，重復(fù)1次，再用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并制成106/mL細(xì)胞懸液，加入96孔或24孔培養(yǎng)板，置于37℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將大鼠胰腺腺泡細(xì)胞(活力＞90%)與0.01 nmol/L CCK-8共孵育1 h，收集細(xì)胞上清，再用相同體積培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融5次，留取上清，測定淀粉酶含量。淀粉酶釋放率=細(xì)胞上清淀粉酶/(細(xì)胞上清淀粉酶+凍融后細(xì)胞淀粉酶)×100%。②腺泡細(xì)胞IP3水平:參照IP3檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SigmaStat 3.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間數(shù)據(jù)行方差齊性檢驗，獨(dú)立樣本行t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組與對照組淀粉酶釋放率分別為(11.06±3.37)%、(7.35 ±2.18)%，腺泡細(xì)胞 IP3 水平分別為(31.81 ±3.45)、(24.63 ±3.65)pmol/106cells，P 均 ＜0.01。

3 討論

據(jù)報道，高脂飲食可引起腺泡細(xì)胞和胰島β細(xì)胞損傷，導(dǎo)致胰腺內(nèi)、外分泌功能變化，最終發(fā)生胰腺功能障礙和消化不良［2～4］，且高脂飲食后胰腺腺泡細(xì)胞對CCK刺激的敏感性增高，腺泡細(xì)胞凋亡增加［5］。CCK及其受體廣泛分布于胃腸道和中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)［6］，在胰腺分泌、膽囊收縮、胃腸道運(yùn)動及營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收過程中起著重要作用。CCK與胰腺腺泡細(xì)胞的CCK受體結(jié)合后，通過細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起胰酶的分泌和釋放［7，8］。CCK在急性胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，外源性CCK可使實驗性急性胰腺炎加重，死亡率增高［9］，推測主要原因為CCK與胰腺腺泡上的受體結(jié)合，促使胰腺大量分泌胰酶，引發(fā)胰腺自身消化，從而使胰腺炎加重。

CCK-磷脂酶C(PLC)-IP3信號通路與腺泡細(xì)胞外分泌功能相關(guān)，其中IP3是重要信號分子，并參與腺泡細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C(PKC)的激活和細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織內(nèi)IP3增高，并與腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和TNF-α呈正相關(guān)［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食后大鼠出現(xiàn)高脂血癥，胰腺組織出現(xiàn)病理損傷;另外，高脂血癥大鼠的腺泡細(xì)胞在CCK-8刺激下，其淀粉酶釋放明顯增加，與相關(guān)研究結(jié)果一致［11］，說明高脂血癥大鼠的腺泡細(xì)胞外分泌功能發(fā)生變化。另外，觀察組腺泡細(xì)胞內(nèi)IP3水平明顯高于對照組，提示CCK/IP3信號通路在腺泡細(xì)胞的外分泌功能和高脂血癥性胰腺炎發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。其機(jī)制可能為CCK首先與其G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，激活PLC，導(dǎo)致 IP3和二酰甘油(DG)釋放，在DG和Ca2+的共同作用下激活PKC，促使胰腺腺泡細(xì)胞大量分泌胰酶，從而導(dǎo)致胰腺細(xì)胞的自身破壞;CCK還可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的激活，從而進(jìn)一步促進(jìn)炎癥過程［12］。

總之，高脂血癥大鼠胰腺腺泡細(xì)胞CCK/IP3信號通路發(fā)生變化，其信號分子IP3表達(dá)增高，腺泡細(xì)胞對CCK刺激的外分泌敏感性增加，此對進(jìn)一步研究高脂血癥性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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