張一沙 吳穎 范興麗 蔣錦琴 孫愛華

[摘要] 目的 研究解脲脲原體喹諾酮類藥物耐藥機制。 方法 用支原體培養(yǎng)、鑒定和藥敏試劑盒分離獲得77株解脲脲原體并檢測對3種喹諾酮類藥物的耐藥性，同時PCR法擴增臨床分離株的gyrA和parC基因喹諾酮耐藥決定區(qū)并進行測序分析。 結果 對3種喹諾酮均敏感3株，74株至少對1種藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥。gyrA和parC基因喹諾酮耐藥決定區(qū)測序發(fā)現(xiàn)上述敏感株和2株耐藥株不發(fā)生突變，其余72株耐藥株gyrA和parC發(fā)生D112E和/或S83L突變。 結論 解脲脲原體gyrA和parC基因喹諾酮耐藥決定區(qū)突變與耐藥密切相關。

[關鍵詞] 解脲脲原體；gyrA、parC基因；突變；序列分析；耐藥性

[中圖分類號] R446.5[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）16-0001-03

To study of resistance mechanisms of Ureaplasma urealyticum to quinolones

ZHANG Yisha1 WU Ying2 FAN Xingli3 JIANG Jinqin3 SUN Aihua3

1.Department of Urological Surgery, Taizhou Integrative Medicine Hospital in Zhejiang Province, Wenling 317523, China; 2.Department of Clinical Laboratory, Taizhou Integrative Medicine Hospital in Zhejiang Province, Wenling 317523, China; 3.Department of Basic Medicine, Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China

[Abstract] Objective To study the resistance mechanisms of Ureaplasma urealyticum to quinolones. Methods Mycoplasma detection kits were used to culture and identify mycoplasma as well as drug sensitivity. PCR and DNA sequencing were conducted to analyze QRDR associated genes of gyrA and parC in 77 isolates. Results There were only 3 isolates susceptible to all quinolones, and 74 isolates showed varying degree resistance to at least one kind of quinolone. Sequencing analysis of gyrA and parC revealed that 3 susceptible isolates and 2 resistant isolates had no mutation, 72 resistant isolates had mutation of D112E and/or S83L in gyrA and parC. Conclusion Mutations in gyrA and parC genes play an important role in the development of quinolones resistance in Ureaplasma urealyticum.

[Key words] Ureaplasma urealyticum; GyrA and parC genes; Mutation; Sequence analysis; Drug resistance

慢性前列腺炎是男性最常見的泌尿生殖道疾病之一，解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，Uu）是引起非細菌性慢性前列腺炎的主要病原體[1]。喹諾酮類藥物是一類人工合成的具有高效廣譜抗菌作用的藥物。隨著喹諾酮類藥物的大量和廣泛的應用，解脲脲原體臨床分離株對該類藥物的敏感性逐漸下降并出現(xiàn)耐藥[2-5]。

國內(nèi)外對解脲脲原體對喹諾酮類藥物的耐藥機制研究不多，喹諾酮類藥物的作用靶酶為Ⅱ型拓撲異構酶（包括DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ），喹諾酮類藥物耐藥是由于編碼靶酶的基因突變導致靶酶的氨基酸序列改變，gyrA和parC基因分別編碼DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，GyrA和ParC氨基酸發(fā)生替換突變抑制細菌DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的活性導致耐藥[6]。本研究從慢性前列腺炎患者前列腺液中分離了77株解脲脲原體并檢測其對3種喹諾酮類藥物的耐藥性，PCR擴增所有菌株gyrA和parC基因包括喹諾酮耐藥決定區(qū)（quinolone resistance determining regions，QRDR）在內(nèi)的核苷酸序列并直接測序，以探討本地區(qū)分離自非細菌性慢性前列腺炎解脲脲原體gyrA和parC基因的QRDR突變與喹諾酮類藥物耐藥的相關性。

1 材料與方法

1.1 前列腺液的采集

采集2008年6月～2011年10月本院泌尿外科門診擬診斷為慢性前列腺炎患者的前列腺液。用生理鹽水清潔龜頭和尿道口后用碘伏消毒，直腸指診按摩前列腺，獲取前列腺液，用無菌拭子洗脫于無菌的EP管中，用于培養(yǎng)或PCR研究。血清3型解脲脲原體標準株ATCC700970來自浙江大學病原生物系。

1.2 支原體分離與鑒定及藥敏試驗

支原體鑒定及藥敏試驗一體化試劑盒由珠海黑馬生物工程有限公司生產(chǎn)，取無菌拭子洗脫液，按試劑盒說明書操作，與生長對照孔比較，培養(yǎng)24 h后Uu孔由黃色變?yōu)槌壬蚣t色且未見渾濁為陽性，表示有Uu生長，不變色表示陰性。篩選獲得77株解脲脲原體菌株，-70℃保存。

1.3 藥敏試驗結果判斷

支原體鑒定藥物環(huán)丙沙星、氧氟沙星和司帕沙星3種藥物高、低兩個濃度各設1孔，均不變色表示敏感，都變紅色表示高度耐藥，低濃度孔變紅色、高濃度孔不變色表示低度耐藥。

1.4 DNA模板的制備

取上述細菌株培養(yǎng)物500 μL，6 000 r/min離心10 min，沉淀中加入25 μL細菌裂解液，充分混勻后沸水浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取2 μL上清作為PCR的DNA模板。

1.5 引物設計

參考GenBank登錄血清3型解脲脲原體gyrA和parC基因參考序列（GenBank：AF222894.1）及QRDR位置設計上、下游引物。gyrA基因上游引物序列：5-GCT GCT TTC GAA AAC GGA ATG-3，下游引物序列：5''-TGA TGG TAA AAC ACT TGG AAC-3。parC基因上游引物序列：5-GAC GAA TTT TAT ACG CAA TG-3，下游引物序列：5''-TTT CAC TAT CAT CAA AGT TTG-3。委托上海Invitrogen公司測序合成引物。

1.6 PCR擴增及擴增產(chǎn)物檢測

PCR總體積為100 μL，內(nèi)含2.5 mol/L各dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 U Ex-Taq DNA聚合酶（TaKaRa）、5 μL DNA提取物為模板、1×PCR緩沖液（pH8.3）。PCR參數(shù)：94℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。采用1 μg/mL溴乙錠預染色的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物包括gyrA和parC基因QRDR的區(qū)域預期大小分別為333 bp和324 bp。

1.7 核苷酸序列測定及分析

采用BioColor公司的3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒提純，委托Invitrogen公司測定PCR純化產(chǎn)物gyrA和parC基因片段的核苷酸序列。參照已報道的血清3型解脲脲原體標準株ATCC700970 gyrA和parC基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列進行比較，以確定上述菌株gyrA和parC基因QRDR的突變情況。

1.8 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用χ2檢驗，對檢測結果進行比較，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥敏結果

77株解脲脲原體對3種喹諾酮類藥物的藥敏試驗結果見表1。除3株對3種喹諾酮類藥物均敏感外，其余74株至少對1種藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥，其中對藥物只呈現(xiàn)低度耐藥的有26株，至少對1種藥物高度耐藥的有48株。

2.2 PCR擴增結果

利用自行設計的引物擴增77株解脲脲原體的gyrA和parC基因目的片段，2.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示所有77株解脲脲原體PCR產(chǎn)物在294 bp和237 bp位置有gyrA和parC基因擴增的目的片段。同樣條件下血清3型解脲脲原體標準株ATCC700970 PCR擴增結果為陽性，見圖1。

2.3 PCR測序結果

77株菌株gyrA和parC基因目的片段PCR測序結果與血清3型標準株ATCC700970對應序列比較見表1，對3種喹諾酮類藥物均敏感菌株gyrA和parC基因測定序列與標準菌株對應序列完全相同，gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）均不發(fā)生突變；74株至少對1種藥物發(fā)生耐藥的菌株中，只有2株上述基因?qū)恢貌话l(fā)生突變，其余72株都存在gyrA基因c336a（D112E）和/或parC基因c248t（S83L）突變，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=45.0，P ＜ 0.05）。74株至少對1種藥物發(fā)生耐藥的菌株中，26株至少對1種藥物呈現(xiàn)低度耐藥，其中1株gyrA和parC基因測定序列與標準菌株對應序列完全相同，gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）均不發(fā)生突變，20株只發(fā)生gyrA基因c336a（D112E）或parC基因c248t（S83L）單位點突變，只有5株gyrA和parC基因上述位點突變同時突變；48株至少對1種藥物呈現(xiàn)高度耐藥，其中除1株gyrA和parC基因上述位點均不發(fā)生突變外，發(fā)生gyrA基因c336a（D112E）或parC基因c248t（S83L）單位點突變的只有13株，34株gyrA和parC基因上述位點突變同時發(fā)生，不同耐藥程度的解脲脲原體gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）雙突變發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=18.6，P ＜ 0.05）。

3 討論

支原體沒有固定的細胞壁，部分針對細菌細胞壁合成的抗生素如β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感，目前治療支原體感染主要有四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類，其中喹諾酮類藥物是一類人工合成的廣譜抗生素，具有對解脲脲原體抗菌活性強且能口服、與其他藥物交叉耐藥少、毒副作用少等特點而廣泛應用。

喹諾酮類藥物的作用靶酶是Ⅱ型拓撲異構酶（包括DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ），在支原體繁殖傳代中DNA的復制過程，通過抑制細菌DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的活性達到抗菌目的[5，6]。gyrA和parC基因分別編碼DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，基因上的一段與喹諾酮類耐藥相關的核苷酸序列被稱為喹諾酮耐藥決定區(qū)，其中gyrA基因5末端第202～531位堿基（即編碼GyrA第68～177位氨基酸殘基的堿基）和parC基因5末端第152～456位堿基（即編碼GyrA第51～152位氨基酸殘基的堿基）組成各自的QRDR區(qū)，QRDR區(qū)堿基突變導致編碼的氨基酸突變抑制細菌DNA螺旋酶或拓撲異構酶Ⅳ的活性導致耐藥[6]。其中最主要的是與gyrA和parC基因編碼蛋白GyrA和ParC空間結構密切相關的D112和S83氨基酸突變[3-5，6]。本研究發(fā)現(xiàn)對3種喹諾酮類藥物都敏感的3株菌株GyrA和ParC氨基酸編碼與解脲脲原體血清3型標準株序列完全相同，gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）測定區(qū)域均不發(fā)生突變，74株至少對1種藥物發(fā)生耐藥的菌株中，只有2株上述基因?qū)恢貌话l(fā)生突變，兩者比較有顯著性差異，提示gyrA基因c336a（D112E）和/或parC基因c248t（S83L）突變是否發(fā)生與喹諾酮類藥物敏感性密切相關。74株至少對1種藥物發(fā)生耐藥的菌株中，48株至少對1種藥物呈現(xiàn)高度耐藥，其中34株gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）突變同時發(fā)生，而26株至少對1種藥物呈現(xiàn)低度耐藥，其中只有5株gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）突變同時發(fā)生，統(tǒng)計結果表明對喹諾酮類藥物不同耐藥程度的解脲脲原體gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）雙突變發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義，提示雙突變與喹諾酮類耐藥程度密切相關。另我們在研究中發(fā)現(xiàn)有2株耐藥株gyrA基因存在c302u（A101V）突變，其中1株不伴有gyrA基因c336a（D112E）或parC基因c248t（S83L）突變。另有2株高度耐藥株parC基因編碼蛋白ParC存在125位T125A突變，為國內(nèi)首次報道。

[參考文獻]

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[6]Chen FJ，Lo HJ. Molecular mechanisms of fluoroquinolone resistance[J]. J Microbiol Immunol Infect，2003，36（1）：1-9.

（收稿日期：2012-03-22）