王 飛，孟 濤，楊 佳，穆朝東

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830011)

胸片、CT及痰細胞學(xué)檢查為目前肺癌早期的主要篩查手段，但特異性及敏感性均較低［1～3］，早期漏診率高;而大部分肺癌患者就診時病情已發(fā)展到晚期，病死率高［4］。熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是近年發(fā)展起來的一項新技術(shù)，其可迅速檢測出中期分裂相/間期核細胞中染色體數(shù)目等異常變化，為肺癌的遺傳學(xué)研究提供了新方法［5］。近期國內(nèi)已有將FISH技術(shù)應(yīng)用于肺癌檢測的相關(guān)報道，但多數(shù)是利用支氣管鏡取樣，而用于痰脫落細胞的報道較少。2009年4月～2011年10月，我們采用雙色FISH技術(shù)檢測了60例初診疑似肺癌患者痰液中脫落細胞3、7、17染色體和9號染色體P16位點異常情況，并以組織病理確診為肺癌為金標準，探討FISH技術(shù)在肺癌診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 60例初診疑似肺癌患者，男42例，女18例;年齡46～76歲，中位年齡63歲。長期吸煙35例，有慢性咳嗽咳痰病史47例。經(jīng)病理或細胞學(xué)檢查診斷證實為肺癌43例(肺癌組)，其中鱗癌26例、小細胞肺癌6例、腺癌11例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(早期)18例，Ⅲ～Ⅳ期(晚期)25例。肺良性病變17例(良性組)，其中結(jié)核10例，肺炎7例。另選取同期20例體檢健康者為對照組，年齡41～80歲，中位年齡61歲。

1.2 痰脫落細胞檢查 收集三組新鮮痰液標本(取清晨漱口后深部第2、3口痰，連續(xù)3 d，留置于無菌瓶中)，每例收集約20 mL，分為兩等分各10 mL，分別用于FISH檢測和常規(guī)痰脫落細胞學(xué)檢查(常規(guī)方法)。

1.2.1 FISH檢測 10 mL中痰液加入5～10 mL的痰液消化液，搖勻，放置10～20 min，1 500 r/min離心10 min后去上清，加入5 mL在37℃預(yù)熱的膠原酶B，37℃水浴35 min，期間吹打懸浮細胞5～6次。1 500 r/min離心10 min后去上清，加入5 mL 37℃預(yù)熱的0.075 mol/L的KCl低滲液，重新吹打懸浮細胞，37℃水浴低滲30 min，期間吹打5～6次。加入固定液2 mL(甲醇∶冰醋酸為3∶1)，混勻，1 500 r/min離心10 min后去上清。室溫下緩慢加入5 mL新的固定液重新懸浮細胞，室溫下放置10 min，1 500 r/min離心懸液10 min后去上清到原來體積的1/20～1/50(留0.5～1 mL)。將懸液靜置10 min，用移液槍滴加15～25μL細胞懸液至3～4片玻片上，自然晾干。56℃環(huán)境中老化玻片30 min或室溫下過夜老化玻片。將樣本片子放入2×標準檸檬酸鹽溶液(SSC)溶液中漂洗2次，每次5 min。0.1 mol/L HCl溶液中浸泡10 min;將片子放入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的胃蛋白酶工作液中，消化10 min。2×SSC室溫下清洗2次，每次5 min。將片子放入快速固定液(39 mL的2×SSC，1 mL的甲醛)室溫中，固定10 min。將片子依次置于70%、85%、100%的乙醇各脫水2 min。取出后，自然干燥玻片。干燥后的玻片加熱至56℃。在片子上將10μL的混合探針加到一個反應(yīng)區(qū)，將蓋玻片立刻覆蓋反應(yīng)區(qū)，使探針溶液彌漫整個覆蓋區(qū)。用樹膠封固，將封好的片子放入預(yù)熱的濕盒中，于76℃水浴箱中高溫變性5.5 min，取出后放入提前溫育在42℃的雜交盒中，過夜放置。將雜交后的玻片取出，揭掉表面的封口膠，將玻片放入2×SSC溶液中反復(fù)清洗，洗去蓋片后開始玻片洗滌。將玻片放入40 mL 67℃ 0.3%NP-40/0.4×SSC溶液中洗滌2 min。室溫下在40 mL 0.1%NP-40/2×SSC溶液中洗滌30 s。玻片置于室溫的70%乙醇中洗滌3 min。取出后在暗處風(fēng)干，烤片機上56℃烤片3～5 min，滴加15μL DAPI于樣本區(qū)，蓋上蓋片，避光保存15～20 min。

1.2.2 對照組痰脫落細胞染色體數(shù)目畸變的閾值(畸變率)檢測 應(yīng)用日本OLYMPUS2BX51型熒光顯微鏡，圖像分析系統(tǒng)采用俄羅斯Video Test公司FISH2.0分析軟件。對采集的20例正常人痰液每組探針組合分析100個細胞。統(tǒng)計出現(xiàn)不同異常情況的百分比，閾值=平均數(shù)(M)+3×標準差(SD)，3、7、17號染色體探針各需要建立2個閾值(1個點、≥3個點)，9p16探針需要建立3個閾值(0、1、≥3個點)。任意≥2個位點出現(xiàn)異常，如3號和17號染色體出現(xiàn)非整倍增加，可判斷為陽性;一個位點有≥2種異常，如9p16有0信號點異常和3信號點異常，也可判斷為陽性。若只有一個位點出現(xiàn)一種異常，擴大計數(shù)細胞后再重新判斷。統(tǒng)計信號種類及與之相對應(yīng)細胞數(shù)目百分比并錄入圖像分析儀。在鏡下觀察雜交效果，以細胞雜交率＞80%為有效標本。細胞核膜須完整，在細胞核內(nèi)可見清晰明亮的橘紅色或黃綠色熒光信號，如出現(xiàn)2個或3個熒光點，兩個位點之間距離大于單個信號的直徑以上，且熒光強度相近，計為含有2條或3條染色體。如果兩個信號之間的距離＜1個信號的直徑則計數(shù)為1條染色體。

1.2.3 疑似肺癌患者染色體畸變 以20例正常人痰脫落細胞染色體數(shù)目畸變的閾值(畸變率)為標準，判定疑似肺癌患者染色體畸變數(shù)。每組探針均組合分析100個細胞，計算異常率，判斷陽性個數(shù)。

1.2.4 常規(guī)方法檢測 取10 mL痰液標本行常規(guī)方法檢查，由固定的2名細胞學(xué)專家按照常規(guī)操作并判定結(jié)果。以病理檢查結(jié)果為金標準，對FISH、常規(guī)方法及二者聯(lián)合檢查診斷肺癌的價值進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以百分比表示，采用獨立樣本t檢驗、χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20例正常人痰脫落細胞染色體數(shù)目畸變的閾值(畸變率) 見表1。

表1 20例正常人痰脫落細胞染色體數(shù)目畸變率(%)

2.2 診斷價值 FISH與常規(guī)方法診斷的敏感性分別為 65.1%(28/43)、32.5%(14/43)，P=0.003;特異性分別為 76.5%(13/17)、100%(17/17)，P=1;聯(lián)合檢測的敏感性與特異性分別為72.1%(31/43)、100%(17/17)，與常規(guī)方法比較，P分別 =0、1。FISH、常規(guī)方法判斷TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的敏感性分別為55.6%(10/18)、22.2%(4/18)，P=0.040;Ⅲ～Ⅳ期敏感性分別為72%(18/25)、40%(10/25)，P=0.025;聯(lián)合檢測判斷Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的敏感性分別為66.7%(12/18)、76%(19/25)，與常規(guī)方法比較，P 分別 =0.007、0.010;三種方法判斷不同分期患者的特異性無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

FISH是一種細胞遺傳學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的新技術(shù)，其采用熒光素直接標記遺傳物質(zhì)DNA制備探針，與染色體或?qū)嶓w腫瘤及脫落細胞間期核進行雜交，通過熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞內(nèi)有無染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變;可直接用于檢測肺癌患者脫落細胞間期核染色體變化［6］。已有相關(guān)文獻報道，利用支氣管鏡檢刷取標本進行FISH檢測可明顯提高早期肺癌檢出的敏感性［7，8］;但支氣管鏡具有一定創(chuàng)傷性。用FISH技術(shù)對痰標本行肺癌高危人群篩查，以期對肺癌的發(fā)生進行早期干預(yù)是目前研究的熱點。近年來國內(nèi)外關(guān)于FISH檢測痰脫落細胞診斷肺癌的報道較少，且結(jié)論差異較大［9，10］。本研究FISH結(jié)果顯示，3，7，17號染色體和9號染色體p16在肺癌組與良性組均發(fā)生一定數(shù)目的畸變，說明染色體畸變在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH聯(lián)合常規(guī)方法檢測診斷肺癌的敏感性為72.1%，明顯高于常規(guī)方法，但特異性無統(tǒng)計學(xué)差異。Voss等［11］報道，通過支氣管鏡檢查疑似肺癌患者得到刷檢樣本，F(xiàn)ISH及聯(lián)合方法診斷肺癌的敏感性明顯高于常規(guī)方法，特異性無統(tǒng)計學(xué)差異，與本研究結(jié)果一致。Varella-Garcia等［12］報道，多色熒光原位雜交技術(shù)聯(lián)合常規(guī)方法檢測診斷肺癌的敏感性明顯高于常規(guī)方法。而痰液標本取材容易，無創(chuàng)傷性，有助于推動FISH技術(shù)的臨床應(yīng)用。

綜上所述，F(xiàn)ISH行痰脫落細胞檢測診斷肺癌的敏感性高，與常規(guī)方法聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高準確率。但FISH檢測費用較昂貴，操作相對復(fù)雜，目前尚不能取代常規(guī)方法。

［1］Markowitz SB，Miller A，Miller J，et al.Ability of low-dose helical CT to distinguish between benign and malignant noncalcified lung nodules［J］.Chest，2007，131(4):1028-1034.

［2］Midthun DE，Jett JR.Update on screening for lung cancer［J］.Semin Respir Crit Care Med，2008，29(3):233-240.

［3］Bach PB，Kelley MJ，Ramsey CT，et al.Screening for lung cancer:a review of the current literature［J］.Chest，2003，123(1suppl):72S-82S.

［4］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer JClin，2009，59(4):225-249.

［5］Varella-Garcia M，Kittelson J，Schulte AP，et al.Multi-target interphase fluorescence in situ hybridization assay increases sensitivity of sputum cytology as a predictor of lung cancer［J］.Cancer Detect Prev，2004，28(4):244-251.

［6］Halling KC，Kipp BR.Fluorescence in situ hybridization in diagnostic cytology［J］.Hum Pathol，2007，38(8):1137-1144.

［7］Halling KC，Rickman OB，Kipp BR，et al.A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of lung cancer in bronchoscopic specimens［J］.Chest，2006，130(3):694-701.

［8］Voss JS，Kipp BR，Halling KC，et al.Fluorescence in situ hybridization testing algorithm improves lung cancer detection in bronchial brushing specimens［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，181(5):478-485.

［9］Kennedy TC，Miller Y，Prindiville S.Screening for lung cancer revisited and the role of sputum cytology and fluorescence bronchoscopy in a high-risk group［J］.Chest，2000，117(4 Suppl 1):72S-79S.

［10］賈東輝，張智慧，劉樹范，等.熒光原位雜交技術(shù)在肺癌痰細胞學(xué)診斷中的應(yīng)用［J］.中華腫瘤雜志，2000，22(6):477-480.

［11］Voss JS，Kipp BR，Halling KC，et al.Fluorescence in situ hybridization testing algorithm improves lung cancer detection in bronchial brushing specimens［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，181(5):478-485.

［12］Varella-Garcia M，Kittelson J，Schulte AP，et al.Multi-target interphase fluorescence in situ hybridization assay increases sensitivity of sputum cytology as a predictor of lung cancer［J］.Cancer Detect Prev，2004，28(4):244-251.