北方狹口蛙消化道5－羥色胺細(xì)胞的免疫組織化學(xué)定位

2013-01-17 12:21黃淑麗金晨晨牛鑫鑫咸振飛曹雙鳳張志強(qiáng)

中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志 2013年1期

黃淑麗金晨晨牛鑫鑫咸振飛曹雙鳳張志強(qiáng)＊

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)1生命科學(xué)學(xué)院；2動(dòng)物科技學(xué)院，合肥230036）

5－羥色胺（5－h(huán)ydroxytryptamine，5－HT）是脊椎動(dòng)物消化道中含量和分布范圍較廣的一種激素［1－3］。免疫組織化學(xué)研究表明，兩棲動(dòng)物消化道（胃腸道或腸道）各段均有5－HT 細(xì)胞存在［2－19］，且大多集中分布于胃幽門部［3－11］和／或十二指腸［12－15］。然而，也有一些例外情況，如東方玲蟾（Bombina orientalis）［16］、中國林蛙（Rana chensinensis）［17］和黑框蟾蜍（Bufo melanostictus）［6］的分布密度高峰分別位于食管、胃賁門部和回腸等處，且目前尚未發(fā)現(xiàn)分布型完全一致的兩棲類動(dòng)物［2－19］。兩棲類消化道內(nèi)分泌細(xì)胞分布型的多樣性可能與多種因素有關(guān)，如彼此之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、不同的生活史過程和食性差異等［1］。

北方狹口蛙（Kaloula borealis）隸屬于兩棲綱（Amphibian）無尾目（Anura）姬蛙科（Microhylidae）狹口蛙屬（Kaloula），以白蟻和小型昆蟲為食。不同食物配比可影響北方狹口蛙消化系統(tǒng)的形態(tài)和發(fā)育歷程［20］，但尚無消化道組織學(xué)方面的報(bào)道。本文采用SABC免疫組織化學(xué)法，對(duì)北方狹口蛙消化道5－HT細(xì)胞進(jìn)行了定位研究，擬豐富兩棲動(dòng)物比較組織學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)的基礎(chǔ)資料，為深入認(rèn)識(shí)該蛙的消化生理適應(yīng)性提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

材料和方法

1．材料

北方狹口蛙于2012年6月下旬捕于安徽省蚌埠市固鎮(zhèn)縣石湖鄉(xiāng)鐘黃村，取雌雄蛙各6只，稱量體重（6．735±0．341g）和體長（34．88±0．76mm）后，用雙毀髓法處死動(dòng)物，迅速取出消化道各段（食管、胃賁門部、胃體、胃幽門部、十二指腸、空腸、回腸和直腸），每段截取0．5－1cm長組織，用生理鹽水清洗后，迅速投入不含冰醋酸的Bouin’s液固定18－24 h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片（5μm）。

2．主要試劑

即用型（ready to use）5－HT抗血清（兔抗人，產(chǎn)品代號(hào)為ZA－0231）和SP－9000型免疫組織化學(xué)試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，由美國ZYMED公司生產(chǎn)。

3．免疫組織化學(xué)方法

常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。用0．3%H2O2甲醇溶液孵育15min，0．01mol／L PBS沖洗3次×5 min，滴加正常山羊血清，室溫孵育15min，吸去多余血清，滴加一抗，4℃過夜。PBS洗滌3次×5 min，滴加即用型生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG抗血清），室溫孵育60min。PBS洗滌2次×5min，滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶，室溫孵育60min。PBS浸洗2次×5min，DAB－H2O2顯色，蒸餾水沖洗，脫水，透明，封片。陰性對(duì)照，分別以正常羊血清和PBS代替一抗，其余步驟同上。

4．觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù)

在Motic－BA 210型顯微鏡下觀察，拍照，計(jì)數(shù)。光學(xué)顯微鏡下，5－HT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞呈深棕色，細(xì)胞核不著色或呈淡黃色，背景呈淺藍(lán)色，容易區(qū)分。陰性對(duì)照片均未見深染的細(xì)胞。對(duì)每只蛙消化道各段的每個(gè)部位，在400倍視野下，計(jì)數(shù)5張切片30個(gè)視野中5－HT細(xì)胞數(shù)量的平均值，表示該只蛙該部位的數(shù)量，最后以12只蛙的平均值表示消化道各段5－HT細(xì)胞的數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)開放型和閉合型細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算其比值。開放型和閉合型細(xì)胞的比值＝開放型細(xì)胞的數(shù)量／閉合型細(xì)胞的數(shù)量×100%。

5．統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 13．0for windows進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。經(jīng)Kolmogorov－Simirnov test檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。以單因素方差分析（one－way ANOVA）及多重比較（multiple comparisons）post hoc test統(tǒng)計(jì)消化道各段5－HT開放型和閉合型細(xì)胞的比值及數(shù)量。文中數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，P＜0．05為差異顯著，P＜0．01為差異極顯著。

結(jié) 果

1．5－HT細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

食管5－HT細(xì)胞主要分布于上皮細(xì)胞之間，少數(shù)見于基底膜，多呈長楔形、長棒狀、梨形、錐體形或蝌蚪狀（圖1、2），少數(shù)呈圓形（圖3）。胃部5－HT細(xì)胞主要分布于胃腺上皮細(xì)胞之間。賁門5－HT細(xì)胞多呈楔形或三角形（圖4），少數(shù)圓形（圖5）；胃體圓形細(xì)胞（圖6）的數(shù)量與錐體形和棒狀細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)（圖7）；幽門以圓形細(xì)胞為主（圖8），楔形或棒狀細(xì)胞較少（圖9）。腸道5－HT細(xì)胞主要分布于腸上皮細(xì)胞之間。十二指腸5－HT細(xì)胞多呈長錐體形，具有伸向腸腔或同時(shí)伸向兩端的胞突（圖10），偶見圓形細(xì)胞（圖11）；空腸5－HT細(xì)胞多呈長棒狀（圖12）；回腸5－HT細(xì)胞多呈錐體形（圖13），鮮見橢圓形細(xì)胞（圖14）；直腸5－HT細(xì)胞多呈短圓錐形或錐體形（圖15）。

2．5－HT細(xì)胞的分布密度

5－HT細(xì)胞在幽門密度最高，胃體和十二指腸其次，食管、空腸、回腸和直腸密度較低，賁門最低（F7，88＝5．961，P＜0．01）（表 1）。

3．5－HT開放型和閉合型細(xì)胞的比值

北方狹口蛙消化道5－HT開放型和閉合型細(xì)胞的比值大體呈“V”形，變化范圍為0．6－26．7，幅度較大。食管和賁門以開放型細(xì)胞為主，從賁門至幽門，開放型細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，至幽門達(dá)到低谷；腸道各段，從十二指腸至直腸開放型細(xì)胞的數(shù)量顯著升高，只偶見閉合型細(xì)胞（F7，88＝8．026，P＜0．01）（表1）。

表1 北方狹口蛙消化道各段5－羥色胺細(xì)胞分布密度（單位：個(gè)／400×視野）及開放型與閉合型細(xì)胞的比值（單位：%）。平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。同一列中字母不同表示差異顯著，含有相同字母表示差異不顯著，a＞b＞c；A＞B＞C。Table 1 Distributive density of 5－h(huán)ydroxytryptamine（5－HT）－producing cells（Unit：number of cells／400 times field）and ratio（Unit：%）between open and closed populations of 5－HT cells along the different regions of digestive tract of Kaloula borealis．Mean ± SE．Different letters for the same column mean significant differences，while the same column with the same letters is not significant between groups，a＞b＞c；A ＞B＞C．

討論

北方狹口蛙整個(gè)消化道都有5－HT細(xì)胞分布，其分布密度在胃幽門部最高，賁門最低，分布型與大多數(shù)兩棲動(dòng)物相似，但也有自身的獨(dú)特性；消化道各段開放型和閉合型細(xì)胞的比值呈“V”形波動(dòng)，這與其他兩棲動(dòng)物不同。

5－HT細(xì)胞是消化道所含各類內(nèi)分泌細(xì)胞的主要類型之一，見于各類脊椎動(dòng)物的消化道中［1－3］。包括食管在內(nèi)，北方狹口蛙消化道各段均有5－HT細(xì)胞分布，這與其他兩棲動(dòng) 物相同［3－10，12，13，16－19，22］。北方狹口蛙消化道5－HT細(xì)胞在胃幽門部密度最高，賁門最低。研究發(fā)現(xiàn)，半數(shù)以上的兩棲動(dòng)物消化道5－HT細(xì)胞的分布密度高峰位于胃幽門部［2－9］，低谷位于消化道兩端［4－10，12，19］；然而，也有一些例外情況，如中國林蛙（Rana chensinensis）的分布密度高峰位于胃賁門部［17］；粗皮蛙（Rana rugosa）、虎紋蛙（Rana rugulosa）、牛蛙（Rana calesbeiana）和黑框蟾蜍（Bufo melanostictus）則分別在胃體［18］、十二指腸［12］、空腸［19］和回腸［6］分布密度最高。北方狹口蛙的食性與大多數(shù)兩棲動(dòng)物相似，均是以肉食性為主的雜食性動(dòng)物，喜食白蟻和小型昆蟲。北方狹口蛙體型較小，發(fā)育歷期較短，多棲息于水坑或房屋附近的草叢中、土穴內(nèi)或石下［20］。北方狹口蛙胃幽門部密度最高，胃體和十二指腸也有較多的5－HT細(xì)胞分布，但食管和腸道后段5－HT細(xì)胞數(shù)量明顯較少。這種分布型可能有助于食物逐漸進(jìn)入胃部，加快處理食物的速度和效率。

形態(tài)學(xué)上，北方狹口蛙消化道5－HT細(xì)胞可分為開放型和閉合型細(xì)胞兩種類型，前者主要呈錐體形、長梭形或楔形，具有胞突伸向管腔或鄰近細(xì)胞，后者多呈圓形或橢圓形。兩者的比例在胃幽門部最低，回腸和直腸最高。5－HT主要由腸粘膜層的嗜鉻細(xì)胞分泌產(chǎn)生，物理刺激和化學(xué)信號(hào)均能促進(jìn)其分泌［1］。北方狹口蛙從食管至胃幽門部，開放型細(xì)胞的數(shù)量逐漸下降，這可能與食物對(duì)食管的刺激較強(qiáng)，之后對(duì)胃部的機(jī)械刺激作用逐漸減弱有關(guān)，有助于食物的潤滑和下行。兩棲動(dòng)物普遍具有較強(qiáng)的耐受饑餓的能力，機(jī)械刺激能促進(jìn)5－HT細(xì)胞的分泌［21］。北方狹口蛙在飽食狀態(tài)下胃部囤積閉合型細(xì)胞，可能通過緩釋的途徑對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化起調(diào)控作用。從十二指腸至直腸，北方狹口蛙幾乎都為開放型細(xì)胞，這與其他兩棲類動(dòng)物腸道段開放型和閉合型細(xì)胞的比值從十二指腸至直腸逐漸下降的趨勢相反［15］。十二指腸、空腸和回腸是北方狹口蛙消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，較多數(shù)量開放型細(xì)胞的存在，有助于食物的消化和吸收過程的進(jìn)行。直腸大部分細(xì)胞為開放型細(xì)胞，可能與食物殘?jiān)呐懦龊退值闹匚者^程有關(guān)。5－HT可能通過外分泌的途徑參與食物的消化、吸收和食物殘?jiān)呐懦鲞^程［1］。

總之，北方狹口蛙整個(gè)消化道的5－HT細(xì)胞與其他兩棲動(dòng)物相比，既有相同之處，也有自身的獨(dú)特性。除食性和穴居掘土的生活方式可能影響其消化道5－HT細(xì)胞的分布型和形態(tài)外，消化生理狀態(tài)也是一個(gè)需要重點(diǎn)考慮的因素，值得進(jìn)一步研究和探索。

圖版說明

圖1 食管長棒形的5－HT細(xì)胞×400

圖2 食管蝌蚪形的5－HT細(xì)胞×400

圖3 食管圓形的5－HT細(xì)胞×400

圖4 胃賁門部圓形的5－HT細(xì)胞×400

圖5 胃賁門部三角形的5－HT細(xì)胞×400

圖6 胃體圓形的5－HT細(xì)胞×400

圖7 胃體棒狀的5－HT細(xì)胞×400

圖8 胃幽門部圓形的5－HT細(xì)胞×400

圖9 胃幽門部楔形的5－HT細(xì)胞×400

圖10 十二指腸伸向腸腔的錐體形5－HT細(xì)胞×400

圖11 十二指腸圓形的5－HT細(xì)胞×400

圖12 空腸長棒狀的5－HT細(xì)胞×400

圖13 回腸錐體形的5－HT細(xì)胞×400

圖14 回腸橢圓形的5－HT細(xì)胞×400

圖15 直腸短圓錐形和錐體形的5－HT細(xì)胞×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Long bar－shaped 5－HT cells in the epithelium of esophagus．×400

Fig．2Tadpole－shaped 5－HT cells in the epithelium of esophagus．×400

Fig．3Round－shaped 5－HT cells in the epithelium of esophagus．×400

Fig．4Round－shaped 5－HT cells in the epithelium of stomachus cardiacus．×400

Fig．5Triangle－shaped 5－HT cells in the epithelium of stomachus cardiacus．×400

Fig．6Round－shaped 5－HT cells in the epithelium of stomachus corpus．×400

Fig．7Bar－shaped 5－HT cells in the epithelium of stomachus corpus．×400

Fig．8Round－shaped 5－HT cells in the stomachus pyloricus．×400

Fig．9Wedge－shaped 5－HT cells in the stomachus pyloricus．×400

Fig．10Pyramid－shaped 5－HT cells in the duodenum，the long cytoplasmic process extending to its intestinal cavity．×400

Fig．11Round－shaped 5－HT cells in the duodenum．×400

Fig．12Long bar－shaped 5－HT cells in the jejunum．×400

Fig．13Pyramid－shaped 5－HT cells in the ileum．×400

Fig．14Oval－shaped 5－HT cells in the ileum．×400

Fig．15Short pyramid and pyramid shaped 5－HT cells in the rectum．×400

EP：上皮（epithelium）SG：胃腺（stomach gland）標(biāo) 尺（scale）＝15μm