鐘文清，譚建新

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心，廣東湛江524023）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)主要為喘息、氣急、胸悶或咳嗽等，肺部病理改變一般為炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道慢性炎性反應(yīng)等。小鼠是最常用于構(gòu)建哮喘模型的動(dòng)物，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者所用的佐劑和激發(fā)方式各異。較常用的佐劑為氫氧化鋁和十二水硫酸鋁鉀，激發(fā)方式常用的有霧化和滴鼻。建立穩(wěn)定的哮喘模型是研究哮喘發(fā)病及其治療的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)比較不同佐劑和激發(fā)方式對(duì)哮喘模型的影響，觀察小鼠肺組織中氣管和血管周?chē)难仔苑磻?yīng)，進(jìn)一步觀察在停止霧化10d后肺部炎性反應(yīng)的消退情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 38只無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)小鼠購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有小鼠均為6～8周雌性。

1.2 主要試劑和材料 雞卵清蛋白（OVA）、氫氧化鋁，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；十二水硫酸鋁鉀購(gòu)自上海阿拉丁公司；KYWH1004型霧化器（霧化顆粒小于5μm）由佛山凱亞醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)；紅細(xì)胞裂解液由北京康為世紀(jì)公司生產(chǎn)；快速瑞氏染液由南京建成科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 致敏液與激發(fā)液配制 致敏液分3種：哮喘組每只小鼠注射200μL致敏液Ⅰ（100μg OVA和2mg十二水硫酸鋁鉀溶于200μL生理鹽水）或致敏液Ⅱ（100μg OVA和2mg氫氧化鋁溶于200μL生理鹽水）；對(duì)照組用生理鹽水代替致敏液致敏。激發(fā)液分3種：1%OVA（1g OVA溶于100mL生理鹽水中）、滴鼻液（100μg OVA溶于30μL生理鹽水中）、生理鹽水（對(duì)照組用生理鹽水作為激發(fā)液）。

1.3.2 動(dòng)物分組與激發(fā)方法 采用隨機(jī)數(shù)表法將小鼠隨機(jī)分成A～F 6組，除D組8只外其余每組6只，先取3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：分別為A組（對(duì)照作用，用生理鹽水致敏，生理鹽水霧化7 d）、B組（用致敏液Ⅱ致敏，1%OVA霧化7d）、C組（用致敏液Ⅰ致敏，1%OVA霧化7d）；經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)十二水硫酸鋁鉀作佐劑致敏效果較好（結(jié)果見(jiàn)后），再取3組用致敏液Ⅰ致敏，以激發(fā)方法不同分別分為D組（用滴鼻液激發(fā)3d）、E組（用1%OVA霧化5d）、和F組（用1%OVA霧化7d，在末次霧化10 d后處死）。所有實(shí)驗(yàn)組均于第0、14天腹腔注射致敏，于第21天開(kāi)始激發(fā)，霧化時(shí)間為每天30min。D組滴鼻激發(fā)前用1%戊巴比妥鈉10mL／kg腹腔注射麻醉，然后將30μL滴鼻液緩慢交替滴入2個(gè)鼻孔。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗 于末次激發(fā)24h后（其中F組末次激發(fā)10d后）經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉摘眼球放血處死，仰臥位固定，分離頸部皮膚和肌肉充分暴露氣管，用血管夾夾閉左主支氣管，用注射器經(jīng)環(huán)狀軟骨做氣管插管，0.5mL生理鹽水對(duì)右肺進(jìn)行灌洗3次后回收80%左右。肺泡灌洗液（BALF）于4℃500g離心10min，棄上清后用100μL生理鹽水重懸，參照說(shuō)明書(shū)裂解紅細(xì)胞，沉淀再用100μL生理鹽水重懸，用牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)白細(xì)胞總數(shù)。重懸液涂片后進(jìn)行瑞氏染色，分類(lèi)計(jì)數(shù)至少200個(gè)白細(xì)胞。

表1 不同佐劑及激發(fā)方式對(duì)BALF白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)（±s，%）

表1 不同佐劑及激發(fā)方式對(duì)BALF白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)（±s，%）

a：P＜0.05，與 A組比較；b：P＜0.05，與B組比較；c：P＜0.05，與C組比較；d：P＜0.05，與D組比較。

.26±3.01 B組 71.08±5.89a 40.02±2.75a 38.67±2.95a 8.37±1.93 12.94±2.62a C 組 360.83±30.69ab 46.33±7.01ab 35.27±4.03a 7.16±2.16 11.24±2.75a D 組 13.76±1.58ac 32.47±7.24abc 42.15±8.54ac 18.49±3.44abc 6.89±2.43ab E 組 316.83±28.25ad 45.28±6.89ad 25.15±6.62abcd 16.10±5.62 13.47±3.89 F組 13.71±2.08a 13.66±2.23abcd 51.72±3.36abcd 11.93±4.26 22.69±4.02 E M N L A 組 8.75±1.13 2.50±1.96 70.35±5.41 6.88±2.12 20組別 白細(xì)胞（×103）bcd

圖1 各組肺組織炎性反應(yīng)比較（HE×200）

1.4 肺組織蘇木素-伊紅（HE）染色 左肺用10%甲醛固定24h后經(jīng)脫水和常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為3μm，HE染色后鏡下觀察肺部炎性反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 激發(fā)時(shí)的表現(xiàn) D組在滴鼻的過(guò)程中出現(xiàn)明顯腹式呼吸，呼吸加深加快，有1只因?yàn)槁樽磉^(guò)深、滴鼻過(guò)快而死亡。除A組外，所有霧化激發(fā)哮喘小鼠在第3次霧化時(shí)均出現(xiàn)煩躁不安、抓鼻、大小便失禁。

2.2 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組BALF的白細(xì)胞總數(shù)比較，見(jiàn)表1。C組炎性反應(yīng)較B組嚴(yán)重（P＜0.05）。與A組比較，D組白細(xì)胞輕度增高（P＜0.05），B、C和 E組都顯著增高（P＜0.05）。C、E組與 D組比較，白細(xì)胞明顯增多（P＜0.05）。F組與C組比較，白細(xì)胞顯著下降（P＜0.05）。C組較E組白細(xì)胞多但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.262）。對(duì)BALF的白細(xì)胞［包括嗜酸性粒細(xì)胞（E）、單核細(xì)胞（M）、中性粒細(xì)胞（N）和淋巴細(xì)胞（L）］進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)。在各組的嗜酸性粒細(xì)胞比較中：B組較C降低；與A組比較，其余各組均增高；B、C及E組均較D組增高；C組與E組無(wú)差別；F組比B、C、D及E組均明顯降低，見(jiàn)表1。

2.3 各組肺組織炎性反應(yīng)比較 氣管和血管周?chē)仔苑磻?yīng)比較，A組氣管完整，氣管周?chē)闯霈F(xiàn)炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象，肺部小動(dòng)靜脈周?chē)鸁o(wú)炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，紋理清晰，見(jiàn)圖1A。B組氣管及血管周?chē)仔苑磻?yīng)較明顯，部分氣管內(nèi)有黏液栓形成，見(jiàn)圖1B。C組氣道周?chē)仔苑磻?yīng)浸潤(rùn)，氣管上皮細(xì)胞增厚部分脫落，杯狀細(xì)胞增高，部分氣道平滑肌細(xì)胞增厚，氣管內(nèi)有黏液栓形成，血管周?chē)罅康难仔苑磻?yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1C，氣管及血管周?chē)仔苑磻?yīng)較B組重。D組局部氣管出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)、黏液栓形成，局部小血管周?chē)霈F(xiàn)大量的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。但仍有大部分氣管及血管周?chē)鸁o(wú)炎性反應(yīng)浸潤(rùn)；E組肺部炎性反應(yīng)類(lèi)似于C組。F組觀察到氣管周?chē)仔苑磻?yīng)明顯減輕，基本恢復(fù)正常；血管周?chē)仔苑磻?yīng)細(xì)胞明顯減輕但仍未恢復(fù)正常，仍能觀察到少量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討 論

過(guò)敏性哮喘是一種以嗜酸性粒細(xì)胞增高和氣道高反應(yīng)性為特點(diǎn)的氣道炎性反應(yīng)，并伴有多種細(xì)胞因子參與的過(guò)程。環(huán)境、種屬、佐劑及激發(fā)方法對(duì)小鼠哮喘炎性反應(yīng)均有影響［1］，然而，不同激發(fā)方式對(duì)哮喘模型的影響較少報(bào)道［2］。雖然近年研究哮喘特別是難治性哮喘較多采用塵螨作為過(guò)敏原［3-5］，但在研究哮喘的防治上更多的是用OVA作為過(guò)敏原［6-7］，本研究亦采用OVA作為過(guò)敏原，先比較十二水硫酸鋁鉀和氫氧化鋁佐劑對(duì)哮喘模型的影響，同樣激發(fā)7d均能成功誘發(fā)哮喘，但無(wú)論從BALF中的白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，還是從肺組織中氣道和血管周?chē)仔苑磻?yīng)比較，以十二水硫酸鋁鉀為佐劑的炎性反應(yīng)程度比氫氧化鋁更嚴(yán)重，這可能與十二水硫酸鋁鉀佐劑的乳化效果更好有關(guān)［1］。

在研究急性哮喘模型中，急慢性模型的構(gòu)建有不同的方法［8-10］。為了更好地觀察肺部炎性反應(yīng)表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用5次和7次的霧化激發(fā)方式進(jìn)行研究，同時(shí)也比較3次滴鼻激發(fā)的效果。對(duì)于哮喘組，在觀察其激發(fā)過(guò)程的表現(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)有個(gè)別小鼠在第1次霧化時(shí)就出現(xiàn)抓鼻、煩躁不安和大小便失禁，第3次激發(fā)時(shí)普遍出現(xiàn)上述現(xiàn)象，這說(shuō)明常用的3次霧化激發(fā)能建立較穩(wěn)定的哮喘模型［11-12］，激發(fā)5次和7次后能出現(xiàn)較明顯的炎性反應(yīng)表現(xiàn)，但兩者的炎性反應(yīng)表現(xiàn)無(wú)明顯差別，7次霧化組的部分氣道平滑肌細(xì)胞輕度增厚。平滑肌細(xì)胞的增生是氣道重塑的重要組成部分［13-15］，這說(shuō)明連續(xù)激發(fā)7d后才開(kāi)始出現(xiàn)氣道重塑的病理改變，這也能解釋為什么研究氣道重塑應(yīng)該選用慢性哮喘模型。滴鼻也能誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生［2，16-17］，雖然滴鼻的操作簡(jiǎn)單耗材也較少，但滴鼻激發(fā)受干擾的因素很多，主要與操作者的技術(shù)有關(guān)，麻醉得太深或滴得太快均會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，本實(shí)驗(yàn)有1只小鼠因此窒息死亡，觀察發(fā)現(xiàn)在麻醉后接近蘇醒的狀態(tài)下滴鼻效果最好。滴鼻的過(guò)程中要不斷翻動(dòng)小鼠以達(dá)到OVA能均勻地進(jìn)入肺部，但即使這樣也不能均勻地進(jìn)入肺部，肺部病理切片發(fā)現(xiàn)，局部的氣道和血管炎性反應(yīng)嚴(yán)重，但整個(gè)肺部炎性反應(yīng)較輕，這可能與滴注OVA時(shí)局限于個(gè)別氣道有關(guān)。與正常對(duì)照組比較，滴鼻組BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞雖然明顯增高，但總炎性反應(yīng)細(xì)胞增高并不明顯。與滴鼻比較，霧化組整體炎性反應(yīng)明顯，肺組織病理也能發(fā)現(xiàn)大部分氣道和血管周?chē)霈F(xiàn)較明顯的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，這有可能是引起B(yǎng)ALF中炎性反應(yīng)細(xì)胞明顯增高的原因。

綜上所述，建立哮喘模型與佐劑和激發(fā)方式密切相關(guān)。十二水硫酸鋁鉀能溶于水，乳化效果比氫氧化鋁好，是較理想的佐劑。在研究肺部整體炎性反應(yīng)時(shí)，傳統(tǒng)的霧化激發(fā)方法較滴鼻好。采用5次霧化較3次滴鼻激發(fā)的方法能更有效地誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生。

［1］李睿，劉恩梅，楊錫強(qiáng)，等.不同飼養(yǎng)環(huán)境、種屬、佐劑及激發(fā)方法對(duì)小鼠哮喘炎癥的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2006，35（1）：43-44.

［2］沈璐，賴(lài)克方，姜華，等.不同激發(fā)方式對(duì)小鼠過(guò)敏性支氣管哮喘模型的影響［J／CD］.中華哮喘雜志：電子版，2009，3（6）.404-408.

［3］Fredriksson K，F(xiàn)ielhaber JA，Lam JK，et al.Paradoxical effects of rapamycin on experimental house dust mite-induced asthma［J］.PLoS One，2012，7（5）：e33984.

［4］Liu T，Laidlaw TM，F(xiàn)eng C，et al.Prostaglandin E2deficiency uncovers a dominant role for thromboxane A2in house dust mite-induced allergic pulmonary inflammation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（31）：12692-12697.

［5］Gregory LG，Jones CP，Walker SA，et al.IL-25drives remodelling in allergic airways disease induced by house dust mite［J］.Thorax，2013，68（1）：82-90.

［6］Bargut TC，F(xiàn)erreira TP，Daleprane JB，et al.Fish oil has beneficial effects on allergen-induced airway inflammation and hyperreactivity in mice［J］.PLoS One，2013，8（9）：e75059.

［7］Jung JH，Kang IG，Kim DY，et al.The effect of Korean red ginseng on allergic inflammation in a murine model of allergic rhinitis［J］.J Ginseng Res，2013，37（2）：167-175.

［8］Park YN，Lee YJ，Choi JH，et al.Alleviation of OVA-induced airway inflammation by flowers of Inula japonica in a murine model of asthma［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2011，75（5）：871-876.

［9］Kim SH，Kim BK，Lee YC.Effects of Corni fructus on ovalbumin-induced airway inflammation and airway hyper-responsiveness in a mouse model of allergic asthma［J］.J Inflamm（Lond），2012，9（1）：9.

［10］Kim MS，Cho KA，Cho YJ，et al.Effects of interleukin-9 blockade on chronic airway inflammation in murine asthma models［J］.Allergy Asthma Immunol Res，2013，5（4）：197-206.

［11］Zha WJ，Qian Y，Shen Y，et al.Galangin Abrogates Ovalbumin-Induced Airway Inflammation via Negative Regulation of NF-κB［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013：767689.

［12］Gong JH，Shin D，Han SY，et al.Blockade of Airway Inflammation by Kaempferol via Disturbing Tyk-STAT Signaling in Airway Epithelial Cells and in Asthmatic Mice［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013：250725.

［13］Manso L，Reche M，Padial MA，et al.Diagnostic tools assessing airway remodelling in asthma［J］.Allergol Immunopathol（Madr），2012，40（2）：108-116.

［14］Hofmann Bowman MA，Heydemann A，Gawdzik J，et al.Transgenic expression of human S100A12induces structural airway abnormalities and limited lung inflammation in a mouse model of allergic inflammation［J］.Clin Exp Allergy，2011，41（6）：878-889.

［15］Cho JY，Pham A，Rosenthal P，et al.Chronic OVA allergen challenged TNF p55／p75receptor deficient mice have reduced airway remodeling［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（8）：1038-1044.

［16］Mo JH，Chung YJ，Hayashi T，et al.The role of plasmacytoid and myeloid dendritic cells in induction of asthma in a mouse model and the effect of a TLR9agonist on dendritic cells［J］.Allergy Asthma Immunol Res，2011，3（3）：199-204.

［17］Takada E，F(xiàn)uruhata M，Nakae S，et al.Requirement of apoptosis-inducing kinase 1for the induction of bronchial asthma following stimulation with ovalbumin［J］.Int Arch Allergy Immunol，2013，162（2）：104-114.