焦 楊，班克臣，孔曉龍*，馮嫻婧

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，廣西南寧530021;2.Dept．of Surgery，University of Texas Medical School at Houston，Houston，Texas 77030，USA)

長期大劑量飲酒可致酒精性肝病，發(fā)生不同程度的肝脂肪變性、炎性和壞死，繼而形成肝纖維化和肝硬化。酗酒還被認(rèn)為是肝癌的高危因素。mTOR (mammalian target of rapamycin)信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長與增殖的一條關(guān)鍵通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡及自噬、蛋白質(zhì)合成、免疫、細(xì)胞運(yùn)動及代謝等大量的生命過程。核糖體S6 蛋白激酶 (P70 ribosomal protein S6 kinase，P70S6K)是mTOR 下游重要的效應(yīng)器。有報(bào)道乙醇可抑制許多組織和/或細(xì)胞中P70S6K 的活性［1］等。ERK 信號通路不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、移行、分化、凋亡和自噬，還介導(dǎo)炎性反應(yīng)［2］。然而，乙醇對肝細(xì)胞中ERK1/2的影響報(bào)道很少［3］，對肝細(xì)胞中P70S6K的影響及P70S6K 與ERK1/2的相互關(guān)系尚未見報(bào)道。因此，本研究擬對此進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

P70S6K 磷酸化(p-P70S6K)抗體、ERK1/2磷酸化(p-ERK1/2)抗體和β-actin 抗體(Cell signaling公司);PPARγ 抗體(Santa Cruz 公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗兔IgG 和ECL plus Western blot 檢測系統(tǒng)(GE Healthcare Biosciences 公司);蛋白質(zhì)測定試劑盒(Bio-Rad Laboratories 公司);蛋白分析儀(Bio-Rad 公司);細(xì)胞核/細(xì)胞漿抽提試劑盒(Nuclear/Cytosol Fractionation Kit)(BioVision 公司);T4 多聚核苷酸激酶試劑盒(Promega 公司);［γ-32P］ATP(Amersham 公司);篩網(wǎng)(EC588-100)、雷帕霉素(rapamycin)和U0126(Sigma 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng):給成年雄性SD 大鼠腹腔注射含20 mg/kg 甲苯噻嗪和61.5 mg/kg氯胺酮的混合麻醉劑麻醉，以Chee 氏液(pH 7.2)(含10 mmol/L HEPES、2.0 U/mL肝素和0.5 mmol/L EGTA)灌流肝臟至流出液中不含有血液，再改用含500 mg/L膠原酶的Chee 氏液進(jìn)行第2次灌流。灌流完成后將肝臟切碎并小心攪拌以游離肝細(xì)胞，以100 μm的篩網(wǎng)過濾，細(xì)胞懸浮液50 ×g離心2 min，所得細(xì)胞沉淀用含100 μmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的Chee 氏液洗滌2 次。然后接種于用鼠尾膠原預(yù)先包被(25 μg/孔)的6 孔板，1.0 ×106個(gè)/孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h至細(xì)胞貼壁，然后換不含地塞米松的Chee 氏培養(yǎng)液培養(yǎng)20 h。

1.2.2 乙醇對肝細(xì)胞中P70S6K 活性等的影響:在劑量-效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)中，在上述原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)孔中分別加入0、50、100 和200 mmol/L的乙醇，4 h后收集細(xì)胞檢測P70S6K 的表達(dá);在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)孔均加入200 mmol/L乙醇，分別培養(yǎng)0、1、2 和4 h后收集細(xì)胞，檢測P70S6K 的表達(dá)。重復(fù)樣本量為3。

另取細(xì)胞，在其中加入100 nmol/L雷帕霉素或10 μmol/L U0126，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot 分析和凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)。

1.2.3 Western blot:用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，測定蛋白質(zhì)濃度，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺膠電泳。電泳完成后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至Hybond膜，進(jìn)而用含5% 脫脂奶粉，0.1% 吐溫20的Tris 緩沖液室溫封閉膜1 h，分別加p-P70S6K、p-ERK1/2、PPARγ 和β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜。第2 天用含0.1%吐溫-20 的Tris 緩沖液洗去游離的抗體后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG 室溫孵育1 h，用ECL plus Western blot 檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。重復(fù)樣本量為3。

1.2.4 EMSA:用細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)抽提試劑盒提取細(xì)胞核蛋白并測定蛋白濃度，按照使用說明書進(jìn)行。雙鏈過氧化物酶體增殖反應(yīng)元件(PPRE)寡核苷酸探針序列為:5'-CAAAACTAGGTCAAAGGTCA-3'，用T4 多聚核苷酸激酶試劑盒以［γ-32P］ATP 標(biāo)記探針末端。取10 μg核蛋白、2 μL［γ-32P］標(biāo)記的探針、20 μL 結(jié)合緩沖液(內(nèi)含15 mmol/L HEPES、60 mmol/L KCl、0.5 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、75 mg/L poly (dI-dC)、100 mg/L 乙?；疊SA 和0.05% NP-40)，混合后室溫孵育20 min進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。冷競爭反應(yīng)時(shí)，以200 倍未標(biāo)記的探針加入結(jié)合反應(yīng)混合物中;超級遷移分析時(shí)，PPARγ 抗體在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)之后加入。上5% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后取下凝膠并干燥，以X 線片顯影，用Optimas 6.1 軟件分析圖像。重復(fù)樣本量為3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS13.0 處理，計(jì)量資料進(jìn)行t 檢驗(yàn)或F 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 乙醇對P70S6K 活性的影響

0、50 、100 和200 mmol/L 的乙醇處理后p-P70S6K的相對表達(dá)量逐漸降低(P＜0.01 或P＜0.05);在細(xì)胞中加入200 μmol/L乙醇，乙醇處理后0、1、2 和4 h 時(shí)p-P70S6K 的相對表達(dá)量逐漸降低(P＜0.01 或P＜0.05)(圖1)。

2.2 P70S6K 與ERK1/2的關(guān)系

乙醇處理后，p-P70S6K 和p-ERK1/2的相對表達(dá)量減少(P＜0.01)(圖2A)。另外，U0126 使p-ERK1/2和p-P70S6K 的表達(dá)均下降，雷帕霉素使p-P70S6K 表達(dá)下降而p-ERK1/2表達(dá)增加(P＜0.01或P＜0.05)(圖2B)。

2.3 乙醇對PPARγ 的影響

對照組和乙醇處理組PPARγ 相對表達(dá)量分別無顯著差異，EMSA 也未見乙醇使遷移距離發(fā)生改變(圖3)。

3 討論

長期大劑量飲酒可致肝脂肪變性、炎性反應(yīng)和壞死，而mTOR 信號通路和細(xì)胞的增殖、凋亡有關(guān)，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面也起重要的作用［4］。P70S6K是mTOR 信號通路的主要效應(yīng)器之一，常被用作mTOR 信號通路是否激活的指標(biāo)［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，乙醇對P70S6K 的活性有明顯的抑制作用，且存在量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系，提示乙醇的攝入可抑制mTOR 信號通路進(jìn)而可能引起肝脂肪變性、炎性反應(yīng)和壞死等。

圖1 乙醇對原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞中磷酸化P70S6K 的抑制有時(shí)間-效應(yīng)和濃度-效應(yīng)關(guān)系Fig 1 Ethanol inhibited the activity of p-P70S6K in rat primary hepatocytes in a time-and concentrationdependent manner

有研究表明，ERK1/2可以抑制mTOR 信號通路［6－7］;也有報(bào)道認(rèn)為ERK1/2 和肝脂肪變性有關(guān)［8］。本研究結(jié)果顯示，乙醇也抑制ERK1/2 的活性，用ERK1/2信號通路特異抑制劑U0126 處理細(xì)胞，ERK1/2活性被抑制的同時(shí)P70S6K的活性也被抑制，表明在肝細(xì)胞中ERK1/2抑制mTOR 信號通路。而有意思的是，用mTOR 特異抑制劑雷帕霉素處理細(xì)胞，抑制P70S6K 的活性但增強(qiáng)ERK1/2 活性，提示mTOR 可以反向調(diào)節(jié)ERK1/2，這種現(xiàn)象值得進(jìn)一步探討，同時(shí)也提示mTOR 和ERK1/2的關(guān)系比想象的要復(fù)雜。

圖2 原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中ERK1/2 對P70S6K 的調(diào)節(jié)作用Fig 2 ERK1/2 regulated P70S6K in primary hepatocyte

圖3 乙醇對PPARγ 表達(dá)的影響Fig 3 Ethanol did not affect the expression and activity of PPARγ

過氧化物酶增殖物激活受體PPRAγ 是脂類激活性轉(zhuǎn)錄因子，參與脂類平衡的調(diào)節(jié)，可通過激發(fā)與脂肪增殖有關(guān)的基因的表達(dá)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的分化［9］。有報(bào)道認(rèn)為，mTOR 和ERK1/2信號通路可調(diào)節(jié)PPRAγ［10］。因?yàn)橐掖伎梢砸种苖TOR 和ERK1/2信號通路，如果mTOR 和ERK1/2 信號通路調(diào)節(jié)PPRAγ，PPRAγ 的活性也應(yīng)該因此變化。然而EMSA結(jié)果表明，乙醇處理并不影響PPRAγ 的活性，提示乙醇導(dǎo)致的肝臟脂肪變性可能不是通過增加PPRAγ 的活性。

總之，本研究在肝原代細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)表明，乙醇可抑制mTOR 和ERK1/2 的活性。由于mTOR 和ERK1/2信號通路在細(xì)胞生物學(xué)中的重要性，進(jìn)一步研究乙醇對mTOR 和ERK1/2調(diào)節(jié)及對肝脂肪變性、炎性反應(yīng)和壞死的影響，對了解乙醇引起肝損害的機(jī)理及預(yù)防損害將有重要的意義。本研究只探討了乙醇短期內(nèi)對大鼠原代肝細(xì)胞中P70S6K 和ERK1/2活性的影響，其在動物慢性乙醇攝入模型及在和乙醇攝入有關(guān)的人肝臟標(biāo)本中的作用有待于進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

［1］Li Q，Ren J．Chronic alcohol consumption alters mammalian target of rapamycin (mTOR)，reduces ribosomal p70s6 kinase and p4E-BP1 levels in mouse cerebral cortex［J］．Exp Neurol，2007，204:840－844．

［2］盧宏柱，樊啟紅，劉丹，等．乙型肝炎病毒X 蛋白通過激活ERKs 和NF-κB 上調(diào)大鼠系膜細(xì)胞表達(dá)TNF-α［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:144－148．

［3］Cagnol S，Chambard JC．ERK and cell death:mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis，autophagy and senescence［J］．FEBS J，2010，277:2－21．

［4］Aroor AR，James TT，Jackson DE，et al．Differential changes in MAP kinases，histone modifications，and liver injury in rats acutely treated with ethanol［J］．Alcohol Clin Exp Res，2010，34:1543－1551．

［5］Delgoffe GM，Powell JD．mTOR:taking cues from the immune microenvironment［J］．Immunology，2009，127:459－465．

［6］Lantier L，Mounier R，Leclerc J，et al．Coordinated maintenance of muscle cell size control by AMP-activated protein kinase［J］．FASEB J，2010，24:3555－3561．

［7］Zoncu R，Efeyan A，Sabatini DM．mTOR:from growth signal integration to cancer，diabetes and ageing［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2011，12:21－35．

［8］Smathers RL，Galligan JJ，Stewart BJ，et al．Overview of lipid peroxidation products and hepatic protein modification in alcoholic liver disease［J］．Chem Biol Interact，2011，192:107－112．

［9］Whitehead JP．Diabetes:New conductors for the peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ)orchestra［J］．Int J Biochem Cell Biol，2011，43:1071－1074．

［10］Kudo Y，Tanaka Y，Tateishi K，et al．Altered composition of fatty acids exacerbates hepatotumorigenesis during activation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway［J］．J Hepatol，2011，55:1400－1408．