蔣松陽(yáng)

【摘要】 目的 體外分離培養(yǎng)人的炎癥牙周膜干細(xì)胞和正常的牙周膜干細(xì)胞，并從形態(tài)學(xué)和表面分子表達(dá)率比較兩種細(xì)胞的差別，為體外分離、培養(yǎng)炎癥牙周膜干細(xì)胞提供理論依據(jù)。方法 體外酶消化組織塊法培養(yǎng)牙周炎患者的炎癥牙周膜干細(xì)胞（iPDLSCs）和正常的人的牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs），體式顯微鏡下觀察細(xì)胞表面形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表型分子CD90、CD29、CD105、CD31、CD45、STRO-1進(jìn)行干細(xì)胞鑒定。

【關(guān)鍵詞】 牙周膜干細(xì)胞；炎癥

【中圖分類號(hào)】R781.4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-4949（2013）06-11-03

牙周炎導(dǎo)致牙周支持組織破壞，是成人失牙的主要原因[1]。牙周治療的主要目的是控制牙周組織炎癥，維護(hù)牙周組織健康，并使包括牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙周膜、牙齦在內(nèi)的牙周組織達(dá)到形態(tài)和功能上的再生與重建，這也是牙周病治療的終極目標(biāo)[2-4]。近年發(fā)展起來(lái)的組織工程技術(shù)為牙周組織再生治療開(kāi)辟了新途徑，種子細(xì)胞、信號(hào)分子和支架是牙周組織工程技術(shù)的三大要素，因此合理選擇種子細(xì)胞是牙周組織工程技術(shù)獲得成功的關(guān)鍵[5-6]，目前已確認(rèn)可用于牙周組織工程技術(shù)的種子細(xì)胞有胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞等[7-9]，其來(lái)源多為健康的人體組織，通常存在取材有創(chuàng)、來(lái)源有限等弊端，在一定程度上限制了臨床治療的可行性。許多研究表明在牙周炎時(shí)期也存在著組織的再生，而組織的再生離不開(kāi)干細(xì)胞的遷移，只有適當(dāng)類型的干細(xì)胞附著于根面，增殖并分化為功能性附著結(jié)構(gòu)（牙骨質(zhì)-牙周膜-牙槽骨）的各種細(xì)胞組分，配合適宜的刺激因子和基質(zhì)成分，才可能形成再生組織，否則可能僅產(chǎn)生修復(fù)[10]。Lin 等[11]對(duì)3名重度牙周炎（Ⅲ度根分叉病變）患者需要拔除的患牙行 GTR 手術(shù)，術(shù)后6周，切取其中2名患者患牙周圍的再生組織，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了STRO-1、CD146 和CD44 陽(yáng)性的細(xì)胞，同時(shí)拔除余下1名患者的患牙，取其再生組織進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)并傳代，用流式細(xì)胞儀分析得到 STRO-1、CD146 和 CD44 陽(yáng)性的細(xì)胞百分比分別為78.3%、94.9%和100%，所得細(xì)胞經(jīng)礦化和成脂誘導(dǎo) 4周后可分別形成礦化結(jié)節(jié)及脂滴，但其分化能力低于PDLSCs 和BMSCs。該實(shí)驗(yàn)證明了牙周炎癥再生組織中應(yīng)該存在具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。Chen 等[6]將臨床上因重度牙周炎而拔除的患牙制成組織切片，使用免疫組化染色觀察發(fā)現(xiàn)，在牙周炎患牙的牙周組織中，STRO-1、CD146 和CD44 陽(yáng)性細(xì)胞分布情況與健康牙周組織近似，而牙周膜干細(xì)胞表面的陽(yáng)性標(biāo)記物是STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、陰性標(biāo)記物是CD31 CD45，所以本實(shí)驗(yàn)利用STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、和CD31 CD45對(duì)牙周膜干細(xì)胞和炎癥牙周膜干細(xì)胞（i-PDLSCs）進(jìn)行鑒定。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

1.2 主要器械： 眼科剪、眼科鑷、刀柄、11 號(hào)刀片、平底培養(yǎng)皿、25cm2培養(yǎng)瓶、10ml離心管、平底 6 孔板（Corning，美國(guó)）、金屬濾器。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng)： 1）炎癥牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)（iPDLSCs）：取材：選取臨床上年齡在 30-45 歲之間的慢性牙周炎患者，收集其因重度牙周炎需要拔除的患牙，患牙無(wú)牙根吸收、根尖周炎和根尖囊腫等牙髓和根尖周疾病，刮取其炎癥牙周膜組織；漂洗組織：將獲得組織用 8 萬(wàn) U 慶大霉素浸泡 3-5min，用 PBS 反復(fù)漂洗 3 遍，將其剪成約 2mm×2mm×2mm 大小的組織塊；消化與接種：把漂洗后的組織塊收集到離心管中，然后加入1-2ml膠原酶，置于含有5% CO2、37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中消化，每15min 搖動(dòng)離心管一次，40min后拿出，然后吹打均勻，以800rpm 離心 6min，棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、200U/ml 慶大霉素和 100U/ml 青霉素的α-MEM，下同）再次吹打均勻，接種于 6孔板中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（5% CO2，37℃），每3d換液一次。2）健康牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)（PDLSCs）：取材：選取臨床上年齡在 20-35 歲之間的非牙周炎患者，收集其因正畸需要所拔牙齒或拔除的無(wú)炎癥的阻生第三磨牙，刮取其根中部 1/3 牙周膜；消化與接種：將獲得組織用 PBS 漂洗 3 遍，余步驟同上。

1.4.2 細(xì)胞的純化： 本次試驗(yàn)使用有限稀釋法對(duì)iPDLSCs和PDLSCs進(jìn)行純化，顯微鏡下觀察原代細(xì)胞鋪滿6孔板底達(dá) 80%匯合時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，用PBS 沖洗2遍，然后加入胰蛋白酶2ml消化2-3min，鏡下見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)漂浮在液體之上時(shí)加入等量的培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打數(shù)次后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，以800rpm 離心6min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，調(diào)整細(xì)胞密度至 10-20個(gè)/ml，以 1-2 個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔加入培養(yǎng)液100μl，次日挑選出單個(gè)細(xì)胞孔，將培養(yǎng)液加至200μl繼續(xù)培養(yǎng)，每3d 換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底 1/3-1/2時(shí)消化并接種培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.5 流式細(xì)胞儀表面分子鑒定： 取篩選培養(yǎng)的人牙周膜干細(xì)胞和炎癥牙周膜干細(xì)胞，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗兩遍，用胰蛋白酶2ml消化1min，α-MEN中和消化，1000r/min離心6min，棄上清，用含30%胎牛血清的PBS緩沖液將牙周膜細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度4.0x105/L，每個(gè)Eppendof管加400ul的細(xì)胞懸液，室溫下分別避光加入CD45-PE、CD31-PE、CD90-PE、STRO-1-FITC、CD29-FITC、CD105-PE小鼠抗人單克隆抗體2ul，4℃冰箱避光孵育2h，用含30%胎牛血清PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩到三遍，1000r/min離心5min，將細(xì)胞重懸于含30%胎牛血清PBS中，使用同型對(duì)照單克隆抗體確定背景標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀分析熒光細(xì)胞，專用配套軟件計(jì)算細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性率，單位用%表示。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞生長(zhǎng)情況： 使用酶消化組織塊法原代培養(yǎng)iPDLSCs 和 PDLSCs，接種3-7d后可以看到有細(xì)胞從組織塊周圍爬出，在遠(yuǎn)離組織塊的地方也有數(shù)個(gè)細(xì)胞爬出，大部分細(xì)胞大小均一，為成纖維細(xì)胞樣，呈長(zhǎng)梭形，少數(shù)細(xì)胞體積較小，呈多角形或橢圓形，胞漿豐滿，兩種細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異，PDLSCs接種2w 左右達(dá)80%匯合，iPDLSCs 接種 3w 左右達(dá)80%匯合。（圖1、2）

2.2 細(xì)胞純化情況： 炎癥牙周膜干細(xì)胞接種 96孔板后25d左右，約20%的單細(xì)胞孔細(xì)胞形成克隆并增殖鋪滿孔底 1/3-1/2，細(xì)胞排列密度大，細(xì)胞體積略小，呈梭形，9d左右可傳代一次。

健康牙周膜干細(xì)胞接種96孔板后15d左右，約30%的單細(xì)胞孔細(xì)胞形成克隆并增殖鋪滿孔底 1/3-1/2，細(xì)胞形態(tài)與炎癥牙周膜干細(xì)胞無(wú)明顯差異，7d左右可傳代一次。

2.3 流式細(xì)胞儀表面分子鑒定： 分離得到的PDLSCs和iPDLSCs具有干細(xì)胞的分子表型和較高的純度（圖3），即均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞分子陽(yáng)性（STRO-1、CD29、CD105、CD90），（CD31、CD45）為陰性，其中PDLSCs表面分子CD105的陽(yáng)性表達(dá)率為26.6%（圖A-1）、CD29的陽(yáng)性表達(dá)率為96.1%（圖A-2）、STRO-1的陽(yáng)性表達(dá)率為5.4%（圖A-3）、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率為85.2%（圖A-4），iPDLSCs表面分子CD105的陽(yáng)性表達(dá)率為50.2%（圖B-1）、CD29的陽(yáng)性表達(dá)率為95.3%（圖B-2）、STRO-1的陽(yáng)性表達(dá)率為7.0%（圖B-3）、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率為85.8%（圖B-4）

3 討論

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）是來(lái)源于牙周膜的成體干細(xì)胞，具有自我更新能力，能夠被誘導(dǎo)形成多種組織細(xì)胞，能夠維持牙周膜功能的穩(wěn)定，發(fā)揮生理性細(xì)胞更新和修復(fù)組織損傷的作用[12-13]。近年來(lái)許多學(xué)者利用PDLSC體外培養(yǎng)模型，在牙周組織疾病的發(fā)病機(jī)制及治療研究等方面取得了一定進(jìn)展，如何獲取大量的人牙周膜干細(xì)胞，是建立體外研究模型的關(guān)鍵之一。目前牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)主要有酶消化法和組織塊法，其中組織塊法被廣泛采用，但是它的培養(yǎng)成功率較低，近年來(lái)有些研究表明利用酶消化組織塊法來(lái)培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞，可以提高原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率[14]，采用該法我們成功培養(yǎng)出人炎癥牙周膜干細(xì)胞的原代，原代培養(yǎng)成功率達(dá)到了50%。

為了獲得更多的干細(xì)胞，我們采用傳統(tǒng)方法對(duì)原代炎癥牙周膜干細(xì)胞和健康牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行了純化，即對(duì)炎癥牙周膜干細(xì)胞和健康牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法，挑選單細(xì)胞克隆，繼而擴(kuò)大培養(yǎng)，克隆化生長(zhǎng)的能力至少滿足了干細(xì)胞應(yīng)具有克隆形成能力這一條件，為我們的鑒定工作奠定了一定的基礎(chǔ)，同時(shí)我們采用流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)鑒定炎癥牙周膜干細(xì)胞和健康牙周膜干細(xì)胞的表面分子，結(jié)果表明STRO-1、CD29、CD105、CD90為陽(yáng)性表達(dá)，CD31、CD45為陰性表達(dá)，并且兩種細(xì)胞的表面分子表達(dá)率并沒(méi)有明顯的不同。

4 結(jié)論

用酶消化組織塊培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞，能提高牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)成功率；炎癥牙周膜干細(xì)胞和健康牙周膜干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)基本相同；流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)、分離的PDLSCs和iPDLSCs具有干細(xì)胞的特性，并且兩種細(xì)胞的表面分子表達(dá)率并沒(méi)有明顯的不同。

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