肖剛峰　張懷勤

[摘要] 目的 觀察普伐他汀對培養(yǎng)人內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）數(shù)量、增殖、遷移、黏附及一氧化氮（NO）合成能力的影響。 方法 采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞，貼壁篩選法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，培養(yǎng)7 d后收集細(xì)胞并分別加入普伐他汀10 μmol/L及100 μmol/L，干預(yù)48 h， 免疫組化、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞， 分別觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量、增殖遷移黏附能力、細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、mRNA 的表達(dá)以及培養(yǎng)液中NO的水平。 結(jié)果 普伐他汀組促進(jìn)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增，并顯著改善外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附、遷移、增殖以及eNOS mRNA 表達(dá)和NO 合成的能力。 結(jié)論 他汀類藥物可增加培養(yǎng)人內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量并改善其功能。

[關(guān)鍵詞] 普伐他??；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)

[中圖分類號] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）06-0016-03

他汀類藥物是目前臨床上最常見的血脂調(diào)節(jié)藥物，廣泛應(yīng)用于動脈粥樣硬化、高脂血癥等疾病的防治，其作用機(jī)制為抑制膽固醇合成途徑的HMG-CoA還原酶，從而降低低密度脂蛋白膽固醇水平。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其除降脂作用外還存在非降脂作用，比如能改善血管內(nèi)皮功能，上調(diào)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的活性和NO的合成[1]。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）作為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，具有血管內(nèi)皮細(xì)胞相似的特性，不僅參與新生血管形成（angiogenesis）以及出生后血管生成（vasculogenesis），而且參與損傷內(nèi)皮的修復(fù)，在血管內(nèi)皮功能中扮演著重要的角色。為進(jìn)一步研究他汀類藥物改善內(nèi)皮功能的機(jī)制，本實驗觀察了普伐他汀對體外培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗血樣取自成年健康男性志愿者外周血約80 mL。普伐他汀由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究所贈予。MTT試劑、培養(yǎng)基M199（Sigma公司），F(xiàn)ITC-抗鈣黏著蛋白單克隆抗體（VE-Cadherin，Bender system TM 公司），PE-抗CD34單克隆抗體（CALTAG LABORATORIES），F(xiàn)ITC-抗CD133單克隆抗體（R&D公司）， PE-抗VEGFR-2單克隆抗體，Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL，Molecular Probe公司），Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），改良的Boyden 小室（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠），RT-PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司），內(nèi)皮型一氧化氮合成酶 PCR引物（上海生物工程有限公司），GAPDH引物（Clontech公司），NO測試盒（南京建成生物工程研究所）。其余為市售試劑。

1.2 方法

1.2.1 EPC的培養(yǎng)和鑒定 取成年健康男性新鮮外周血80 mL，加等體積Hanks液稀釋并混勻后采用離心法獲取單個核細(xì)胞，將細(xì)胞接種于包被纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)板中，M199培養(yǎng)基（包含有VEGF 10 ng/mL、20%胎牛血清、鏈霉素100 IU/mL及青霉素100 IU/mL）中培養(yǎng)，3 d后洗去未貼壁的懸浮細(xì)胞，更換相同培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

0.25%胰酶消化培養(yǎng)第6天貼壁細(xì)胞，制成單個細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分別檢測細(xì)胞VE-Cadherin、VEGFR-2、CD34及CD133表達(dá)。培養(yǎng)第6天將細(xì)胞與終濃度2.4 μg/mL 的Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-ac-LDL）避光共孵育4 h，洗去培養(yǎng)液后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光來檢測細(xì)胞對Dil-ac-LDL的攝取。細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的表達(dá)采用免疫組化法測定。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光細(xì)胞化學(xué)染色、免疫組化等結(jié)果，綜合判定培養(yǎng)細(xì)胞是否為人內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.2.2 分組 將培養(yǎng)第7天的各孔細(xì)胞消化下來并接種到24孔培養(yǎng)板上，接種密度為1×104/cm2。隨機(jī)分為3組：① 常規(guī)培養(yǎng)液的對照組，②10 μmol/L普伐他汀條件培養(yǎng)液的干預(yù)組，③100 μmol/L普伐他汀條件培養(yǎng)液的干預(yù)組。每組6孔，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行數(shù)量和功能的測定。

1.2.3計數(shù)EPC數(shù)量 在顯微鏡下對各孔具有典型內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的貼壁紡錘形細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)（×200各孔取上下左右中5個視野）。

1.2.4 檢測EPC黏附能力 消化各組貼壁細(xì)胞，重懸浮于1 mL培養(yǎng)液中，并計數(shù)，然后以同等數(shù)目接種在培養(yǎng)板上，培養(yǎng)30 min，洗去未貼壁細(xì)胞，計數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 檢測EPC增殖能力 消化各組貼壁細(xì)胞，重懸浮于1 mL培養(yǎng)液中，再將相同數(shù)目細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，每孔加10 μL MTT，培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，再每孔加入150 μL二甲基亞砜，于微量振蕩器充分振蕩10 min，置酶標(biāo)儀上于490 nm處測吸光度（OD值）。

1.2.6 檢測EPC遷移能力 消化各組細(xì)胞，重懸浮并計數(shù)。先將培養(yǎng)液100 μL加入改良Boyden小室的下室，再將2×104細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液150 μL中，注入上室，培養(yǎng)24 h，刮去濾膜上未移動的細(xì)胞，用甲醇固定，蘇木素染色，隨機(jī)選擇4個顯微鏡視野（×200），計數(shù)遷移的細(xì)胞。

1.2.7 檢測EPC eNOS表達(dá)和NO濃度 按照RT-PCR試劑盒要求操作提取各組細(xì)胞RNA并進(jìn)行RT-PCR（n=6），按照一氧化氮測試盒要求測試各組各孔培養(yǎng)液中NO的濃度（n=6）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以x±s表示，輸入SPSS13.0軟件包，采用t檢驗比較各組均數(shù)，P < 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPC的鑒定

培養(yǎng)3 d后即可見到大量放射狀的細(xì)胞集落以及圓形或不規(guī)則形狀的貼壁細(xì)胞（圖1A）。培養(yǎng)3～7 d，絕大多數(shù)細(xì)胞逐漸分化為梭形細(xì)胞，出現(xiàn)條索樣或軌道樣結(jié)構(gòu)。Dil-ac-LDL避光共孵育的細(xì)胞熒光顯微鏡下激發(fā)紅色熒光（圖1B），提示貼壁細(xì)胞吞噬Dil-ac-LDL。培養(yǎng)細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化呈陽性，胞漿顯棕色（圖1C）。培養(yǎng)第6天的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分析：表達(dá)VE-Cadherin、VEGFR-2、CD34、CD133的細(xì)胞分別為（55.28±3.66）%、（40.24±3.67）%、（52.21±3.52）%及（19.55±3.48）%。綜合細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光細(xì)胞化學(xué)染色、免疫組化結(jié)果證實培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。

2.2普伐他汀對EPC數(shù)量的影響

與對照組相比，普伐他汀干預(yù)組的貼壁細(xì)胞數(shù)更多，提示普伐他汀能增加培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量（t=7.5813、3.9338，P <0.01），見表1 ；兩不同濃度普伐他汀干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.6919，P > 0.05 ）。見表1。

2.3 普伐他汀對EPC黏附能力的影響

與對照組相比，普伐他汀干預(yù)組的貼壁細(xì)胞更多，提示普伐他汀能提高培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附能力（t=2.9773、6.4577，均P < 0.01）。干預(yù)組中以100 μmol/L組提高培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附能力較顯著（t=5.0081，P < 0.01）。見表1。

2.4 普伐他汀對EPC增殖能力的影響

與對照組相比，兩不同濃度普伐他汀干預(yù)組的OD值更高，提示普伐他汀能提高培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的能力（t=6.4111、8.7093，均P < 0.01）。干預(yù)組中以100 μmol/L組提高培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力較顯著（t=3.3714，P < 0.01）。見表1。

2.5 普伐他汀對EPC遷移能力的影響

與對照組相比，兩不同濃度普伐他汀干預(yù)組的遷移細(xì)胞數(shù)更多，提示普伐他汀能提高培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移的能力（t=8.2957、3.5791，均P < 0.05）干預(yù)組中以10 μmol/L組提高培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力較顯著（t=3.4946，P < 0.05）。見表1。

2.6普伐他汀對EPC eNOS表達(dá)的影響

見圖2，RT-PCR結(jié)果經(jīng)半定量分析，100 μmol/L普伐他汀干預(yù)組提高了培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞 eNOS表達(dá)[（0.91±0.45）% vs （0.50±0.31）%，t=1.8379，P < 0.05 ]；10 μmol/L普伐他汀條件培養(yǎng)液和100 μmol/L普伐他汀條件培養(yǎng)液干預(yù)組之間無明顯差異[（0.85±0.39） vs （0.91±0.45）%，t=0.2468，P > 0.05）]。

2.7普伐他汀對EPC NO合成的影響

與對照組相比，普伐他汀干預(yù)組的培養(yǎng)液NO濃度較高，提示普伐他汀能增加培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞 NO合成（60.76±7.26、71.25±11.26 vs 47.70±6.13，t=3.3668、4.4995，P < 0.05）；干預(yù)組中100 μmol/L普伐他汀條件培養(yǎng)液組NO濃度更高（t=1.9179，P < 0.05）。

3 討論

血管內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是動脈粥樣硬化形成的始動因子之一。其主要特征表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加以及內(nèi)皮源性的NO 合成、釋放和活性受損等。內(nèi)皮祖細(xì)胞是一群能定向分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的干/祖細(xì)胞，具有血管內(nèi)皮細(xì)胞相似特性但增殖能力更強(qiáng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管內(nèi)皮損傷修復(fù)中扮演著重要角色，內(nèi)皮損傷時除了相鄰成熟內(nèi)皮細(xì)胞延展修復(fù)外，還有相當(dāng)一部分是通過外周血中循環(huán)的內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢到損傷部位分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞來完成的[2，3]。更有研究發(fā)現(xiàn)冠心病等缺血性疾病患者血中的循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量下降和功能受損且易老化[4]。因此內(nèi)皮祖細(xì)胞有可能成為治療冠心病等缺血性疾病的一個新靶點。發(fā)現(xiàn)一些能改善內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量功能的藥物，將是防治冠心病等缺血性疾病的新途徑。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物不僅有降脂作用還存在非降脂作用，如改善血管內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)免疫以及改善胰島素抵抗等。在改善血管內(nèi)皮功能方面，他汀類藥物不僅能上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的活性和NO的合成，而且有研究提示他汀類藥物能增加缺血性疾病患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞水平[5]，并能促進(jìn)其動員增殖、凋亡減少、活性增加[6-8]。經(jīng)多年研究，他汀類藥物對成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞功能影響已經(jīng)較明確，如能減少凋亡、增加遷移黏附以及eNOS的活性、NO合成和分泌等等。但作為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞——內(nèi)皮祖細(xì)胞由于發(fā)現(xiàn)較晚，與他汀類藥物的作用關(guān)系研究仍較少。因其擁有與成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞相似的特性，比如能表達(dá)eNOS并合成分泌NO[9]。有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物增加循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的機(jī)制可能與NO的合成分泌有關(guān)[10]。故我們猜測他汀類藥物對內(nèi)皮祖細(xì)胞功能有類似影響。在本實驗中，筆者觀察到加入普伐他汀共培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量增加，增殖、遷移、黏附能力改善，eNos表達(dá)增強(qiáng)，NO的合成分泌增加。提示他汀類藥物能增加內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量并改善其增殖、遷移、黏附及分泌NO等能力。本實驗提示，他汀類藥物增加內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量以及改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的作用可能是其對整個血管內(nèi)皮功能改善的重要組成部分，是其防治冠心病、腦梗死等缺血性疾病的新依據(jù)。

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（收稿日期：2012-12-24）