丁凱利，李 娜，張夢曦，李璞玉，李碩果

食管癌是常見的消化道腫瘤之一，目前尚缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)患者確診時已處于中、晚期，對于不能耐受手術(shù)、放療、化療等的病人尚無有效治療措施。光動力療法(photodynamic therapy,PDT)是一種治療食管癌的新技術(shù)，PDT的基礎(chǔ)是光敏劑能在腫瘤組織中聚集，關(guān)于光敏劑在腫瘤組織聚集的機(jī)制尚不完全清楚。本實驗通過高效液相色譜法測定人永生化食管上皮細(xì)胞系SHEE及其癌變細(xì)胞系SHEEC內(nèi)photofrin-Ⅱ的濃度，探討腫瘤細(xì)胞對光敏劑的親和力度。

1 材料與方法

1.1對象人永生化食管上皮細(xì)胞系SHEE及其癌變細(xì)胞系SHEEC[1-3](由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院許麗艷教授惠贈)。

1.2主要試劑及儀器光敏劑photofrin-Ⅱ(加拿大Sinclair Pharmaceuticals公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、PBS液(美國GIBCO公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司產(chǎn)品)；倒置生物顯微鏡(日本NIKON公司產(chǎn)品)；超凈工作臺(江蘇蘇州凈化設(shè)備公司)；80-2型離心機(jī)(江蘇常州手術(shù)器械廠)；Agilent 1100 系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.3SHEE及SHEEC的培養(yǎng)、傳代SHEE及SHEEC在含10%小牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。

1.4實驗分組及處理分別取處于指數(shù)生長期的SHEE及SHEEC，0.25%胰蛋白酶消化，配制成1.0×105個/mL細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞系SHEE及SHEEC分別隨機(jī)分成13組，每組3復(fù)孔，PBS液沖洗3遍。處理后的13組細(xì)胞系SHEE及SHEEC在避光條件下更換為不含胎牛血清的DMEM/F12液配制的光敏劑photofrin-Ⅱ，光敏劑最終濃度分別為0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 min后，取出培養(yǎng)板，用PBS沖洗3遍。采用胰蛋白酶消化法消化細(xì)胞，每孔加入0.25%的胰蛋白酶0.5 mL，置于7℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中充分消化后置入5 mL離心管中，離心5 min，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，后在冰浴超聲中破碎細(xì)胞(功率400 W，作用時間3 s，間隔時間4 s，3次循環(huán))，待細(xì)胞破碎后離心，取上清液，加入高效液相色譜儀測定SHEE細(xì)胞和SHEEC細(xì)胞內(nèi)光敏劑Photofrin-Ⅱ的含量，探索SHEE和SHEEC細(xì)胞對光敏劑Photofrin-Ⅱ不同濃度的吸收規(guī)律。

1.5色譜儀器及條件所有實驗均在室內(nèi)溫度完成，ZORBAX SB-C18色譜柱，SB-C18保護(hù)柱，流動相：乙腈-水-0.1%TFA=45∶35∶20(V/V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：400 nm。經(jīng)超聲破碎后的細(xì)胞，于高速離心機(jī)中離心，12 000 r/min，10 min，吸取上清，0.22 μm孔徑濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取待測混懸液樣品1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入1 mol/L的NaOH 200 μL，充分搖勻。再加入乙酸乙酯3.0 mL，漩渦混合2 min后靜置30 min分層，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于另一錐底試管中，氮氣流吹干。用200 μL 流動相復(fù)溶，取復(fù)溶液于自動進(jìn)樣器的樣品瓶中，設(shè)定20 μL進(jìn)樣檢測。

2 結(jié)果

人永生化食管上皮細(xì)胞系SHEE及其癌變細(xì)胞系SHEEC在濃度分別為0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的光敏劑photofrin-Ⅱ孵育5 h，測定細(xì)胞內(nèi)光敏劑photofrin-Ⅱ濃度值，結(jié)果見表1。SHEE和SHEEC細(xì)胞經(jīng)在含photofrin-Ⅱ的培養(yǎng)液中孵育5 h后對光敏劑photofrin-Ⅱ吸收有差異(t=2.053，P=0.024)，SHEEC比SHEE細(xì)胞吸收photofrin-Ⅱ量多。

表1 細(xì)胞系SHEE和SHEEC在photofrin-Ⅱ不同濃度下孵育5 h濃度值 μg

3 討論

早期食管癌術(shù)后5 a生存率達(dá)90%，但一般病人就診已屬于中晚期，能手術(shù)治療者僅為20%，術(shù)后5 a生存率為30%，晚期放療的5 a生存率不到10%，單用化療效果不佳，說明了食管癌早診斷和早治療的必要性，加強(qiáng)手術(shù)與其他治療手段綜合治療研究的必要性。PDT是近30 a新興的治療腫瘤的方法，很多研究發(fā)現(xiàn)光動力對食管癌有獨特的療效。

PDT是指在特定波長光的作用下，使機(jī)體內(nèi)含光敏劑的組織細(xì)胞發(fā)生一系列化學(xué)生物變化的治療方法。其機(jī)理是利用機(jī)體攝取光敏劑后一定時期內(nèi)，光敏劑在腫瘤內(nèi)形成相對高濃度時，予以一定波長的光照射腫瘤局部，激發(fā)氧分子產(chǎn)生氧化能力極強(qiáng)的活性單態(tài)氧及自由基來破壞腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。PDT的基礎(chǔ)是腫瘤組織能選擇性攝取光敏劑，病灶部位光敏劑濃度相對正常組織高，而關(guān)于光敏劑在腫瘤組織聚集的機(jī)制尚不完全清楚，目前大概有腫瘤細(xì)胞親和力、血管親和力學(xué)說兩種假說。腫瘤細(xì)胞親和力學(xué)說是指光敏劑能在腫瘤細(xì)胞中聚集，Kessel等發(fā)現(xiàn)光敏劑與LDL有獨特親和力，而腫瘤細(xì)胞LDL受體上調(diào)可能是光敏劑聚集的原因[4]；也可能與腫瘤細(xì)胞過度生長導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞營養(yǎng)不良，缺少卟啉類物質(zhì)有關(guān)。血管親和力學(xué)說是由于腫瘤組織新生血管豐富，內(nèi)皮間隙較大，血管的通透性比較高，光敏劑從內(nèi)皮間隙大量泄漏，淋巴引流異常，導(dǎo)致光敏劑大量潴留[5]。

本課題組前期試驗通過熒光分光光度儀測定SHEE及SHEEC對photofrin-Ⅱ的吸收排出規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在一定時間內(nèi)SHEE及SHEEC對photofrin-Ⅱ的吸收排出規(guī)律無明顯差異[6]。但前期研究所采用的熒光分光光度儀法是利用photofrin-Ⅱ的熒光特性，測定SHEE 細(xì)胞和SHEEC細(xì)胞內(nèi)光敏劑的熒光強(qiáng)度值，為相對值，并不能完全反映photofrin-Ⅱ的絕對值。本實驗采取的高效液相色譜法，能直接測出photofrin-Ⅱ在SHEE 細(xì)胞和SHEEC細(xì)胞的絕對含量。

高效液相色譜法是指一種用液體為流動相的色譜分離分析方法，是在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測器等新實驗技術(shù)建立的一種液相色譜分析法，已在化學(xué)領(lǐng)域、藥學(xué)領(lǐng)域、食品分析領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前有關(guān)采用高效液相色譜法對卟啉類衍生物的分析分離的報道比較少見。雍政等[7]采用Waters510高效液相色譜儀，PolarlsCl8-A色譜柱，檢測波長為390 nm，以甲醇∶水∶乙腈∶四氫呋喃為流動相，流速為1.5 mL/min，檢測國產(chǎn)血卟啉注射液，發(fā)現(xiàn)該方法快速穩(wěn)定、重復(fù)性好，能較好地用于測量該藥物的含量。

本實驗采用Agilent1100系列高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18色譜柱，流動相為乙腈-水-三氟乙酸，流速為1.5 mL/min，能較好地檢測出photofrin-Ⅱ在細(xì)胞懸液中的含量。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞系SHEE及SHEEC在photofrin-Ⅱ中孵育5 h，SHEEC吸收Photofrin-Ⅱ的量較SHEE多，提示食管癌細(xì)胞系SHEEC對photofrin-Ⅱ有獨特親和力，這為進(jìn)一步揭示光動力療法的靶向治療原理提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 沈忠英,岑山,蔡維佳,等.人乳頭狀瘤病毒18型E6E7基因誘導(dǎo)人胚食管上皮永生化[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 1999，13: 121-124.

[2] Shen ZY,Xu LY,Chen XH,et al.The genetic events of HPV-immortalized esophageal epithelium cells[J]. Int J Mol Med,2001,8: 537-524.

[3] 沈忠英,蔡維佳,沈健,等.人乳頭狀瘤病毒18型E6E7和TPA協(xié)同誘發(fā)人胚食管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究[J].病毒學(xué)報,1999,15:1-5.

[4] Kessel D.The role of low-density lipoprotein in the biodistribution of photosensitizing agents[J].Photochem Photobiol B,1992,14:261-262.

[5] Iyer AK,Greish K,Seki T,et al.Polymeric micelles of zinc protoporphyrin for tumor targeted delivery based on EPR effect and singlet oxygen generation[J].Drug Target，2007,15:496-506.

[6] Gao SG,Wang LD,Feng XS,et al.Absorption and elimination of photofrin-II in human immortalization esophageal epithelial cell line SHEE and its malignant transformation cell line SHEEC[J].Ai Zheng,2009,12:1248-1254.

[7] 雍政,何冰,王蕭.國產(chǎn)血卟啉注射液的高效液相色譜質(zhì)量檢測[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,20:964-965.