張 樂，彭 燮，劉 揚，付常振，王洪寶，2＊，昝林森，2＊

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100；2.國家肉牛改良中心，陜西楊凌712100）

牛肉是我國傳統(tǒng)的高檔消費肉類制品，具有瘦肉多、脂肪少、蛋白高、膽固醇低等特點，其必需氨基酸含量均衡，具有較多的維生素和微量元素，是人類理想的食品之一［1］。衡量牛肉品質(zhì)的一個重要指標是牛肉的大理石花紋含量。大理石花紋含量的多少主要由肌肉脂肪含量的多少決定。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid－binding proteins，F(xiàn)ABPs）參與脂類代謝和脂肪的沉積的調(diào)控，它的表達與肌內(nèi)脂肪含量有密切聯(lián)系。尤其是脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白基因（adipocyte fatty acid－binding protein，A－FABP），研究表明A－FABP只在脂肪中表達，對于脂肪的沉積可以在不同水平起到一定的調(diào)控作用［2－5］。Briggs等（1993）從Hela 細胞核中抽提純化出來的一種蛋白，它能夠和固醇調(diào)節(jié)元件蛋白相結(jié)合，故稱為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白，即SREBP。它是動物體內(nèi)脂肪合成的一個極重要的調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)動物體內(nèi)與脂肪生成相關的酶（生脂酶）的基因轉(zhuǎn)錄水平而調(diào)節(jié)這些酶的活性，從而控制體內(nèi)脂肪合成。大量研究己經(jīng)證實，SREBPs在脂肪合成基因的營養(yǎng)調(diào)控中有著極其重要的作用［6－8］。

秦川牛是我國著名的地方黃牛品種，肉役性能突出，遺傳穩(wěn)定，適應性強，但也同時存在生長速度較慢、脂肪沉積能力較弱等不足之處［9］。大連雪龍黑牛是以遼寧本地黃牛為基礎，通過引進利木贊和日本和牛進行三元雜交而成的優(yōu)質(zhì)肉牛雜交組合［10］，其脂肪沉積能力強，肉質(zhì)鮮嫩，飽和脂肪酸低、膽固醇含量也低、不飽和脂肪酸高［11］。因此，揭示秦川牛與雪龍黑牛脂質(zhì)代謝的分子調(diào)控機制，可為應用分子育種技術加快秦川牛的肉用選育和改良奠定基礎。

本研究利用qRT－PCR 檢測A－FABP基因和SREBP1基因在牛體內(nèi)不同組織中的表達特性，以及揭示這兩個基因在脂肪沉積能力存在顯著差異的秦川牛和雪龍黑牛脂肪、肌肉和肝臟組織中的表達差異，為優(yōu)質(zhì)肉牛品種的選育奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

國家肉牛改良中心種質(zhì)資源庫－80℃保存的3月齡荷斯坦牛心臟、脾臟、肝臟、肺、腎、肌肉、脂肪、瓣胃、網(wǎng)胃、皺胃、瘤胃、大腸、小腸等13種組織，用于分析A－FABP和SREBP1的表達規(guī)律。

3頭30月齡左右大連雪龍黑牛閹牛和3頭30月齡秦川牛閹牛肌肉、脂肪、肝臟用于比較AFABP和SREBP1在脂肪沉積能力存在顯著差異的肉牛中表達差異。

1.2 RT－PCR

1.2.1 不同品種牛組織總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

使用TRIzol法提取組織RNA（按照說明書操作），并用瓊脂糖凝膠電泳檢測法和分光光度計檢測法進行質(zhì)量檢測。將符合要求的所提取的組織總RNA 用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄（總體積40μL∶8μL PrimeScript RT Master Mix，2μg總RNA，用RNase free dH2O 補足40μl），反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃，15min；85 ℃，5s；4℃（反應需在冰上進行）。得到的cDNA 置于－20℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 引物設計 PCR 擴增所用引物全部根據(jù)GenBank 提供的有關mRNA 序列用PrimerPremier（5.0版）自行設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 實時定量PCR 引物信息Table 1 Primers for genes

1.2.3 實時熒光定量技術 使用SYB?Premix Ex TaqⅡ試劑盒（TakaRa 公司產(chǎn)品）進行實時定量PCR，反應總體系為20μL，其中包括SYB?Premix Ex TaqⅡ10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ROX Reference Dye（50X）0.4μL，模板2μL，水6μL。在7500Real Time PCR儀（ABI公司產(chǎn)品）上進行反應。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火34s，循環(huán)40次，進行數(shù)據(jù)分析。溶解曲線程序為：95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

首先將樣品設置相同的閾值線（應用SPSS16.0軟件計算重復樣品間Ct均值及標準偏差），本研究分別以：（1）荷斯坦牛的肝臟組織中目標基因的表達量為標準。（2）用待測候選基因的Ct值減去對應組織內(nèi)參基因GAPDH 的Ct值就得到每種組織的ΔCt值，選擇ΔCt值最大的秦川?；蚴茄埡谂＝M織作為標準。采用2－△△Ct方法處理數(shù)據(jù)［12］，分析得到（1）目標基因A－FABP和SREBP1 在荷斯坦牛13種組織中的表達情況。（2）目標基因A－FABP和SREBP1在秦川牛和雪龍黑牛脂肪、肌肉和肝臟組織中的相對表達量。具體公式為：

ΔCT1＝CTmean（對照組目標基因）－CTmean（對照組GAPDH）

ΔCT2＝CTmean（待測組目標基因）－CTmean（待測組GAPDH）

RQ ＝2－（ΔCT2－ΔCT1）＝2－△△CT

式中：mean代表均值；CTmean（對照組目標基因）指的是對照組目標基因的3個樣品的mRNA 平均表達量；CTmean（待測組目標基因）指的是待測組目標基因的3 個樣品的mRNA 平均表達量；RQ 值（Relative Quantification，相對定量）表示試驗組目的基因的表達相對于對照組變化的倍數(shù)。所得到的的基因的相對表達量用SPSS16.0軟件進行方差分析，P＜0.05則認為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦牛A－FABP 和SREBP1基因的組織表達規(guī)律分析

以肝臟組織中目標基因的表達量為參照，所有荷斯坦牛組織中目標基因A－FABP相對表達量的分析結(jié)果見圖1，分析數(shù)據(jù)可得在3月齡荷斯坦牛13種組織中，A－FABP在脂肪組織中表達量遠遠高于其他組織，在瘤胃，網(wǎng)胃，瓣胃和肺中有少許表達，其他組織幾乎不表達。

以肌肉組織中目標基因的表達量為參照，所有荷斯坦牛組織中目標基因SREBP1的相對表達量見圖1，分析數(shù)據(jù)可知在3月齡荷斯坦牛13種組織中，SREBP1在脂肪組織中表達量最高，在腎，瘤胃和脾臟中有少許表達，其他組織幾乎不表達。

2.2 A－FABP 基因在秦川牛、雪龍黑牛的肌肉、脂肪、肝臟中的組織表達規(guī)律分析

通過數(shù)據(jù)分析A－FABP基因在雪龍黑牛和秦川牛的肌肉、脂肪、肝臟中的相對表達量可知如（圖2），A－FABP基因在雪龍黑牛肌肉和肝臟組織中的表達量顯著高于秦川牛的肌肉和肝臟（P＜0.05），而在脂肪組織中，秦川牛和雪龍黑牛表達量無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 荷斯坦牛A－FABP和SREBP1組織表達差異分析A.A－FABP 基因各組織表達結(jié)果；B.SREBP1基因各組織表達結(jié)果；1.肌肉；2.脂肪；3.肝臟；4.心臟；5.肺；6.腎；7.脾臟；8.瘤胃；9.網(wǎng)胃；10.瓣胃；11.皺胃；12.大腸；13.小腸Fig.1 A－FABP and SREBP1expression difference in tissues of Holstein cattleChart A displayed the A－FABP gene expression in different tissues；chart B for that of SREBP1gene.1.Muscle；2.Fat；3.Liver；4.Heart；5.Lung；6.Kidney；7.Spleen；8.Rumen；9.Reticulum；10.Omasum；11.Abomasums；12.Large intestine；13.Small intestine

圖2 － 基因在秦川牛和雪龍黑牛肌肉脂肪和肝臟組織中的表達比較＊表示差異顯著（P＜0.05），＊＊表示差異極顯著（P＜0.01）。下同。Fig.2 A－FABP expression difference in muscle，fat，liver in Qinchuan cattle and Snowdragon cattle＊ marked sighificout difference amons given data（P＜0.05）.The same as below.

2.3 SREBP1基因在秦川牛、雪龍黑牛的肌肉、脂肪、肝臟中的組織表達規(guī)律分析

SREBP1基因在雪龍黑牛和秦川牛的肌肉、脂肪、肝臟中的相對表達量見圖3。通過數(shù)據(jù)分析可知，SREBP1基因在雪龍黑牛肌肉和肝臟組織中的表達量顯著高于秦川牛的肌肉和肝臟，而在脂肪組織中，秦川牛表達量顯著高于雪龍黑牛表達量（P＜0.05）。

圖3 SREBP1基因在秦川牛和雪龍黑牛肌肉、脂肪和肝臟組織中的表達比較Fig.3 SREBP1expression difference in muscle，fat，liver in Qinchuan cattle and Snowdragon cattle

3 討論

我國養(yǎng)牛歷史悠久，而且具有十分豐富的牛品種資源。然而據(jù)調(diào)查報告顯示，我國牛肉產(chǎn)量雖占世界第三，但出口量卻不及國際牛肉貿(mào)易量的1%［13］。國內(nèi)生產(chǎn)的牛肉中優(yōu)質(zhì)牛肉所占比重太小，在國際上缺乏競爭力。值得人們關注的是現(xiàn)在的牛肉市場尤其是對口感鮮嫩多汁、大理石花紋豐富，并含有大量人體所需脂肪酸的優(yōu)質(zhì)高檔牛肉需求量與日俱增［14］。在亞洲，日本、韓國都育成了風味獨特、肉質(zhì)細嫩、各具特色的和牛、韓牛，它們所產(chǎn)牛肉大理石花紋豐富，我國亟待解決的問題是培育優(yōu)良的肉牛品種［15］。首先需關注我國肉牛品種的肉質(zhì)性狀改良進程，而深層次探索與之相關的基因具有至關重要的意義。據(jù)目前研究證明A－FABP與SREBP1對調(diào)節(jié)脂肪代謝起著重要的作用。因而進一步研究這兩種基因在脂肪代謝中的調(diào)節(jié)規(guī)律顯然有助于培育優(yōu)良的高檔牛肉品種。

A－FABP是脂結(jié)合蛋白超家族的成員［16］。FABPs家族的主要功能是與哺乳動物的脂肪酸代謝有關［17］。目前對A－FABP基因的研究多數(shù)集中于對其分子結(jié)構的研究上。而其在組織中相對表達量的差異主要在雞、鴨、豬上。例如，Armstrong等［18］對豬A－FABP基因的組織表達規(guī)律進行差異分析，采用Real－Time PCR 方法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFABP基因都只在脂肪組織中表達。王啟貴等［19］選擇周齡不同的雞的肝組織、腎臟組織、心臟組織、肺臟組織、脾臟組織、脂肪組織等15種組織，利用熒光定量PCR 和Northern blot 方法，檢測雞AFABP基因在上述組織中的表達規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFABP基因僅在雞脂肪組織中表達。李文娟等［20］以矮腳雞、白來航雞和北京油雞3種公、母不同和日齡各異的脂肪為材料，采用熒光定量PCR，檢測AFABP基因在所測組織中的相對表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的性別、不一樣的品種、不同的日齡對AFABP基因的表達量有顯著差異。張紅等［21］采用實時定量Real－Time PCR 法對鴨A－FABP基因在所采取的組織中的表達規(guī)律進行差異分析。證實該基因在脂肪組織中表達量最高，在心臟、肌胃、肝等組織中均有少許表達，而在其它組織中幾乎不表達。2009年，楊志剛等［22］對朗徳鵝的A－FABP基因的表達規(guī)律采用Real－Time PCR 方法檢測。研究表明，該基因在肝臟中的表達量最高，脂肪僅次于肝臟，腦組織中的表達量是所有組織中最少的一個組織。這些研究均證明A－FABP基因與脂肪的代謝有著密不可分的關系，但在不同的物種中該基因的表達量不同。本研究結(jié)果顯示A－FABP基因在荷斯坦牛脂肪組織中的表達量遠遠高于其他組織。

SREBP－1的作用主要包括調(diào)控脂肪細胞的分化，以及類固醇和脂肪酸的合成過程。SREBP－1基因可以直接調(diào)節(jié)脂肪沉積，還可參與脂肪生成相關基因的表達水平的調(diào)控，間接調(diào)節(jié)脂肪的生成。目前對SREBP－1基因的研究也主要集中在豬、雞、兔上。例如，2001年，Gondret等使用Northern印跡法對SREBPmRNA 豬、雞、兔的組織中的表達量在進行檢測分析，預測SREBP－1和SREBP－2這兩個基因在肝臟和脂肪這兩種組織間的相對表達量的高低［23］。SREBP－1 mRNA 在兔的肝臟以及脂肪組織中從表達水平上看幾乎保持在一個水平，在雞的脂肪組織中SREBP－1 mRNA 的表達水平比在肝臟中低了近乎3 倍左右［24］。除此之外，SREBP信號轉(zhuǎn)導途徑在脂肪代謝性疾病研究中起著重要的作用［25］。本研究檢測SREBP－1基因在牛的組織中的相對表達量，發(fā)現(xiàn)SREBP1基因在荷斯坦牛的所有組織中均有表達，但在脂肪組織中表達量最高。

秦川牛和雪龍黑牛的選育代表了我國肉牛育種中兩種主流方法，秦川牛采用本品種選育，保持了其耐粗飼、抗逆性強、肉質(zhì)風味獨特等優(yōu)良特性，雪龍黑牛是采用雜交育種方式獲得優(yōu)質(zhì)肉牛雜交組合，其生長速度以及脂肪沉積能力顯著高于秦川牛。本試驗旨在通過這比較A－FABP和SREBP1基因在秦川牛和雪龍黑牛中的表達差異，從而為確定影響牛肉質(zhì)性狀的候選基因奠定良好地基礎。本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)A－FABP基因在雪龍黑牛肌肉和肝臟組織中的表達量顯著高于秦川牛的肌肉和肝臟，而在脂肪組織中，秦川牛和雪龍黑牛表達量無顯著差異。SREBP1基因在雪龍黑牛肌肉和肝臟組織中的表達量顯著高于秦川牛的肌肉和肝臟，而在脂肪組織中，秦川牛表達量顯著高于雪龍黑牛表達量。研究結(jié)果均顯示A－FABP和SREBP1在脂肪中表達量最高，推測其在牛脂肪組織的脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，對脂肪的沉積起到一定的調(diào)控作用，值得深入研究。

［1］孔保華，陶 菲，刁新平.中國肉牛產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢［J］.肉類研究，2002，（1）：10－13.

［2］Ebert T，Hopf L M.Circulating adipocyte fatty acid binding protein is increased in chronic and acute renal dysfunction［J］.Nutrition，Metabolism and Cardiovascular Diseases，2014，4：1－8.

［3］葉滿紅，文 杰，曹紅鶴，等.脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白基因多態(tài)性與雞肉［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2007，38（6）：526－532.

［4］龔道清，張 紅，顧志良，等.鴨脂肪酸結(jié)合蛋白基因的克隆和序列多態(tài)性分析［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2007，38（3）：232－236.

［5］何 俊.鴨L－FABP和A－FABP基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪的相關性及其對脂肪代謝相關基因的影響［D］.浙江杭州：浙江大學，2013.

［6］Walker A K，Jacobs R L，Watts J L，et al.A conserved SREBP－1／phosphatidylcholine feedback circuit regulates lipogenesis in metazoans［J］.Cell，2011，147（4）：840－852.

［7］許會芬.山羊SREBP－1基因的超表達對脂肪酸代謝相關基因表達的影響［J］.生物工程學報，2012，28（11）：1 306－1 316.

［8］徐 麗，朱 淼.SREBP1基因多態(tài)性與西門塔爾牛肌內(nèi)脂肪含量相關性進行了分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)學報，2012，32（9）：1 312－1 316.

［9］劉 波，陳 宏，藍賢勇.秦川牛及其雜種牛生長性能及雜種優(yōu)勢研究［J］.中國畜牧雜志，2006（2）：2－3.

［10］Stoeckman A K，Towle H C.The role ofSREBP－1cin nutritional regulation of lipogenic enzyme gene expression［J］.J Biol Chem，2002，277（30）：27 029－27 035.

［11］柴新娥.雪龍黑牛的肉營養(yǎng)特點及飼養(yǎng)管理措施［J］.養(yǎng)殖技術顧問，2012（11）：1 673－1 921.

［12］Liu Ling.Relative quantitative detection of HLA－G mRNA expression in patients with endometriosis by 2－△△CTmethod［J］.China Healthy Birth and Genetic Magazine，2007，15（9）：25－26.

［13］昝林森，趙春平，劉 揚，等.中國肉牛產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、熱點透析與發(fā)展趨勢及對策［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報，2009，11（5）：1－5.

［14］張路培，袁崢嶸.中國高檔牛肉市場現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢展望［J］.中國畜牧雜志，2012，48（4）：34－37.

［15］王曉磊.肉牛業(yè)困境亟待改變［J］.當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2009，（12）：57－60.

［16］Ockner R K，Manning J A，Poppenhausen R B.A binding protein for fatty acids in cytosol of intestinal mucosa，liver，myocsrdium and other tissues［J］.Science，1972，177：56－58.

［17］Martin G G，Danneberg H，Kumar L S，et al.Decreased liver fatty acid binding capacity and altered liver lipid distribution in mice lacking the liver fatty acid－binding protein gene［J］.J Biol Chem，2003，278（24）：21 429－21 438.

［18］Armstrong M K，Bernlohr D A，Strorch J et al.The purification and characterization of a fatty acid binding protein specific to pig adipose tissue［J］.Biochemistry，1990，267（2）：373－378.

［19］王啟貴.雞FABP基因克隆、表達特性及功能研究［D］.黑龍江哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2004.

［20］李文娟，李宏賓，文 杰，等.雞H－FABP和A－FABP基因表達與肌內(nèi)脂肪含量相關研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2006，375（2）：417－423.

［21］張 紅.鴨A－FABP基因和H－FABP基因的克隆、表達和功能研究［D］.江蘇揚州：揚州大學，2006.

［22］楊志剛，葛文華，王 雷.A－FABP基因內(nèi)含子2多態(tài)性及A－FABP基因在鵝組織中的差異表達研究［J］.中國畜牧雜志，2009，45（17）：3－8.

［23］Gondret F，F(xiàn)erre P，Dugail I.ADD－1／SREBP－1is a major determinant of tissue differential lipogenic capacity in mammalian and avian species［J］.J Lipid Res，2001，42（1）：106－113.

［24］Yin L，Zhang Y，Hillgartner F B.Sterol regulatory elementbinding protein－1interacts with the nuclear thyroid hormone receptor to enhance acetyl－CoA carboxylase－alpha transcription in hepatocytes［J］.J Biol Chem ，2002，277（22）：19 554－19 565.

［25］吳妍霖，肖惠玲，王 濤，等.SREBP信號轉(zhuǎn)導途徑在代謝性疾病研究中的應用［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2014，16（3）：72－74.