姜大力 賈秀月 王偉群

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154002)

趨化因子生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因(CXCL5)5是促血管生成性趨化因子家族中的一員，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，具有很強(qiáng)的粒細(xì)胞趨化作用。CXCL5與受體CXCR2結(jié)合行使生物學(xué)效應(yīng)。CXCL5可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌、胃癌及子宮內(nèi)膜癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。本研究擬探討CXCL5在胃癌中的表達(dá)及意義，有望為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1對(duì)象 收集佳木斯市各醫(yī)院2012年1～5月經(jīng)臨床確診的胃癌標(biāo)本36例，切取胃標(biāo)本中新鮮癌組織(去除壞死組織)和正常黏膜組織(距癌組織10 cm以外，病理學(xué)證實(shí)無(wú)癌浸潤(rùn))各兩份，一份標(biāo)本切下后立刻投入液氮罐中，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱內(nèi)保存，用于提取RNA，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)。另一份標(biāo)本4%甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行常規(guī)病理檢查和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。男23例，女13例，平均年齡59歲。高中分化18例，低分化18例。TNM分期，Ⅰ/Ⅱ期13例，Ⅲ/Ⅳ期23例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例。所有患者術(shù)前均未接受化療和放療，經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)診斷。

1.2主要試劑 RNA提取試劑Trizol、RNA酶抑制劑、dNTPs等熒光定量PCR試劑、兔抗人趨化因子配體5抗體購(gòu)自TaKaRa公司，SP免疫組化試劑盒及DAB染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3免疫組化方法 采用SP法。2 μm厚石蠟切片脫蠟水化。經(jīng)高壓抗原修復(fù)，依次加入一抗及二抗后，DAB底物顯色。蘇木素染核，中性樹(shù)膠封固。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)200倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均百分比進(jìn)行計(jì)分，再根據(jù)染色的強(qiáng)弱進(jìn)行計(jì)分。二者的計(jì)分相加。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法 引物利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，根據(jù)GenBank查找mRNA序列，由TaKaRa公司合成?？鐑?nèi)含子序列，以保證擴(kuò)增的特異性。CXCL5引物為：正義5′-GACGGTGGAAACAAGGAAAA-3′；反義5′-GCTTAAGCGGCAAA-CATAGG-3′。GAPDH引物為：正義5′-CGACCACTTTGTCAAG-CTCA-3′；反義5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′。

按試劑盒說(shuō)明Trizol提取總RNA。取總RNA1 μg在PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA：oligo(dt)primer 1 μl，DEPC H2O補(bǔ)齊至12 μl，70℃孵育5 min，置冰上，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1 μl，10 mmol/L dNTP mix 2 μl，37℃孵育5 min，置冰上，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，42℃60 min，70℃熱滅活10 min，分裝置-20℃冰箱內(nèi)保存。25 μl PCR反應(yīng)體系：模板2 μl，10×PCR 緩沖液2.5 μl，2 mmol/L dNTP mix 1 μl，上下游引物各1 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，Takara Taq DNA聚合酶0.25 μl，ddH2O 15.75 μl。94℃預(yù)變性3 min，然后94℃45 s，58℃45 s，72℃45 s，30次循環(huán)，然后72℃7 min，最后至4℃終止。制備1.5%及2%瓊脂糖凝膠電泳，取PCR產(chǎn)物18 μl加入6×上樣緩沖液3 μl上樣，另取DNA marker 5 μl，在0.5×TBE電泳緩沖液中以120 V電壓電泳30 min后，紫外燈光下觀察結(jié)果。攝像儀將含有產(chǎn)物條帶的電泳圖像掃入電腦，通過(guò)凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的基因條帶。進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0 軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 CXCL5在胃癌組織中的表達(dá)量為10.02±3.91，明顯高于在胃正常上皮組織的表達(dá)量(1.76±0.48)(P<0.000 1)。

2.2免疫組化分析結(jié)果 CXCL5蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕色顆粒；胃正常組織中大部分細(xì)胞呈陰性表達(dá)。36例癌旁胃正常組織中，CXCL5蛋白陽(yáng)性表達(dá)12例(33.33%)；36例胃癌組織中CXCL5蛋白陽(yáng)性表達(dá)26例(72.22%)。兩組間CXCL5蛋白表達(dá)率比較差異顯著(χ2=10.92，P=0.000 9)。

3 討 論

CXC趨化因子是一組和腫瘤血管生成關(guān)系密切的因子，也是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因子之一。CXCL5與其受體CXCR2結(jié)合并介導(dǎo)其趨化作用及血管新生的促進(jìn)作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，微環(huán)境中的血管扮演著重要的角色，其不但促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲，而且還參與腫瘤的轉(zhuǎn)移〔1〕。Li等〔2〕研究表明，胰腺癌中 CXCL5 可以激活A(yù)kt和STAT 等信號(hào)通路最終介導(dǎo)腫瘤組織血管的生成。另外，腫瘤細(xì)胞可以自分泌和旁分泌CXCL5 從而促進(jìn)其自身的存活和增殖。在A549細(xì)胞株和鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株Calu 1中顯示CXCL5是促血管生長(zhǎng)因子〔3〕。Park等〔4〕研究證實(shí)，CXCL5的高表達(dá)與晚期胃癌及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些表明，CXCL5 參與了腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明CXCL5在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。這可能由于 CXCL5與受體CXCR2結(jié)合后作用于酪氨酸激酶受體，從而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化運(yùn)動(dòng)及抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等一系列促進(jìn)腫瘤血管新生的生物學(xué)效應(yīng)〔5〕。 此外，CXCL5與特異性受體CXCR2結(jié)合后還可通過(guò)MAPK和PI3K信號(hào)通路，活化轉(zhuǎn)錄因子ELK1，從而激活一系列與腫瘤形成相關(guān)的基因表達(dá)〔6〕。CXCL5的過(guò)表達(dá)能提高胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移〔7〕。

4 參考文獻(xiàn)

1王偉群，李 揚(yáng)，李潤(rùn)生.前列腺癌的間質(zhì)微環(huán)境變化〔J〕.生殖與避孕，2008；28(6):367-70.

2Li A，King J，Moro A，etal.Over expression of CXCL5 is associated with poor survival in patients with pancreatic cancer〔J〕.Am J Pathol，2011；178(3):1340-9.

3Arenberg D，Keane M，DiGiovine B，etal.Epithelial-neutrophil activating peptide (ENA-78) is an important angiogenic factor in non-small cell lung cancer〔J〕.J Clin Invest，1998；102(3):465-72.

4Park JY，Park KH，Bang S，etal.CXCL5 overexpression is associated with late stage gastric cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2007；133(11):835-40.

5Manna SK，Ramesh GT.Interleukin-8 induces nuclear transcription factor-kappaB through a TRAF6-dependent pathway〔J〕.Biol Chem，2005;280(8):7010-21.

6Maxwell PJ，Gallagher R，Seaton A，etal.HIF-1 and NF-kB-mediated upregulation of CXCR1 and CXCR2 expression promotes cell survival in hypoxic prostate cancer cells〔J〕.Oncogene，2007;26:7333-45.

7Jin Kim Sun，Hisanori Uehara.Expression of interleukin-8 correlates with angiogenesis，tumorigenicity，and metastasis of human prostate cancer cells implanted orthotopically in nude mice〔J〕.Neoplasia,2001;3(1):33-42.