李光超，車念聰,耿建國，趙 暉，王志強，郭新新，白 辰

(1．首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京 100069； 2．北京市平谷區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,北京 101200)

“肝腎同源”是中醫(yī)的經(jīng)典理論之一，是指肝腎的結(jié)構(gòu)和功能雖有差異但其起源相同,生理病理密切相關(guān),可采用“腎肝同治”的治療法則[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropahy, DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，其主要的病理變化是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[2]。研究顯示，TGF-β/Smad通路的激活是該病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，激活的TGF-β/Smad通路可以增加細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)中各種成分的表達，加速ECM進行性積聚，從而導(dǎo)致腎小球硬化[3]。α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin, a-SMA)被認(rèn)為是肌成纖維細胞(myofibroblast,MyoF)的標(biāo)志蛋白，肌成纖維細胞具有活躍的增殖和分泌膠原的能力，是細胞外基質(zhì)的主要來源，而細胞外基質(zhì)沉積增多是DN的主要病理特征[4]。血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是一種潛在的促有絲分裂的細胞因子，主要分布于增生的毛細血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和增生的腎小球細胞中。PDGF的過度表達可以促進系膜細胞增生和細胞外基質(zhì)沉積，進而引起腎纖維化[5]。與此同時，在發(fā)生肝損傷時，上述指標(biāo)也可以發(fā)生相應(yīng)改變。基于此，本實驗在中醫(yī)“肝腎同源”理論的指導(dǎo)下，通過觀察中藥方劑加味消渴康對糖尿病腎病大鼠肝組織TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF治療前后表達的影響，探討其對DN大鼠肝臟的保護作用，從而為臨床糖尿病腎病“肝腎同治”提供實驗依據(jù)。

1 材料

SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量 160～180 g，鼠齡2～3月，購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部(動物合格證號SCXK(京) 2006-0009)；加味消渴康[6](為首都醫(yī)科大學(xué)耿建國教授治療糖尿病腎病的經(jīng)驗方，由生黃芪、山萸肉、生薏苡仁、水蛭、葛根、丹參、決明子組成)購自北京祥威藥業(yè)公司；氯沙坦購自杭州默沙東制藥有限公司(生產(chǎn)批號100438)。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)美國Sigma公司；大鼠TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF ELISA試劑盒上海藍基生物科技有限公司；全自動多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特)。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組

本實驗采用單側(cè)腎切除加腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制作DN大鼠模型：將造模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，行右側(cè)腎臟切除術(shù)。術(shù)后2周，禁食12 h，按50 mg / kg劑量進行單次腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素。72 h后尾靜脈采血，用sure-step血糖儀測定大鼠血糖，用尿糖試紙測大鼠隨意尿糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿糖定性>+++，確定DN造模成功[7]。將造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、氯沙坦組(5.2 mg/kg·d-1)、加味消渴康小劑量組(13.125 g/kg·d-1)、加味消渴康中劑量組(26. 25 g/kg·d-1)、加味消渴康大劑量組(52. 5 g/kg·d-1)，另取10只大鼠作為正常對照組，每日1次，連續(xù)灌胃12周，正常組和模型組每日灌服2 ml蒸餾水。

2.2 標(biāo)本采集和觀察指標(biāo)檢測

各組大鼠于第12周末進行肝臟取材，每只取肝組織150～200 mg，以肝組織質(zhì)量：生理鹽水量比例為1∶7。在冰浴中制備勻漿后4 ℃ 3000 r/min離心20 min，取上清液0.1 ml放入4 ℃冰箱備用。取出大鼠TGF-β1、Smad-4、α-SMA和PDGF Elisa試劑盒，室溫25～30 ℃放置30 min。取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品次序分別加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。空白微孔中加入50 μL的樣品，空白對照加入50 μL的蒸餾水。在各孔中加入100 μL的酶標(biāo)記物溶液(不含空白對照孔)。將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37 ℃孵育反應(yīng)1 h(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度)。充分清洗酶標(biāo)板5次，保持各孔有充足的水壓(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋)。酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A、B各50 μL后，37 ℃避光反應(yīng)10～15 min。各孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝中TGF-β1、 Smad-4、a-SMA、PDGF含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組大鼠的TGF-β1、 Smad-4、a-SMA、PDGF含量均有不同程度降低(P<0.01或P<0.05)；其中中藥大、中劑量組與中藥小劑量組比較，Smad-4含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)。

表1 各組大鼠肝組織TGF-β1，Smad-4、a-SMA和PDGF比較

注：與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01;與中藥小劑量組比較：#P<0.05,##P<0.01

4 討論

研究顯示，糖尿病腎病大鼠可以存在早期肝纖維化[8]。究其原因，西醫(yī)認(rèn)為可能與持續(xù)的高血糖導(dǎo)致糖原在肝臟蓄積、發(fā)生微血管病變以及人體內(nèi)分泌紊亂等進而波及肝臟有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，肝腎在生理上關(guān)系密切，病理上相互影響，即“肝腎同源”。故當(dāng)腎臟發(fā)生損害時,肝臟的生理功能也會受到影響，發(fā)生肝損傷。

中醫(yī)認(rèn)為，肝屬木，主疏泄、藏血，主筋華爪，開竅于目，具有升發(fā)、喜條達、惡抑郁、體陰而用陽的特性。腎屬水，主藏精、納氣，主生長發(fā)育和生殖，主骨生髓，開竅于耳，為人體的先天之本。在生理上，肝腎為子母關(guān)系，其氣相通，肝木得到腎水的滋養(yǎng)才能得以維持正常的生理功能。同時，腎藏精、肝藏血、 “精血同源”，肝中之血與腎中之精可以相互化生、相互充養(yǎng)。本實驗的研究對象為DN大鼠，而糖尿病腎病的中醫(yī)基本病機為本虛標(biāo)實、虛實夾雜，本虛以脾腎虧虛為主，標(biāo)實則指痰濁、水濕、瘀血、毒邪等。由于該病發(fā)展是一個慢性過程，故病久必侵襲腎絡(luò)，導(dǎo)致腎絡(luò)瘀滯，即“久病入絡(luò)”。而中醫(yī)認(rèn)為肝腎之氣互通、精血互化，故腎臟的損傷必然會導(dǎo)致肝的藏血和疏泄等功能受損，最終致使肝之血行不暢而發(fā)生肝絡(luò)瘀阻。

從實驗結(jié)果可以看出，模型大鼠肝組織TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF的表達與正常組比較均有一定程度的升高。研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1/Smad通路的激活可以促進肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)合成膠原、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細胞外基質(zhì),促進金屬蛋白酶組織抑制物的分泌,下調(diào)降解蛋白酶的合成而減少ECM的降解,進而使ECM沉積增多[9]。而a-SMA為HSC的細胞骨架表型，若肝臟中出現(xiàn)a-SMA陽性細胞，則提示HSC向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，故α-SMA可作為HSC激活的一個標(biāo)志[10]。PDGF則是一種強有力的促有絲分裂原，它不僅可以促進HSC的活化、分裂、增殖、遷移，且與TGF-β具有協(xié)同促纖維化作用[11]。由此看來，上述指標(biāo)都與HSC的激活有著直接或間接的聯(lián)系。而激活的HSC可以通過增加ECM生成并降低ECM的降解，最終致使細胞外基質(zhì)增多。同時，ECM在肝臟的過度聚集勢必會影響肝臟正常的血行，導(dǎo)致其血流不暢，而這也恰與中醫(yī)的“瘀血”病機甚為相似。因此，筆者推斷該過程可能是導(dǎo)致肝絡(luò)瘀阻的發(fā)生機制之一。在用中藥進行干預(yù)后，DN大鼠肝中TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF的表達均有不同程度的降低趨勢，說明該方對DN大鼠肝損傷具有正向的調(diào)節(jié)作用。即在治療腎臟的同時，大鼠肝損傷也得到了一定的修復(fù)，此結(jié)果也與中醫(yī)的“肝腎同源”理論相符，并為其提供了一定的實驗依據(jù)。由此可知，在糖尿病腎病大鼠中，肝腎既可“同病”亦可“同治”，其既有理論推斷又有實驗依據(jù)。

本研究顯示，在糖尿病腎病發(fā)生時，肝臟中TGFβ1、Smad-4、a-SMA和PDGF也發(fā)生了不同程度的改變，說明糖尿病腎病大鼠存在肝損傷。這就提示在臨床上在治療糖尿病腎病的同時，也需要保護肝臟，而對于肝損傷病理形態(tài)學(xué)的觀察及其他指標(biāo)的檢測則有待進一步的研究。

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