邱修柄，成 堅(jiān)*，肖麗瓊，李勇波

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225）

黃酒以大米、黍米為原料，一般酒精含量為14%vol～20%vol，屬于低度釀造酒。黃酒含有21種氨基酸，其中包括數(shù)種未知氨基酸，且8種必需氨基酸黃酒都具備，故被譽(yù)為“液體蛋糕”。但是在品評(píng)黃酒的過程中，經(jīng)常遇到酒的“后味”偏苦，針對(duì)這個(gè)問題，本次試驗(yàn)通過從釀酒原料、酒曲添加量、酒藥添加量和主發(fā)酵溫度4個(gè)因素研究對(duì)黃酒的苦味影響，以改善黃酒風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精白糯米、糙白糯米、精黑糯米、糙黑糯米、精白粳米、酒曲、酒藥：梅州市成氏酒業(yè)提供；2-辛醇：美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈、乙醇（分析純）：瑞典歐譜生公司；酪醇標(biāo)品、冰乙酸分析純、NaCl（分析純）、0.5%對(duì)二甲胺基苯甲醛一硫酸溶液、混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、衍生劑鄰苯二甲醛（o-phenylenediamine，OPA）、氯甲酸芴甲酯（fluorenylmethy chloroformate，F(xiàn)MOC）及硼酸鹽緩沖溶液、磷酸二氫鈉、福林酚試劑甲、乙液、牛血清蛋白（分析純）：廣州化學(xué)化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25PH計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市鑫騰科普儀器有限公司；FA1004磁力加熱攪拌器：金壇市富華儀器儀表有限公司；電熱恒溫水浴鍋：廣州市康恒儀器有限公司；YBFJ-110酒精計(jì)：河北省故仙粵興玻璃儀表廠；1100型高效液相色譜儀、4.6mm×150mm 5-Micron 氨基酸分析柱、4.6mm×250mm×5μm ZORBAX Eclipse Plus C18柱：美國(guó)安捷倫科技有限公司；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；721分光光度計(jì)：上海精密儀器科學(xué)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃酒加工工藝流程

1.3.2 苦味值的測(cè)定

感官評(píng)定方法：感官評(píng)定小組由5人組成，評(píng)定員用蒸餾水漱口之后，取待評(píng)定液2mL入口中，10s后吐出，漱口后取與之味道相近之標(biāo)準(zhǔn)液品嘗，如確認(rèn)兩味近，即可將待評(píng)定液的苦味值定為該標(biāo)準(zhǔn)液的苦味值，否則需取其他標(biāo)準(zhǔn)嘗，直至確定苦味值。取5人評(píng)定的平均值。標(biāo)準(zhǔn)液：按MOGENSEN L等[1]，的方法配制，以奎寧為基準(zhǔn)，經(jīng)評(píng)定a（a=3×10-6mol/L）為下限，剛好沒有苦味；32a為上限，再增加苦味基本上不增加；中間溶液濃度成倍增加，苦味值也相應(yīng)增加。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[2]。

表1 苦味值的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation criteria of bitterness

1.3.3 黃酒中醇酯類的測(cè)定[3]

樣品處理：聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）萃取頭使用前先在氣相色譜進(jìn)樣口275℃活化30min；于50mL容量瓶中加入正辛醇（2.59mg/mL，作為內(nèi)標(biāo)）0.4mL，用酒樣稀釋至刻度，再移取5mL酒樣于頂空瓶中，并加入1.5g NaCl，旋緊蓋子密封，將PA萃取頭及頂空瓶在55℃磁力攪拌器上攪拌30min，取出萃取頭，進(jìn)行GC/MS分析。

GC條件：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25mm）毛細(xì)管柱。程序升溫：起始溫度為55℃，保留3min，以4℃/min的速度升至140℃，最后以15℃/min的速度升至220℃，后運(yùn)行10min。進(jìn)樣口溫度：220℃；GC進(jìn)樣解吸時(shí)間：10min。分流比：10∶1；載氣：He；流量為1mL/min。

MS條件：離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量：70eV；全掃描。檢測(cè)器溫度：220℃。

1.3.4 黃酒中雜醇油含量的測(cè)定[4]

無雜醇油乙醇制備：取0.1mL按GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中操作方法檢查不顯色，如果顯色需進(jìn)行處理。雜醇油標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.080g異戊醇和0.020g異丁醇于100mL容量瓶中，加無雜醇油乙醇50mL，再加水稀釋至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于1mg雜醇油，置低溫保存。吸取雜醇油標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0mL于50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于0.1mg雜醇油。

操作步驟：

（1）樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的準(zhǔn)備：吸取0.5mL酒樣于10mL比色管中為樣品管，再分別吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.0mL雜醇油標(biāo)準(zhǔn)使用液（相當(dāng)于0mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg雜醇油）置于10mL比色管中。

（2）分析：分別于樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管中各準(zhǔn)確加水至1mL，搖勻后放入到冷卻水中沿管壁加2mL對(duì)二甲胺基苯甲醛-硫酸溶液，同時(shí)搖勻后放入沸水浴中加熱15min后取出，立即放入冰浴中冷卻，立即各加2mL水混勻，冷卻10min后用1cm比色皿以零管調(diào)零，于波長(zhǎng)520nm處測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

1.3.5 黃酒中酪醇的測(cè)定[5]

樣品的處理：超聲脫氣過的酒樣直接上樣。

色譜條件：C18柱，柱溫30℃；甲醇-水-冰乙酸（40∶59∶1，v/v）溶液為流動(dòng)相，流速0.75mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，進(jìn)樣量1～10μL，采用峰面積外標(biāo)法定量。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制：以體積分?jǐn)?shù)20%的酒精為溶劑，配制酪醇100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別進(jìn)樣1.0μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL，以峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

1.3.6 黃酒中氨基酸的測(cè)定[6-7]

樣品處理：取約10mL的酒樣，離心后，用純水稀釋10倍，用1%的活性炭脫色10s左右，用濾紙過濾后取濾液用0.45μm的濾膜過濾，放入小瓶壓蓋作為供試品，待測(cè)游離氨基酸。

氨基酸色譜分析條件：采用柱前OPA、FMOC衍生化，梯度洗脫的方式進(jìn)行色譜分析；色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。

流動(dòng)相A：0.04mol/L NaH2PO4緩沖溶液（pH7.8）；流動(dòng)相B：乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10，v/v）。

洗脫程序：時(shí)間T（min）/流動(dòng)相B（%）：0/0；1.9/0；18.1/57；18.6/100；22.3/100；23.2/0；26/0；檢測(cè)波長(zhǎng)：338nm（OPA）；262nm（FMOC）；柱溫：40℃；流速：2mL/min。

1.3.7 黃酒中苦味肽的測(cè)定[7-8]

樣品處理：各取酒樣50mL加入50mg單寧酸，攪拌30min后靜置過濾，棄去初濾液5mL，吸取30mL濾液加入30mL異丁醇萃取10min，靜置吸取醇相1mL于50mL容量瓶中定容。此液為樣品稀釋液。

福林酚試劑甲：將溶液A 50mL和溶液B 1mL混合即成，現(xiàn)用現(xiàn)配。

溶液A：1g Na2CO3溶于50mL的0.1mol/L NaOH溶液中。

溶液B：將1%硫酸溶液和20g/L酒石酸鉀鈉溶液等體積混合而成。

牛血清蛋白：精確稱取牛血清蛋白，配制成100μg/mL溶液。

分析步驟：吸取樣品稀釋液1mL，加入試劑甲3mL，置于25℃中水浴保溫10min，再加入試劑乙0.3mL，立即混勻、保溫30min，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測(cè)定A750nm值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照，求出樣品的苦味肽含量。

2 結(jié)果及分析

2.1 原料對(duì)苦味的影響

以糙白糯米、糙黑糯米、精白糯米、精黑糯米為原料生產(chǎn)酒基測(cè)定其苦味值及苦味成分。從表2可知，糙米的高級(jí)醇、苦味氨基酸以及苦味肽、糠醛的含量都稍高精白后的米，而黑糯米的苦味物質(zhì)又稍高于白糯米的苦味物質(zhì)。由于精白米脫去了果皮種皮糊粉層，所以蛋白質(zhì)含量低于糙米，蛋白質(zhì)含量高，發(fā)酵生成的氨基酸、高級(jí)醇含量就高，具苦味的氨基酸含量也增加。且糙米米皮中的半纖維素、多縮戊糖在發(fā)酵和殺菌受熱生成糠醛等物質(zhì)，使酒具苦澀味。因此以糙米為原料的黃酒其苦味物質(zhì)普遍多于精米所釀黃酒。黑糯米的蛋白質(zhì)含量比普通早秈米的蛋白質(zhì)含量高10.4%，比普通的晚秈米高22.1%[10]。因此黑糯米中的苦味物質(zhì)較白糯米高，黑糯米中的強(qiáng)心苷、生物堿、植物甾醇等多種生理活性物質(zhì)都是具有苦味的物質(zhì)，所以其苦味值較白糯米高，但其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較白糯米高。原料蛋白質(zhì)含量的控制，能夠降低黃酒的苦味值，因此適當(dāng)提高米的精白度，并除去米糠、麥桿、麥殼等雜質(zhì)能降低其苦味值[9]。

表2 不同原料黃酒苦味成分表Table 2 Bitter ingredients in different rice wine

2.2 酒曲用量對(duì)苦味的影響

從表3可以看出，當(dāng)酒曲添加量較大時(shí)，酒曲中酸性蛋白酶和酸性羧（基）肽酶數(shù)量較多，主發(fā)酵時(shí)生成氨基酸、高級(jí)醇數(shù)量多且各種霉菌孢子后期大量自溶入酒內(nèi)，霉菌孢子給酒產(chǎn)生強(qiáng)烈苦味，給黃酒帶來較重苦味；當(dāng)酒曲添加量較少時(shí)此2種酶數(shù)量少，則酵母繁殖緩慢，發(fā)酵不正常，酵母繁殖缺少營(yíng)養(yǎng)將導(dǎo)致細(xì)胞提早自溶，產(chǎn)生苦味氨基酸，苦味肽含量將偏高，影響黃酒風(fēng)味和穩(wěn)定性。另外隨著酒曲用量的增加苦味肽含量略有減少，其原因是酒曲中能分解肽的酶有所增加[10-11]。

表3 不同酒曲量黃酒苦味成分Table 3 Bitter ingredients rice wine with different koji addition

2.3 主發(fā)酵溫度對(duì)苦味的影響

主發(fā)酵溫度較高，則酵母的繁殖倍數(shù)增加，酵母發(fā)酵過程中能將更多的氨基酸轉(zhuǎn)換成高級(jí)醇。而且溫度適當(dāng)?shù)奶岣吣苁拱l(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶的活力提高，從而將更多的氨基酸轉(zhuǎn)換成高級(jí)醇。從表4可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，苦味肽含量略有降低[12-13]。

表4 不同主發(fā)酵溫度黃酒苦味成分表Table 4 Bitter ingredients of rice wine with different fermentation temperature

2.4 工藝優(yōu)化[14-16]

以酒藥添加量、酒曲添加量、主發(fā)酵溫度為因素，苦味值為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，因素水平見表5，結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 黃酒發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素水平Table 5 Factors and levels of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

表6 黃酒發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results and analysis of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

表7 黃酒發(fā)酵條件正交試驗(yàn)方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test for optimization of rice wine fermentation conditions

由表7可得，各因素指標(biāo)的極差均大于空列的極差，所以A、B、C各因素的效應(yīng)都存在。由方差分析可看出，各因素均沒有顯著性影響。其原因可能是由于試驗(yàn)主觀因素較大，且因素的自由度都較小，使檢驗(yàn)的靈敏度降低，從而掩蓋了考察因素的顯著性判斷。但仍然可以看出，各因素對(duì)黃酒苦味影響的大小依次為C＞B＞A。因此按照各因素的最好水平選取出最好的水平組合為C2B2A2，即主發(fā)酵溫度均為30℃；酒曲添加量為10%，酒藥添加量為0.8%。在此最佳發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，成品苦味值評(píng)分平均值為2.3。

3 小結(jié)與討論

3.1 糙米的高級(jí)醇，苦味氨基酸以及苦味肽的含量都稍高精白米，而黑糯米的苦味物質(zhì)又稍高于白糯的苦味物質(zhì)。

3.2 隨著酒藥用量的增加高級(jí)醇含量先減少再增加，而苦味氨基酸則先增加后減少。

3.3 當(dāng)酒曲添加量較大時(shí)，主發(fā)酵時(shí)生成氨基酸、高級(jí)醇數(shù)量則多；當(dāng)酒曲添加量較少時(shí)此兩種酶數(shù)量少，產(chǎn)生苦味氨基酸，苦味肽含量將偏高。

3.4 主發(fā)酵溫度較高，酵母發(fā)酵過程中能將更多的氨基酸轉(zhuǎn)換成高級(jí)醇；隨著發(fā)酵溫度的升高，苦味肽含量略有降低。

3.5 酒藥添加量、酒曲添加量、主發(fā)酵溫度各因素的效應(yīng)都存在。各因素對(duì)黃酒苦味影響的大小依次為主發(fā)酵溫度＞酒曲添加量＞酒藥添加量。最好的水平組合為主發(fā)酵溫度30℃；酒曲添加量10%，酒藥添加量0.8%。

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