蔣燚,陳晶晶,田豐,楊敏

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430065)

環(huán)戊丙酸睪丸酮中有機(jī)溶劑殘留量的檢測

蔣燚,陳晶晶,田豐,楊敏

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430065)

目的 建立測定環(huán)戊丙酸睪丸酮中有機(jī)溶劑殘留量的氣-固頂空氣相色譜法。方法色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm),載氣為高純氮?dú)?流速為1.5 mL·min-1,分流比為20∶1,柱溫采用程序升溫;檢測器為氫火焰離子檢測器(FID),溫度230℃;進(jìn)樣口溫度220℃;頂空加熱溫度70℃,頂空平衡時(shí)間40 min,以正丙醇為內(nèi)標(biāo)計(jì)算含量。結(jié)果甲醇、乙醇、苯、吡啶完全分離,分別在4.17～2.50×103μg·g-1(r=0.999 9),4.18～2.51×103μg·g-1(r=0.999 6),0.84～172 μg·g-1(r=0.998 1),2.95～1.77×103μg·g-1(r=0.999 9)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;最低檢出濃度分別為2.08,1.23,0.28,0.87 μg·g-1;加樣平均回收率分別為102.2%(RSD=4.0%),99.6%(RSD=1.9%),112.6% (RSD=5.6%),98.9%(RSD=1.6%)。結(jié)論該法可靠、靈敏、準(zhǔn)確,適用于環(huán)戊丙酸睪丸酮中有機(jī)溶劑殘留量的測定。

環(huán)戊丙酸睪丸酮;有機(jī)溶劑殘留量;色譜法,氣-固頂空氣相

環(huán)戊丙酸睪丸酮分子式為C27H40O3,是一種人工合成的雄性激素,易溶于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)。由于環(huán)戊丙酸睪丸酮在合成過程中使用甲醇、乙醇、苯和吡啶等有機(jī)溶劑,而這些有機(jī)溶劑在人用藥注冊技術(shù)國際協(xié)調(diào)會(international conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human Use,ICH)[1]列屬規(guī)定控制限量的溶劑,故有必要對原料藥中的有機(jī)溶劑殘留進(jìn)行檢測。筆者曾采用氣-液頂空色譜法,由于苯在DMSO溶液中溶解度較大,使其檢測限高于《中華人民共和國藥典》2010年版規(guī)定的限度。氣-固頂空法樣品無需溶劑溶解,從而避免上述問題。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)ICH和《中華人民共和國藥典》2010版附錄[2]對有機(jī)溶劑殘留量測定的指導(dǎo)原則,建立測定環(huán)戊丙酸睪丸酮原料藥中甲醇、乙醇、苯和吡啶殘留量的氣-固頂空氣相色譜法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent GC7890色譜儀,CTC Analytics HTC-PAL自動(dòng)進(jìn)樣器,CHEMSTATIONS3.0色譜工作站(安捷倫科技有限公司),賽多利斯BP211D電子分析天平(德國賽多利斯股份公司),艾柯純水器(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試劑與藥品 甲醇(上海振興化工一廠,批號: 20130901-2,純度:99.5%)、乙醇(上海振興化工一廠,批號:20130425-3,純度:99.8%)、苯(天津市福晨化學(xué)試劑廠,批號:20130201,純度:99.5%)、吡啶(天津市化學(xué)試劑研究所,批號:20130301,純度:99.5%)、正丙醇(廣州化學(xué)試劑廠,批號:20130904,純度:99.5%)均為市售色譜純,無水碳酸鈣(上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司,批號:20100701,純度:99.0%,使用前于105℃烘箱中烘2 h),實(shí)驗(yàn)用水為超純水,環(huán)戊丙酸睪丸酮原料(武漢三晶化工有限公司,純度:99.6%,批號: 20120620)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 色譜柱 DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(3 0 m× 0.32 mm,0.25 μm);柱溫:初溫75℃(3 min),以30℃·min-1升至130℃,保留2 min;進(jìn)樣口溫度: 220℃;氫火焰離子檢測器(flame,ionization detector, FID)檢測器溫度:230℃;載氣:高純氮?dú)?分流比: 20∶1;柱流速:1.5 mL·min-1。

2.1.2 頂空萃取條件 頂空加熱溫度:70℃;頂空平衡時(shí)間:40 min;進(jìn)樣量:250 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 內(nèi)標(biāo)物溶液的配制 取正丙醇0.251 5 g精密稱定,置25 mL量瓶,用水稀釋至刻度,混勻,即得10.06 mg·mL-1正丙醇內(nèi)標(biāo)儲備溶液。取內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋10倍,得1.01 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制 分別取甲醇0.152 00 g、乙醇0.151 08 g、苯0.010 30 g,吡啶0.101 00 g精密稱定,置10 mL量瓶,用水稀釋至刻度,搖勻,配成甲醇、乙醇、苯、吡啶濃度分別為15.20,15.11,1.030,10.10 mg·mL-1對照品儲備液;取對照品儲備液1 mL與內(nèi)標(biāo)液1 mL至10 mL量瓶,用純水稀釋至刻度,配成甲醇、乙醇、苯、吡啶、正丙醇濃度分別為1.52,1.51,0.103,1.01,2.01 mg·mL-1對照品溶液;取200 μL于10 mL頂空進(jìn)樣瓶中,加入無水碳酸鈣0.3 g,壓蓋密封,即得。

2.3 分離度實(shí)驗(yàn) 取5種毛細(xì)管色譜柱HP-5(30 m× 0.32 mm,0.25 μm)、AT.SE-30(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)、AT.OV-1301(30 m×0.32 mm,1 μm)、AT. PEG-20M(30 m×0.32 mm,0.25 μm)、DB-WAX (30 m×0.32 mm,0.25 μm),在同一色譜條件下進(jìn)行比較。結(jié)果表明,HP-5和DB-WAX色譜柱各峰分離度(R)均大于1.5,峰形良好。但HP-5色譜柱中吡啶拖尾較嚴(yán)重,故最終選用DB-WAX色譜柱,見圖1。

2.4 系統(tǒng)適用性測試 按上述色譜條件,取對照品溶液頂空進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果各峰之間均分離良好(R>2),而4種目標(biāo)溶劑峰的理論塔板數(shù)均大于100 000。見圖2。

2.5 檢測限與定量限的測定 將對照品儲備液逐級稀釋,按上述色譜條件頂空進(jìn)樣,測得甲醇、乙醇、苯、吡啶的檢測限(S/N=3)分別為2.08,1.23,0.28, 0.87 μg·g-1;定量限(S/N=10)分別為9.17,4.18, 0.84,2.95 μg·g-1。

2.6 線性關(guān)系考察 將對照品儲備液逐級稀釋,各加入正丙醇內(nèi)標(biāo)儲備溶液。按上述色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜圖。以目標(biāo)溶劑的濃度為橫坐標(biāo),各目標(biāo)溶劑峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰面積比為縱坐標(biāo)作線性回歸,得回歸方程,見表1。

2.7 精密度考察 取對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,測得甲醇、乙醇、苯、吡啶與內(nèi)標(biāo)物正丙醇峰面積比的RSD分別為3.5%,2.0%,5.5%,1.8%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測得有機(jī)溶劑殘留量的環(huán)戊丙酸睪丸酮供試品約0.30 g,置于頂空瓶中,分別加入低、中、高濃度的對照品溶液200 μL,各3份,按上述色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜圖。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算溶劑濃度而得到回收率,結(jié)果見表2。

A.HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm);B.AT.SE-30(30 m×0.25 mm,0.25 μm);C.AT.OV-1301(30 m×0.32 mm,1 μm);D.AT. PEG-20M(30 m×0.32 mm,0.25 μm);E.DB-WAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm);1.甲醇;2.乙醇;3.苯;4.吡啶圖1 5種毛細(xì)管柱色譜圖A.HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm);B.AT.SE-30(30 m×0.25 mm,0.25 μm);C.AT.OV-1301(30 m×0.32 mm,1 μm);D.AT. PEG-20M(30 m×0.32 mm,0.25 μm);E.DB-WAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm);1.methanol;2.ethanol;3.benzene;4.pyridineinFig.1 Chromatograum of five kinds of capillary column

1.甲醇(2.698 min);2.乙醇(2.831 min);3.苯(2.918 min);4.正丙醇(3.379 min);5.吡啶(4.599 min)圖2 系統(tǒng)適用性測試1.methanol(2.698 min);2.ethanol(2.831 min);3.benzene (2.918 min);4.n-propanol(3.379 min);5.pyridinein(4.599 min)Fig.2 System suitability test

表1 4種溶劑回歸方程及線性Tab.1 Linear regression and range of four solutions

2.9 供試品的測定 精密稱取環(huán)戊丙酸睪丸酮約為0.30 g,置頂空瓶內(nèi),并加入正丙醇內(nèi)標(biāo)溶液200 μL,密封。按上述頂空色譜條件進(jìn)行測定,采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中各溶劑殘留量,結(jié)果甲醇、乙醇含量均遠(yuǎn)低于《中華人民共和國藥典》2010年版二部殘留溶劑限度(0.3%,0.5%),含量分別為29.6,20.2 μg·g-1,未檢出苯及吡啶,均符合ICH建議的限度。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)曾選擇不同極性及不同口徑的毛細(xì)管色譜柱,經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)采用DB-WAX柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm),可使幾種殘留溶劑色譜峰峰形對稱,分離度達(dá)到要求,同時(shí)能滿足檢測要求[3]。處理樣品時(shí)為了避免樣品分解,溫度設(shè)置不宜過高,參考文獻(xiàn)[4-6]并經(jīng)實(shí)驗(yàn),選擇初溫75℃,保留3 min,以30℃·min-1升至130℃,保留2 min。效果理想。

3.2 頂空樣品量的選擇 樣品量是指頂空樣品瓶中的樣品體積[7]。實(shí)驗(yàn)使用碳酸鈣固體模擬環(huán)戊丙酸睪丸酮樣品,考察基質(zhì)效應(yīng)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定碳酸鈣0.30 g時(shí),苯響應(yīng)值最大,且重復(fù)性好。

[1] 周海鈞,陳振聲,鄭竹蓮,等.藥品注冊的國際技術(shù)要求(質(zhì)量部分)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:79-100.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄61-附錄65.

[3] 劉虎威.氣相色譜方法及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007:141-148.

[4] 張宇,韓銳.氣相色譜法測定氨芐西林鈉舒巴坦鈉中殘留溶劑吡啶方法研究[J].黑龍江科技信息,2010,(5):209-209.

[5] 王英瑛,李俊.頂空氣相色譜法測定克林霉素磷酸酯中有機(jī)溶劑殘留量[J].中國藥業(yè),2009,18(14):41.

[6] 邢俊波,烏寧奇,曹紅,等.頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定麥志膠囊中有機(jī)溶劑殘留量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志, 2012,19(7):54-55.

[7] 張軍,車海先.淺議頂空氣相色譜[J].食品安全導(dǎo)刊, 2012,(5):48.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.027

Determination of Organic Solvent Residues in Testosterone Cypionate

JIANG Yi,CHEN Jing-jing,TIAN Feng,YANG Min
(College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo establish a headspace GC method for the determination of residual organic solvents in testosterone cypionate.MethodsThe residual organic solvents were determined by GC with DB-WAX capillary colum(30 m× 0.32 mm,0.25 μm)and FID detector at 230℃,using high purity nitrogen as the carrier gas by headspace sampling.The flow rate was 1.5 mL·min-1,the split ratio was 20∶1,the temperature of injection port was 220℃,the headspace heating temperature was 70℃,and the headspace balance time was 40 mins.The content of residues was calculated by using n-propanol as the internal standard.ResultsFour residual solvents were completely separated.There were good linearity for m-ethanol,ethanol,benzene and pyridinein in the ranges of 4.17-2.50×103μg·g-1(R=0.999 9),4.18-2.51×103μg·g-1(r=0.999 6),0.84-172 μg·g-1(r=0.998 1),and 2.95-1.77×103μg·g-1(r=0.999 9),respectively.The detection limit was 2.08,1.23,0.28,and 0.87 μg·g-1,respectively.The average recovery of methanol,ethanol,benzene and pyridinein was 102.2%(RSD=4.0%),99.6% (RSD=1.9%),112.6(RSD=5.6%),and 98.9%(RSD=1.6%),respectively.ConclusionThis method is reliable,sensitive, accurate and can be used for the determination of residual organic solvents in testosterone cypionate.

Testosterone cypionate;Residual organic solvents;Head-space capillary gas chromatography

R977.1;R927.2

A

1004-0781(2014)11-1499-03

2013-11-15

2013-12-20

蔣燚(1988-),女,湖北武漢人,在讀碩士,研究方向:藥物分析方法的研究與設(shè)計(jì)。E-maiI:jyjy0616@163. com。

楊敏(1963-),男,湖北武漢人,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:藥物分析分析方法的研究與設(shè)計(jì)。E-mail:yimufu@263.net。