付海根，唐 勝，李迎紅，宋丹青，汪燕翔

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)藥生物技術研究所，北京 100050)

·研究論文·

新型12-N-取代苦參酸衍生物的合成及其抗結核活性*

付海根，唐 勝，李迎紅，宋丹青，汪燕翔

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)藥生物技術研究所，北京 100050)

以苦參堿為起始原料，經(jīng)水解開環(huán)，羧基保護制得中間體苦參酸甲酯(3)；3與烷基溴或取代酰氯分別經(jīng)烷基化反應、?；磻突酋；磻?2-N原子上引入不同結構類型的基團制得新化合物——12-N-取代基苦參丁甲酯(5a～5d)；5再經(jīng)酯水解或LiALH4還原反應合成了一系列新型的12-N-取代基苦參酸或12-N-取代基苦參酸丁醇，其結構經(jīng)1H NMR，13C NMR和HR-ESI-MS表征。初步的體外生物活性測試結果表明，12-N-正十二烷基苦參丁甲酯具有較佳的抗結核活性，對敏感結核菌株H37Rv的MIC為8.0μg·mL-1。

苦參堿；12-N-取代基苦參酸;合成；抗結核活性;構效關系

目前,現(xiàn)有的抗結核藥物有效性的降低以及長期治療導致患者依從性較差，同時往往會導致多藥耐藥和廣泛抗藥性發(fā)生。新發(fā)肺結核病例的出現(xiàn)，多藥耐藥結核分枝桿菌感染發(fā)生率的增加，一線抗結核藥物異煙肼和利福平的不良反應[1-2]，以及與結核病相關的HIV感染[3-4]發(fā)病率升高，導致科研人員重新將目光投向新抗結核藥物的發(fā)現(xiàn)上。尤其是多藥耐藥結核桿菌以及幾乎無藥可治的廣泛耐藥結核桿菌的出現(xiàn)，加速了新化學實體的開發(fā)和用藥策略的創(chuàng)新，以應對日趨嚴重的結核感染[5-6]。然而，除了結構修飾的藥物，自20世紀60年代尚未開發(fā)出真正全新母核的抗結核藥物。雖然新的抗結核藥物Bedaquiline去年剛剛通過美國FDA批準[7]，但是對于與目前使用的抗結核藥物無交叉耐藥的新結構骨架的化學實體仍然需求迫切。

在長期尋找新結構骨架的抗結核藥物研究中，本課題組對自制的大量不同結構骨架化合物庫進行了體外抗結核活性篩選，發(fā)現(xiàn)苦參酸類化合物——12-N-芐基苦參酸(Ⅰ，Chart 1)對敏感結核菌株H37Rv的MIC值為128μg·mL-1，顯示出一定的結核桿菌抑制活性。鑒于此類化合物具有較好的柔性結構、溶解度高、結構修飾潛力等特點，對其進行深入的構效關系研究，有望尋找到全新結構骨架的抗結核候選物。

為此，本研究選擇Ⅰ為先導化合物，一方面在12-N上引入正丁基、正辛基、正十二烷基、芳香基團等疏水基團來增大化合物的ClogP值，以此來增加化合物的抗結核活性[8]；另一方面，在11-位合成相應的丁酸、丁醇以及丁酯側鏈衍生物，進一步探討此類化合物的抗結核構效關系，以期尋找到全新結構骨架、治療指數(shù)高、與現(xiàn)有藥物不存在交叉耐藥的全新抗結核化合物。

通過逆合成分析，本文以苦參堿(1)為起始原料，在堿性條件下水解內(nèi)酰胺鍵，將其D環(huán)打開，制得裸露出12-N原子和11-位丁酸側鏈羧基兩個把手基團的苦參酸(2)；先將2側鏈的羧基轉化成酯進行保護之后，再通過分別在12-N原子上引入不同結構類型的基團(鹵代烷、取代酰基、取代磺?；?制得新化合物——12-N-取代基苦參丁甲酯(5a～5d)；將5b的酯水解合成了新型的12-N-取代基苦參酸甲酯(6b)；將5a,5b和5d酯用LiAlH4還原成伯醇，合成了一系列新型的12-N-取代基苦參酸丁醇(7a,7b和7d)(Scheme 1)，其結構經(jīng)1H NMR，13C NMR和HR-ESI-MS表征。并對5～7的抗結核菌株H37Rv的活性進行了初步的研究。通過5～7對H37Rv的MIC值，研究其構效關系。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Varian Inova 400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標)；Autospec Ultima-TOF型質譜儀。

4a～4d及四氫鋁鋰等均為分析純；結核分枝桿菌標準株H37Rv，本課題組保存菌株；培養(yǎng)基，改良米氏7H9液體培養(yǎng)基(自配)。

1．2 合成

(1)苦參酸甲酯(3)的合成[9]

在反應瓶中加入120g和5mol·L-1NaOH溶液100mL，攪拌下回流使其溶解;回流反應2h。緩慢傾入燒杯中，自然冷卻至室溫，析出白色固體，過濾,濾餅緩慢加入6mol·mL-1鹽酸(60mL),攪拌使其溶解。蒸干水得中間體2；加入甲醇100mL，攪拌使其溶解；過濾，濾液回流反應4h。蒸干溶劑得白色固體324g(無需純化，直接用于后續(xù)反應)。

(2)5a～5d的合成(以5a為例)

在反應瓶中加入32.4g(8.57mmol)和乙腈20mL，攪拌使其溶解;依次加入K2CO33.34g和正溴丁烷(4a)，于室溫反應18h。過濾，濾液蒸干溶劑，殘留物加入乙酸乙酯250mL和水250mL,攪拌使其溶解；分液，有機層用飽和食鹽水(3×50mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，蒸干溶劑得油狀粗品,經(jīng)COMBIFLASH快速柱色譜[洗脫劑：A=V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶1]純化得棕色固體5a。

用類似的方法合成棕色固體5b～5d(其中5d用CH2Cl2為溶劑)。

12-N-正丁基苦參丁甲酯(5a)：產(chǎn)率52%;1H NMRδ：4.10(t,J=10.1Hz,1H),3.89～3.84(m,1H),3.61(d,J=8.0Hz,1H),3.48～3.14(m,9H),3.13～3.01(m,1H),2.92～2.89(m,2H),2.78(d,J=8.0Hz,1H),2.44～2.22(m,3H),1.94～1.84(m,2H),1.69～1.58(m,9H),1.50～1.40(m,1H),1.39～1.25(m,2H),0.92(t,J=7.3Hz,3H);13C NMRδ：174.74,60.76,58.26(2),54.70(2),52.70,50.08,35.72,33.12,30.83,26.45,24.78,24.41,23.95,20.08(2),19.76,18.36,14.04;HR-ESI-MSm/z：Calcd for C20H36N2O2{[M+H]+}337.28495,found 337.28480。

12-N-正辛基苦參丁甲酯(5b)：產(chǎn)率35%;1H NMRδ：3.61(s,3H),3.54～3.21(m,6H),3.06～3.02(m,2H),2.78～2.70(m,2H),2.44～2.27(m,2H),2.19(t,J=7.4Hz,1H),2.10～2.02(m,2H),1.96～1.79(m,2H),1.66(s,4H),1.61～1.43(m,5H),1.40(s,3H),1.34～1.21(m,9H),0.93～0.82(m,3H);13C NMRδ：174.91,61.80,60.26,58.84(2),56.52,51.69,50.08,34.15,33.10,31.69,31.61,29.04(2),28.97,28.86,26.80,24.97,22.52,22.50,20.38(2),19.08,14.38;HR-ESI-MSm/z：Calcd for C24H44N2O2{[M+H]+}393.34756,found 393.34744。

12-N-正十二烷基苦參丁甲酯(5c)：產(chǎn)率36%;1H NMRδ：3.77～3.66(m,1H),3.60(s,3H),3.51～3.17(m,3H),2.92(t,J=12.5Hz,1H),2.81～2.62(m,2H),2.34(s,1H),2.25～2.10(m,2H),2.04～1.96(m,1H),1.89～1.81(m,2H),1.75～1.64(m,1H),1.63～1.39(m,8H),1.41～1.15(m,24H),0.86(t,J=7.3Hz,3H);13C NMRδ：174.97,63.64,7.15(2),57.05,56.91,53.08,51.60,35.56,34.20,33.71,32.94,31.76,29.47,29.38,29.22,29.17,29.02,28.00,27.26,26.86,26.51,24.99,22.56,20.95,20.70,18.98,14.41;HR-SEI-MSm/z：Calcd for C28H52N2O2{[M+H]+}449.41016，found 449.41013。

12-N-對三氟甲基苯胺羰甲基苦參丁甲酯(5d)：產(chǎn)率26%;1H NMRδ：9.90(s,1H),8.57(d,J=8.6Hz,1H),7.48～7.39(m,1H),7.25(d,J=8.6Hz,1H),3.94(s,3H),3.55～3.50(m,1H),3.44～3.42(m,1H),3.27～3.20(m,3H),3.07～3.03(m,1H),2.98～2.82(m,2H),2.55～2.53(m,1H),2.31～2.16(m,3H),1.89～1.86(m,3H),1.80～1.69(m,2H),1.61～1.42(m,10H);13C NMRδ：174.88,169.97,51.25,128.07,126.24,23.55,121.57,121.25,115.30,111.63,63.63,57.02,55.08,54.32,54.06,51.46,36.00,33.65,30.94,27.63,25.34,24.73,19.57,19.03,18.81;HR-ESI-MSm/z：Calcd for C25H34N3O3F3{[M+H]+}481.25521,found 481.25487。

(3)12-N-正辛基苦參丁酸(6b)的合成

在反應瓶中加入5b0.39g(1mmol)和2mol·mL-1NaOH溶液20mL,攪拌下回流反應2h。用1mol·mL-1鹽酸調至pH 1～2,析出固體，過濾，濾餅干燥得棕色固體6b，產(chǎn)率67%;1H NMRδ：12.05(s,1H),4.44～4.39(m,1H),4.07(t,J=10.0Hz,1H),3.94～3.84(m,1H),3.57(d,J=10.0Hz,1H),3.37～3.10(m,1H),3.06～2.80(m,4H),2.72(d,J=10.5Hz,1H),2.35(d,J=10.5Hz,1H),1.90～1.80(m,3H),1.79～1.58(m,8H),1.54～1.40(m,3H),1.36～1.28(m,13H),0.88(t,J=7.3Hz,3H);13C NMRδ：175.39,60.74,60.50,58.56(2),54.69,53.13,35.91,32.27,31.66,31.62,30.90,29.06,28.95,26.91,26.71,24.43,24.14,22.85,22.53,21.00,18.38,14.43;HR-SEI-MSm/z：Calcd for C23H42N2O2{[M+H]+}379.36829，found 379.3680。

(4)7a,7b和7d的合成(以7a為例)

在反應瓶中加入5a0.67g(2mmol)和無水THF 20mL，冰水浴冷卻，攪拌下加入LiAlH491mg(1.2當量)，于室溫反應30min；滴加20%NaOH溶液5mL淬滅反應。過濾，濾液蒸干溶劑得油狀粗品，經(jīng)中壓制備色譜(洗脫劑：A=5∶1)純化得7a。

用類似的方法合成7b和7d。

12-N-正丁基苦參丁醇(7a)：白色固體，產(chǎn)率30%;1H NMRδ：4.07(t,J=10.5Hz,1H),3.99～3.83(m,1H),3.31～3.21(m,5H),3.08～2.83(m,4H),2.71(d,J=10.5Hz,1H),2.35(d,J=10.5Hz,1H),1.80～1.63(m,13H),1.45～1.42(m,3H),1.42～1.26(m,4H),0.93(t,J=7.3Hz,3H);13C NMRδ：60.74,60.48,58.56(2),54.69,52.94,50.11,38.81,35.89,32.25,30.93,26.84,24.85,24.44,24.14,20.89,20.09,18.38,14.02;HR-ESI-MSm/z：Calcd for C19H36N2O{[M+H]+}309.29004,found 309.28980。

12-N-正辛基苦參丁醇(7b)：棕色固體，產(chǎn)率47%;1H NMRδ：4.07(t,J=10.5Hz,1H),3.94～3.78(m,1H),3.78～3.48(m,6H),3.31～3.21(m,4H),3.06～2.81(m,3H),2.71(d,J=10.0Hz,1H),2.35(d,J=10.0Hz,1H),1.70～1.63(m,11H),1.51～1.45(m,3H),1.40～1.19(m,10H),0.88(t,J=7.3Hz,3H);13C NMRδ：60.74,60.50,58.55(2),54.69,53.14,50.06,35.91,32.27,31.66,30.92,29.06(2),28.95,26.89,26.71,24.43,24.14,22.85,22.54,20.96,18.37,14.43;HR-ESI-MSm/z：Calcd for C23H44N2O{[M+H]+}365.35264，found 365.35254。

12-N-對三氟甲基苯胺羰甲基苦參丁醇(7d)：棕色固體，產(chǎn)率62%;1H NMRδ：10.08(s,1H),8.44(d,J=8.6Hz,1H),7.56～7.46(m,1H),7.30(d,J=8.6Hz,1H),4.63～4.59(m,1H),4.32～4.16(m,2H),4.13～4.04(m,1H),3.61～3.50(m,2H),3.28～3.24(m,2H),3.02～2.91(m,2H),2.58(d,J=11.2Hz,1H),2.44(d,J=11.2Hz,1H),1.95～1.60(m,12H),1.50～1.30(m,6H);13C NMRδ：164.46,152.82,127.25(2),126.19,118.92(2),61.18,60.69,60.43,56.76,54.69,54.62,52.29,36.57,32.28,30.71,29.66,29.22,24.32,24.08,23.71,18.44,18.32;HR-ESI-MSm/z：Calcd for C24H34N3O2F3{[M+H]+}454.26759,found 454.26786。

1．3 體外抗結核活性測定

無菌48孔板(本室研制結核菌快速藥敏專用微量培養(yǎng)板)按藥敏試驗設計要求，各孔分別加入用2倍濃度培養(yǎng)基稀釋的藥物。各化合物制成適當濃度的的初溶液，用培養(yǎng)基稀釋成各所用化合物的二倍濃度，每種化合物各10個梯度，加入48孔板每孔100μL。試驗藥終濃度分別為(128.0，64.0，32.0，16.0，8.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625)μg·mL-1。對照藥異煙肼和利福平的終濃度分別為(32.0,16.0,8.0,4.0，2.0，1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.032)μg·mL-1。結核分枝桿菌H37Rv，每孔接種100μL，每孔菌量為4×10-3mg。設2個不含抗菌藥的生長陽性對照孔和兩個以蒸餾水替代培養(yǎng)基的生長陰性對照孔，將48孔板加蓋后周圍用透明膠帶密封，置于濕盒37℃孵育。第3d后觀察陽性生長對照孔和陰性生長對照孔，觀察到兩者有明確差別時，對各個試驗孔細菌生長的數(shù)量和形態(tài)進行觀察，判定抑制記錄結果，第7d后再觀察記錄一次進行確認。

2 結果與討論

2．1 體外抗結核活性

使用分枝桿菌微量直觀快速藥敏試驗法，對5～7進行體外抗結核活性評價，結果見表1。從表1可見：

(1)維持11-位丁酸甲酯側鏈不變，通過RX對12-位N進行修飾后發(fā)現(xiàn)：當取代基為烷基長鏈的衍生物(5a～5c)的抗結核活性均優(yōu)于先導化合物Ⅰ；當12-位為正十二烷取代的衍生物(5c)抑制活性為8μg·mL-1，顯示出較強的抗結核活性；而當12-位為取代芳?；鶊F時的衍生物(5d)對H37Rv的抑制活性為32μg·mL-1，活性略優(yōu)于先導物Ⅰ。

(2)將11-位丁酸甲酯側鏈水解為丁酸或還原為丁醇，6和7的抑制活性為(32～128)μg·mL-1，僅表現(xiàn)出中度的體外抗結核活性。

表1 化合物的抗結核活性Table 1 Antitubercular activities of compounds

(3)對于同系列的N-取代苦參丁酸，N-取代苦參丁醇，N-取代苦參丁酯，12-位側鏈脂溶性(ClogP)的增大有利于活性的提高。

3 結論

以苦參堿為起始原料，以Ⅰ為先導物，在母核苦參酸上兩個引入“把手”基團進行結構修飾和改造，設計并合成了10個結構全新的12-N-取代苦參酸衍生物(5～7)。初步構效關系表明：11-位丁酸甲酯側鏈有助于抗結核活性的保持，酸基和醇羥基不是活性必須基團；12-位引入適當?shù)氖杷鶊F有利于抗結核活性的提高。12-N-正十二烷基苦參丁甲酯表現(xiàn)出較強的抗結核活性(MIC 8.0μg·mL-1)，可作為候選物進一步開展其初步藥代動力學以及安全性等成藥性研究；也可作為探針化合物進一步探索其抗結核作用機制。

本研究結果為N-取代苦參酸衍生物的進一步抗結核活性研究提供了重要的科學依據(jù)，并可將本研究中使用的修飾策略應用于其他抗結核衍生物的設計與合成中。

本文采用的方法簡便易行，原料易得，反應條件溫和，后處理相對簡便，具有較高的可行性。

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SynthesisandAntitubercularActivitiesofNovel12-N-substitutedMatrinicAcidDerivatives

FU Hai-gen,TANG Sheng,LI Ying-hong,SONG Dan-qing,WANG Yan-xiang

(Institute of Medicinal Biotechnology,China Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

A intermediate,methyl matrinate(3),was prepared by hydrolytic loop-open and carboxyl protection from matrine.Five novel methyl 12-N-substituted matrinate(5a～5d)were synthesized by alkylation(or acylation or sulfonyl)of 3with alkylbramides or substituted-acylchloride． A series of novel structural nucleus——12-N-substituted matrinic acid derivatives were synthesized by hydrolysis or reduction of esters of 5． The structures were characterized by1H NMR，13C NMR and HR-ESI-MS.Primary against Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv activity tests indicated that methyl-12-N-dodecyl-matrinate exhibited a potent anti-mycobacterial activity with MIC value of 8.0μg·mL-1.

matrine；12-N-substituted matrinic acid;synthesis;antitubercular;structure-activity relationship

2014-06-26

“ 十二五重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項資助項目(2012ZX09301002-001-017)

付海根(1990-)，男，漢族，江西吉安人，碩士研究生，主要從事藥物合成的研究。Tel.010-63015284，E-mail：fuhaigen@hotmail.com

汪燕翔，博士，副研究員，Tel． 010-63015284，E-mail：lionking_0421@hotmail.com

O621．3；R914．5

A

1005-1511(2015)01-0739-05