趙偉鵬 李 波 黃金昶

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

·研究報(bào)告·

加味烏梅丸誘導(dǎo)胰腺癌sw1990細(xì)胞NOD-SCID小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

趙偉鵬1李 波1黃金昶2△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

目的觀察加味烏梅丸在體內(nèi)誘導(dǎo)移植性人胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用。方法將20只荷瘤小鼠分為對(duì)照組、用藥組各10只。NOD/SCID小鼠皮下移植瘤造模成功后，用藥組每日灌胃加味烏梅丸生藥0.4 g/0.4 mL，對(duì)照組每日給予無菌注射用水0.4 mL。給藥期間每5日測(cè)量并計(jì)算皮下移植瘤體積，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。20 d后處死小鼠，稱取瘤質(zhì)量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率，TUNEL染色標(biāo)記細(xì)胞凋亡，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果用藥組移植瘤的體積的增長(zhǎng)幅度明顯小于對(duì)照組（P＜0.05）。加味烏梅丸對(duì)NOD/SCID小鼠移植性人胰腺癌瘤抑瘤率為22%，流式細(xì)胞分析用藥組的早期凋亡率為（29.6833±0.76）%，與對(duì)照組（17.0167± 2.75）%相比，明顯提高（P＜0.01），TUNEL法檢測(cè)用藥組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)（A1）為（59.4±19.3）%，與對(duì)照組的（19.2±7.4）%比較明顯提高（P＜0.01）。結(jié)論加味烏梅丸可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

烏梅丸 胰腺癌 細(xì)胞凋亡

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，近年來發(fā)病率和死亡率明顯上升。5年生存率＜1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。2010年美國一項(xiàng)調(diào)查研究顯示胰腺癌已是癌癥發(fā)病率第10位，死因第4位［1］，2006年發(fā)病率與死亡率均為第6位［2］。2012年最新數(shù)據(jù)表明，胰腺癌已是上海第5大腫瘤死因。其確診時(shí)多屬晚期，大多失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而常規(guī)放化療療效欠佳。黃金昶教授及其研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用加味烏梅丸治療胰腺癌近20年，效果理想。通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制腫瘤是中醫(yī)藥治療腫瘤的一個(gè)非常重要的途徑。本研究旨在探討在動(dòng)物體內(nèi)加味烏梅丸對(duì)荷瘤裸鼠胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)NOD/SCID小鼠，雄性，3～4周齡，體質(zhì)量（20±2）g，共20只，購自維通利華。購回后在中日友好醫(yī)院臨床研究所SPF級(jí)動(dòng)物室普食飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞株sw1990購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤細(xì)胞庫，復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。加味烏梅丸藥物組成：烏梅50 g，當(dāng)歸20 g，細(xì)辛3 g，川椒6 g，桂枝10 g，黃連3 g，黃柏10 g，黨參10 g，干姜10 g，制附片10 g，白芍30 g，生黃芪30 g，壁虎30 g，炒枳殼10 g，木香10 g等。中藥飲品購自北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心，由中日友好醫(yī)院藥學(xué)部制備，常規(guī)水煎，水浴濃縮至生藥含量為4.0 g/mL，4℃保存?zhèn)溆?。TUNEL熒光標(biāo)記試劑盒購自美國羅氏公司。流式細(xì)胞儀：BD FACSCantoⅡ。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自BD公司。

1.3 造模與分組 NOD/SCID小鼠移植瘤模型建立：人胰腺癌sw1990細(xì)胞株在含10%小牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5×107/mL細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取0.1 mL接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，在SPF環(huán)境飼養(yǎng)下觀察。成瘤率=瘤體積直徑大于5 mm的小鼠數(shù)/該實(shí)驗(yàn)組的小鼠數(shù)×100%。等到小鼠移植瘤皮下可觸及，腫瘤直徑長(zhǎng)到0.5 cm時(shí)，將荷瘤鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和用藥組各10只。分組后用藥組每日灌胃生藥0.4 g/0.4 mL。對(duì)照組每日給予無菌注射用水0.4 mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 （1）瘤徑測(cè)量。分組后，每5日測(cè)量瘤徑1次，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量其最長(zhǎng)徑及其垂直徑，計(jì)算腫瘤體積，公式為V=1/2ab2，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖。（2）瘤質(zhì)量測(cè)量。給藥20 d后處死小鼠，剝離瘤體，測(cè)量瘤塊質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（對(duì)照組瘤質(zhì)量-治療組瘤質(zhì)量）/對(duì)照組瘤質(zhì)量×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 （1）取材將腫瘤組織置入RPMI1640培養(yǎng)液中，反復(fù)漂洗，沖凈，剪成1～2 mm3小塊，研磨，400目尼龍膜過濾，離心去上清，用10%小牛血清的PBS懸浮，移入EP管，加無水乙醇，離心細(xì)胞棄上清，PBS重懸細(xì)胞，再離心1次棄上清。（2）用預(yù)冷的1 mL PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)（細(xì)胞數(shù)量不少于105），1000 g，4℃離心5 min。收集細(xì)胞。（3）加入400 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞。（4）加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。（5）加入10 μL PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min。（6）在30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.6 TUNEL染色 （1）用二甲苯浸洗2次，每次5 min。（2）用梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3 min。（3）用Proteinase K工作液處理組織15～30 min在37℃8 min；（4）PBS漂洗2次。（5）制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 μL TdT+450 μL標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50 μL標(biāo)記的dUTP液，陽性對(duì)照組先加入100 μL DNase 1，反應(yīng)在15～25℃×10 min，后面步驟同處理組。（6）玻片干后，加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液 （陰性對(duì)照組僅加50 μL標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1 h。（7）PBS漂洗3次。（8）玻片干后加50 μL converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30 min。（9）PBS漂洗3次。（10）在組織處加50～100 μL DAB底物，反應(yīng)15～25℃× 10 min。（11）PBS漂洗3次。（12）拍照后再用蘇木素復(fù)染，分化，自來水返藍(lán)。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.7 采集圖象及圖像分析 著色表達(dá)于細(xì)胞胞核，鏡下（×100）下拍攝3個(gè)視野，將采集的圖像應(yīng)用Imagepro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，判斷標(biāo)準(zhǔn)［3］分布，胞核或胞核和胞質(zhì)同時(shí)呈棕黃色，呈典型凋亡形態(tài)特征。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。采用t檢驗(yàn)比較各指標(biāo)差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 移植瘤造模成功 于NOD/SCID小鼠右側(cè)腋窩皮下注射sw1990細(xì)胞后約1周，可觸及皮下移植瘤形成，成瘤率100%。

2.2 腫瘤生長(zhǎng)曲線 待瘤結(jié)節(jié)形成后，測(cè)量并計(jì)算瘤體積，繪制生長(zhǎng)曲線圖，移植瘤的生長(zhǎng)曲線（圖1）表明，對(duì)照組及用藥組移植瘤的體積隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，但用藥組移植瘤的體積的增長(zhǎng)幅度明顯小于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖1 移植瘤生長(zhǎng)曲線圖

2.3 瘤質(zhì)量測(cè)量及抑瘤率 灌胃給藥20 d后，麻醉脫頸處死小鼠，取下移植瘤，剔除局部壞死組織，用分析天平進(jìn)行稱重。兩組移植瘤質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與移植瘤體積相一致，計(jì)算抑瘤率為22%。

組 別 樣本數(shù) 瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）對(duì)照組 1 0 0 . 9 7 ± 0 . 1 4 3用藥組 1 0 0 . 7 6 ± 0 . 1 8 3 2 2 %

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果 用藥組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與瘤質(zhì)量結(jié)果相一致。

組 別 樣本數(shù) 各組早期凋亡率（%）對(duì)照組 1 0 1 7 . 0 1 6 7 ± 2 . 7 4 6 9 4用藥組 1 0 2 9 . 6 8 3 3 ± 0 . 7 6 2 6 7

2.5 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用藥組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），與瘤質(zhì)量結(jié)果相一致。見圖2，圖3。

組 別 樣本數(shù) 各組凋亡指數(shù)（%）對(duì)照組 1 0 1 9．2 ± 7 . 4用藥組 1 0 5 9 . 4 ± 1 9 . 3

圖1 對(duì)照組TUNEL染色圖片示凋亡細(xì)胞較少（×100）

圖2 用藥組見較多核染色呈深淺不一棕褐色的凋亡細(xì)胞（×100）

3 討 論

加味烏梅丸為黃金昶教授治療胰腺癌的常用方，臨床觀察發(fā)現(xiàn)服藥后能很快改善患者的臨床癥狀，尤其對(duì)患者的疼痛、食欲下降改善較明顯，使不能行放、化療的胰腺癌患者臨床獲益，生存期得到延長(zhǎng)［4］，對(duì)本病中醫(yī)可以從厥陰病論治，因厥陰病的提綱證和胰腺癌的常見癥狀極其相符?！秱摗け尕赎幉∶}證并治》提綱為“厥陰之為病，消渴，氣上撞心，心中疼熱，饑而不欲食，食則吐蚘。下之利不止”。而胰腺癌患者的常見癥狀則為上腹痛、上腹飽脹不適、食欲差、消瘦、乏力、腹瀉或便秘，其中上腹飽脹不適、腹痛、食欲下降均符合厥陰病的臨床表現(xiàn)。故在清上溫下烏梅丸的基礎(chǔ)上加用白芍，與當(dāng)歸合用補(bǔ)肝體，助肝用，且引藥入肝經(jīng)，加用生黃芪補(bǔ)一身之氣，加用枳殼、木香理氣止腹痛，加用壁虎祛風(fēng)、軟堅(jiān)散結(jié)，且現(xiàn)代藥理研究證實(shí)壁虎對(duì)多系統(tǒng)腫瘤均有明顯的抑制作用［5］。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是許多抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的重要機(jī)制。1992年英國科學(xué)家Hickman JA［6］誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可作為腫瘤治療研究中的主要目標(biāo)和手段，不但許多化療藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤，許多中藥提取物復(fù)方也可提高腫瘤細(xì)胞凋亡率［7-8］。本研究在臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞水平證實(shí)加味烏梅丸可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制胰腺癌。腫瘤生長(zhǎng)曲線及瘤重測(cè)量表明加味烏梅丸可抑制胰腺癌腫瘤生長(zhǎng)，用藥組移植瘤的體積的增長(zhǎng)幅度明顯小于對(duì)照組，瘤重測(cè)量顯示，用藥組瘤重明顯小于對(duì)照組，抑瘤率為22%。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，用藥組與對(duì)照組早期凋亡率有顯著差異，用藥組明顯高于對(duì)照組，這與腫瘤生長(zhǎng)曲線及瘤重測(cè)量結(jié)果相一致。早期凋亡啟動(dòng)了凋亡機(jī)制（包括線粒體膜電勢(shì)的降低，細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升等等現(xiàn)象），相對(duì)于晚期凋亡，它更有說服力。細(xì)胞凋亡起動(dòng)之初，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，可與Annexin-V熒光素標(biāo)記物特異結(jié)合，并通過流式細(xì)胞檢測(cè)分析識(shí)別早期凋亡細(xì)胞。而細(xì)胞壞死時(shí)也會(huì)發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻，故合并使用鑒定細(xì)胞死活的核酸染料PI，即Annexin V-FITC/PI雙染，借以區(qū)別凋亡細(xì)胞與死亡細(xì)胞。而TUNEL法可以檢測(cè)各期的凋亡細(xì)胞，特異性和敏感性較高，且結(jié)合凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征加以判別，本實(shí)驗(yàn)中用藥組凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組且出現(xiàn)大量典型的凋亡小體，排除了壞死灶，其結(jié)果與流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)了加味烏梅丸通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤。

本研究?jī)H從細(xì)胞學(xué)角度證實(shí)加味烏梅丸通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制胰腺癌。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制有許多種，例如阻滯腫瘤細(xì)胞的增殖周期，影響細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控癌基因和抑癌基因的表達(dá)，而尋找與加味烏梅丸誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)的調(diào)控基因?qū)⑹俏覀兿乱徊降难芯恐攸c(diǎn)。

［1］ Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

［2］ 張思維，雷正龍，李光琳，等.中國腫瘤登記地區(qū)2006年腫瘤發(fā)病和死亡資料分析［J］.中國腫瘤，2010，19（6）：1-5.

［3］ 孫振綱，陳孝平，黃志勇，等.肝動(dòng)脈灌注碘油羥基磷灰石納米粒對(duì)兔VX2肝腫瘤細(xì)胞凋亡、增生及血管形成的影響［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87（6）：411-412.

［4］ 黃金昶，徐林.加味烏梅丸治療胰腺癌21例療效觀察［J］.中國臨床醫(yī)生，2012，40（11）：52-55.

［5］ 劉菲，王建剛，席守民，等.中藥壁虎抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（4）：957-959.

［6］ Hickman JA.Apoptosis induced by anticancer drugs［J］.Cancer Metastasis Rev，1992，11（2）：121-139.

［7］ Li QQ，Lee RX，Liang H，et al.Anticancer activity ofβ-elemene and its synthetic analogs in human malignant brain tumor cells［J］.Anticancer Res，2013，33（1）：65.

［8］ 趙愛光，楊金坤.四君子湯誘導(dǎo)裸小鼠移植性人胃癌細(xì)胞凋亡的初步研究［J］.癌癥，2001，20（2）：164-167.

Apoptosis Induced by Wumei Pill in Pancreatic Cancer Cell sw1990 in NOD/SCID Mice

ZHAO Weipeng，LIBo，HUANG Jinchang.Beijing University of TCM，Beijing 100029，China

Objective:To study the effect of Wumei pill on the apoptosis of xenografts of human pancreatic cancer cell sw1990 in NOD/SCID mice.Method:20 tumor-bearing mice were randomly divided into control group and Wumei pill group.After the murine model of human pancreatic carcinoma was established，mice in two groups received either Wumei pill decoction 0.4 g/0.4 mL/d or sterile water 0.4 mL/d for 20 days.Measurement and calculation of tumor volume in mice performed every 5 days during the 20 days.At the same time，the tumor growth curve was drawn.After treatment of 20 days，the mice were executed.The weight of tumor was evaluated. The apoptotic rates were examined by FCM and given TUNEL labeling.Morphological changes were observed by microscopy.Results:The increase of xenograft tumor volume in Wumei pill group was less than that in control group.Compared with the control group，tumor growth was significantly inhibited by Wumei pill（22%）.Apoptotic index（A1）were significantly higher（29.6833±0.76）%determined by FACScan and（59.4 19.3）%by TUNEL in Wumei pill treatment group than those in the control group［FACScan（17.0167±2.75）%TUNEL（19.2 7.4）%］.Conclusions:Wumei pill can inhibit pancreatic cancer by inducing pancreatic tumor cell apoptosis.

Wumei Pill；Pancreatic cancer；Apoptosis

R285

A

1004-745X（2015）02-0194-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.02.003

2014-09-20）

北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重大項(xiàng)目（No.D131100002213004）

△通信作者（電子郵箱：zhaoweipeng1118@163.com）